Name: tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas
Uploaded: 2019-09-13T13:30:00
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Este trabajo fue apoyado por la beca AG-NS-0843-11 de Ellison Medical Foundation y la Beca Piloto NIH dentro de la Subvención de Apoyo del Centro OnCI para el Cáncer P30CA030199 a A.S.

La vivienda, el tratamiento y el sacrificio de ratones se realizaron siguiendo el protocolo IACUC aprobado del Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute.
1. Preparación de reactivos
<ol><li>Preparar 100 ml de medios de aislamiento celular: Medio F10 complementado con 10% de suero de caballo (HS).</li>
	<li>Preparar 50 ml de solución de colagenasa tipo II: disolver 1 g de polvo de colagenasa tipo II en 50 ml de medios de aislamiento celular (tenga en cuenta las unidades de la enzim...

<ol>
	<li>Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+resistance+to+cancer+therapies.">Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).</li><li>Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+an+old+idea--a+paradigm+shift.">Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift.</a> Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+overlapping+sarcoma+subtypes+initiated+from+muscle+stem+and+progenitor+cells.">Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells.</a> Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).</li><li>Rubin, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+unanticipated+relationship+between+undifferentiated+pleomorphic+sarcoma+and+embryonal+rhabdomyosarcoma.">Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).</li><li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+rhabdomyosarcomas+in+conditional+Pax3:Fkhr+mice:+cooperativity.">Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity.</a> of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes &amp; Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).</li><li>Tremblay, A. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Drives+Fusion-Negative+Rhabdomyosarcoma+Initiated+From+Non-myogenic+Endothelial+Progenitors.">Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors.</a> Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).</li><li>Almazan-Moga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Inhibition+Hampers+Sphere+and+Holoclone+Formation+in+Rhabdomyosarcoma.">Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma.</a> Stem Cells International. , (2017).</li><li>Walter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+positive+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population+is+enriched+in+rhabdospheres.">CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li><li>Ciccarelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+MEK/ERK+pathway+in+sustaining+tumorigenicity+and+in+vitro+radioresistance+of+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population.">Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population.</a> Molecular Cancer. 15, (2016).</li><li>Deel, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcriptional+Coactivator+TAZ+Is+a+Potent+Mediator+of+Alveolar+Rhabdomyosarcoma+Tumorigenesis.">The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis.</a> Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).</li><li>Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Stem+Cells+Give+Rise+to+Rhabdomyosarcomas+in+a+Severe+Mouse+Model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).</li><li>Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+mdx+mice+display+a+reduced+life+span+and+are+susceptible+to+spontaneous+rhabdomyosarcoma.">Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma.</a> The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).</li><li>Kessel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+3D+Tumor+Spheroid+Screening+Method+for+Cancer+Drug+Discovery+Using+Celigo+Image+Cytometry.">High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry.</a> SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).</li><li>Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Tumorsphere+Formation+Assays.">In vitro Tumorsphere Formation Assays.</a> Bio-Protocol. 3 (3), (2013).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+tumorsphere+culture+system+for+the+efficient+and+low-cost+enrichment+of+cancer+stem+cells+with+natural+polymers.">A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers.</a> Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).</li><li>Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+molecular+pathways+of+FLT3+in+the+pathogenesis+of+acute+myeloid+leukemia:+biology+and+therapeutic+implications.">Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications.</a> Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).</li><li>Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+is+required+for+Flt3L-dependent+dendritic+cell+differentiation.">STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation.</a> Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).</li><li>Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+melphalan+on+mouse+myeloma+(adj.+PC-5)+and+hemopoietic+stem+cells.">Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells.</a> Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).</li><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells.">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197 (4302), 461-463 (1977).</li><li>Hamburger, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+tumor+clonogenic+assay+as+a+model+system+in+cell+biology.">The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology.</a> The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).</li><li>Jimenez-Hernandez, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRP1-positive+lung+cancer+cells+possess+tumor-initiating+properties.">NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties.</a> Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+(3D)+models+in+cancer+research:+an+update.">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Salerno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphere-forming+cell+subsets+with+cancer+stem+cell+properties+in+human+musculoskeletal+sarcomas.">Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas.</a> International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).</li></ol>

Se han empleado múltiples métodos para el aislamiento y caracterización de los TPC de las poblaciones de células heterogéneas tumorales: ensayos clonogénicos tumorales, aislamiento FACS y ensayo de formación de tumoresfera. El ensayo clonogénico tumoral fue descrito por primera vez en 1971, utilizado para estudios con células madre, y sólo se aplicó posteriormente a la biología del cáncer29,30. Este método se basa en la propiedad intrínseca de las ...

El cáncer es una enfermedad heterogénea; además, el mismo tipo de tumor puede presentar diferentes mutaciones genéticas en diferentes pacientes, y dentro de un paciente un tumor está compuesto por múltiples poblaciones de células1. La heterogeneidad presenta un desafío en la identificación de las células responsables de iniciar y propagar el cáncer, pero su caracterización es esencial para el desarrollo de tratamientos eficientes. La noción de células propagantes tumorales (TPC), una población rara de células que contribuyen al desarrollo tumoral, ha sido previamente ampliamente revisada2. A pesar de que los TPM se han caracterizado en múltiples tipos de cáncer, la identificación de marcadores para su aislamiento fiable sigue siendo un desafío para varios tipos de tumores3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. Por lo tanto, un método que no se basa en marcadores moleculares, sino más bien en las propiedades funcionales de TPC (alta auto-renovación y la capacidad de crecer en condiciones de baja fijación), conocido como el ensayo de formación de tumoresfera, puede ser ampliamente aplicado para el identificación de los TPC de la mayoría de los tumores. Es importante destacar que este ensayo también puede emplearse para la expansión de los Tpm y, por lo tanto, se aplica directamente a la detección de fármacos contra el cáncer y estudios sobre la resistencia al cáncer1,10.
El rabdomiosarcoma (RMS) es una forma rara de sarcoma de tejido blando más común en niños pequeñosde 11años. Althoug RMS se puede identificar histológicamente a través de la evaluación de la expresión de marcadores miogénicos, la célula de origen RMS no se ha caracterizado unívocamente debido a los múltiples subtipos tumorales y alta heterogeneidad de los estímulos de desarrollo tumoral. De hecho, estudios recientes han generado una discusión científica significativa sobre si el RMS es de origen miogénico o no miogénico, lo que sugiere que el RMS puede derivar de diferentes tipos de células dependiendo del contexto12,13, 14 , 15 , 16 , 17. Se han realizado numerosos estudios sobre líneas celulares RMS empleando el ensayo de formación de tumoresfera para la identificación de vías implicadas en el desarrollo tumoral y caracterización de marcadores asociados a poblaciones altamente auto-renovables 18 , 19 , 20 , 21.
Sin embargo, a pesar del potencial del ensayo de formación de tumoresfera para identificar células RMS de origen, aún no se ha descrito un método confiable que pueda emplearse en células primarias de RMS. En este contexto, un estudio reciente de nuestro grupo empleó un ensayo optimizado de formación de tumoresfera para la identificación de las células RMS de origen en un ratón de distrofia muscular de Duchenne (DMD) modelo22. Múltiples tipos de células pretumigenas, aisladas de los tejidos musculares, se prueban por su capacidad para crecer en condiciones de baja fijación, permitiendo la identificación de células madre musculares como células de origen para RMS en contextos distróficos. Aquí se describe un protocolo reproducible y fiable para el ensayo de formación de la tumoresfera(Figura 1), que se ha empleado con éxito para la identificación de poblaciones celulares extremadamente raras que son responsables del desarrollo de RMS de ratón.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase cell dissociation reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Detach adherent cells and dissociate tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S312500</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF recombinant mouse protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II Flow Cytometry</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>650033</td>
			<td>Fluorescent activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td>Anesthetic reagent for animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FxCycle Violet Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F10347</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210072</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16050114</td>
			<td>Component of cell isolation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 transfection reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40234</td>
			<td>Provides support to trasplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplemtns (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>701008</td>
			<td>Eyes ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Component of FACS buffer and used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>6084-1</td>
			<td>GFP plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomyocin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140163</td>
			<td>Component of tumosphere and tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human &#946;FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>10018B</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>427-FL-005</td>
			<td>Recombinant protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas

El rabdomiosarcoma (RMS) es el sarcoma de tejido blando más común en niños. Aunque los esfuerzos significativos han permitido la identificación de mutaciones comunes asociadas con la RMS y han permitido la discriminación de diferentes subtipos de SRM, todavía existen grandes desafíos para el desarrollo de nuevos tratamientos para mejorar aún más el pronóstico. Aunque se identifica por la expresión de marcadores miogénicos, todavía hay una controversia significativa sobre si el RMS tiene orígenes miogénicos o no miogénicos, ya que la célula de origen todavía se entiende mal. En el presente estudio, se proporciona un método fiable para el ensayo de tumoresfera para rmS de ratón. El ensayo se basa en las propiedades funcionales de las células tumorales y permite la identificación de poblaciones raras en el tumor con funciones tumorigénicas. También se describen los procedimientos para analizar proteínas recombinantes, integrar protocolos de transfección con el ensayo de tumoresfera y evaluar los genes candidatos implicados en el desarrollo y crecimiento tumoral. Además, se describe un procedimiento para el trasplante de tumoresferas de aloinjertos en ratones receptores para validar la función tumorigénica in vivo. En general, el método descrito permite la identificación y prueba fiables de poblaciones tumorigénicas RMS raras que se pueden aplicar a los RMS que surgen en diferentes contextos. Por último, el protocolo se puede utilizar como una plataforma para la detección de drogas y el desarrollo futuro de terapias.

Detección de tumoresferas El aislamiento celular se optimizó para obtener la máxima heterogeneidad de las poblaciones celulares presentes en el tejido tumoral. En primer lugar, dado que los tejidos aislados presentaban áreas morfológicamente diferentes, para aumentar las posibilidades de aislar poblaciones uniformes de células raras, se realizó un muestreo de múltiples áreas del tumor(Figura 1A,primer panel a la izquierda). En seg...

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Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Este protocolo describe un método reproducible para el aislamiento de las células primarias de rabdomiosarcoma de ratón, la formación y el tratamiento de la tumoresfera y el trasplante de aloinjertoado a partir de cultivos de tumoresferas.

Derivación y tratamiento de tumoresferas a partir de células tumorales primarias aisladas de Rhabdomyosarcomas de ratón

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

El rabdomiosarcoma es una forma rara de sarcomas de tejido blando caracterizados histológicamente por morfología tisular y la expresión de marcadores miogénicos. Sin embargo, dada la existencia de diferentes subtipos de estos tumores y la heterogeneidad de los estímulos que contribuye a su formación, la identificación de la célula de origen ha sido muy difícil. Aquí describimos métodos reproducibles y confiables para la identificación de la célula de origen de los rabdomiosarcomas a partir de tejidos tumorales recién cosechados de ratones y este ensayo es el ensayo de formación de la tumorsfera.Las principales ventajas del ensayo de formación de tumoresfera es que se basa en propiedades celulares que se sabe que están presentes en las células originarias de tumores y también se puede utilizar para la expansión y el enriquecimiento de la población celular específica. Además, su estructura esferoide imita el entorno tumoral, por lo que se pueden utilizar como estudios de detección de fármacos. Este método tiene el potencial de ser aplicado a otros tipos de tumores porque no requiere conocimiento previo de marcadores moleculares, pero puede requerir la optimización de las condiciones de cultivo.La tumoral puede tardar algún tiempo en formarse, especialmente si se trata de identificar una población de células raras dentro del tumor. Por lo tanto, no se sugiere mirar su placa de subcultura todos los días, ya que podría afectar negativamente los resultados de sus experimentos. Comience calentando una placa de 10 centímetros con cinco mililitros de medios de aislamiento en una incubadora a 37 grados centígrados.Pesar de 500 a 1.000 miligramos del tejido tumoral y colocarlo en el plato. Lleve la placa con el tejido tumoral a una capucha de cultivo estéril y úsela con una cuchilla de afeitar. Para una digestión óptima, asegúrese de que los tamaños de las piezas picadas sean uniformes.Transfiera el tejido picado y los medios de aislamiento celular a un tubo centrífugo de 15 mililitros. Lave la placa con otros cuatro mililitros de medios y agréguelo al tubo. Añadir 700 unidades por mililitro de solución de colagenasa al tubo e incubarlo en un baño de agua agitada a 37 grados centígrados durante 1 hora y media.Después de la incubación, gire hacia abajo el tejido a 300 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante sin interrumpir el pellet, luego resuspender el pellet en 10 mililitros de segunda solución de digestión e incubar en el baño de agua de agitación durante 30 minutos más. Después de la segunda digestión, pipetee la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo y páselo a través de un filtro de nylon de 70 micrómetros en un tubo de centrífuga de 50 mililitros.A continuación, lave el filtro con 10 mililitros de medios de aislamiento celular y gire hacia abajo el tejido a 300 g durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 20 mililitros de medios celulares tumorales. Transfiera la suspensión a una placa de cultivo de 15 centímetros y coloque las células en una incubadora de 37 grados Celsius durante la noche.Al día siguiente, cambie los medios para eliminar los desechos y las células muertas que pueden influir negativamente en la supervivencia celular. En este punto, evaluar la confluencia celular y permitir que las células crezcan en la incubadora hasta que alcance el 90%Monitorear las células todos los días y cambiar los medios cada dos días. Para la derivación de tumoresfera, utilice células en el Pasaje P1 o P2 para evitar la selección celular a través de múltiples pasajes.Lave el plato celular con PBS y luego cúbralo con solución de desprendimiento. Colóquelos en la incubadora durante cinco a 10 minutos y luego confirme el desprendimiento mirando la placa bajo un microscopio de campo brillante. Una vez que las células se hayan desprendido, agregue medios celulares tumorales a la placa y transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo.Gire las células hacia abajo a 300 veces g durante cinco minutos, elimine el sobrenadante y resuspendir las células en los medios de la tumorsfera. Después de resuspender las células, contarlas usando el azul de Trypan y calcular la concentración celular. Dora el número adecuado de células en una placa de baja fijación de 96 pozos y coloca las células en la incubadora hasta el final del experimento, teniendo cuidado de no perturbar la placa a menos que se repongan los medios.Después de completar el experimento, identifique las tumoresferas manualmente bajo un microscopio de campo brillante o utilizando el software Celigo. El número y el tamaño de las tumoresferas se pueden evaluar como resultado de este ensayo. Para preparar las tumoresferas para el trasplante de aloinjerto, reúna todas las tumoresferas obtenidas de un tipo o tratamiento celular específico.Centrifugar las tumoressferas y quitar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de un milímetro seguida de una pipeta de 200 microlitros, luego lavarlos con 10 mililitros de PBS estéril. Vuelve a girar las tumoresferas y aspira la PBS. Añadir 500 microlitros a un mililitro de solución de desprendimiento celular en la parte superior del pellet de la tumorsfera e incubar las células en un baño de agua agitado a 37 grados centígrados.Compruebe la progresión de la digestión cada 10 minutos. Todo el proceso tarda hasta 30 minutos. Si la digestión de la tumorsfera en el baño de agua agitado no es suficiente para obtener una solución de una sola célula, se sugiere una interrupción mecánica a través de pipeteo arriba y abajo.Tenga en cuenta que después de girar las tumoresferas no forman un pellet estable, por lo que aspirar el sobrenadante debe hacerse cuidadosamente con una pipeta de un mililitro y pipetas de 200 microlitros. Una vez que se obtiene una solución de una sola célula, agregue un volumen de medios celulares tumorales y gríchelo a 300 veces g durante cinco minutos a 4 grados centígrados. Después de esta centrifugación, todos los pasos posteriores deben realizarse en hielo.Resuspenda las células en medios celulares tumorales fríos y cuente las células vivas usando la exclusión azul de Trypan. Determinar el número adecuado de células para el aloinjerto y diluirlo en 50 microlitros de medios celulares tumorales fríos. Coloque una punta de pipeta en medios de células tumorales frías para enfriarla y luego úsela para tomar 50 microlitros de solución de ECM frío y agréguelo al tubo con células, asegurándose de no extraer el tubo ECM del hielo durante este proceso.Mantenga las células sobre hielo hasta el trasplante y coloque una jeringa de insulina de 0,5 mililitros con una aguja de calibre 29 sobre hielo. Después de confirmar que el ratón ha sido anestesiado correctamente, afeite el lado derecho del animal, aspire la solución celular en la jeringa enfriada e inyecte las células por vía subcutánea en el área afeitada. Si la inyección se realiza correctamente, se formará una protuberancia visible debajo de la piel.Este protocolo se puede utilizar para formar tumoresferas de forma fiable para la identificación de poblaciones de células raras que son responsables del desarrollo del sarcoma de tejido blando. Una parte fundamental de este ensayo es la discriminación entre las tumoresferas y los grupos celulares, que presentan claras diferencias morfológicas. Para determinar la concentración óptima a la que una proteína de interés desencadena un efecto sobre las células tumorales, es necesario evaluar el nivel de expresión de los objetivos posteriores de la proteína.Tres de los genes analizados mostraron una respuesta dependiente de la dosis al tratamiento de proteínas recombinantes y uno no. Con el fin de establecer un protocolo eficaz, se analizaron los efectos de la transfección en las células tumorales inherentes; se analizaron dos cantidades diferentes de reactivos y se evaluó la eficiencia con un plásmido de la GFP-reportero. Las cantidades más bajas de reactivo resultaron en una mayor eficiencia de transfección.Se tuvo que implementar un protocolo de dos pasos para realizar la transfección en las células en suspensión. La transfección se realizó en las células adherentes y 24 horas más tarde fueron desprendidas y chapadas en suspensión;después de siete días, las tumoresferas controladas expresaban la GFP. Después de obtener, tratar y trasplantar tumores, es posible comparar el efecto de este tratamiento diferente en el crecimiento tumoral in vivo.Estos métodos permitirán a los científicos responder a las preguntas todavía permanentes de la célula de origen del rabdomiosarcomas y, al mismo tiempo, establecer las bases para la detección de fármacos.

Research

JoVE Journal

Genetics

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes TÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼6028

A partir de un producto natural a su cluster biosintético Gen: Una demostración del uso de Polyketomycin<em&gt; Streptomyces diastatochromogenes</em&gt; Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

Investigación

Genética

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Cromatina difundir preparados para el análisis de progresión de ovocitos de ratón de profase a metafase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Aislamiento, secuenciación y análisis de microRNA extracelular de las células madre mesenquimales humanas

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Generación de Clones de células de cáncer para visualizar que contiene la repetición telomérica ARN TERRA de un telómero solo en las células vivas

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

Ensayo de ATAC-seq con ADN mitocondrial baja contaminación primaria humana CD4 + linfocitos T

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Secuenciación de ARNm de sangre entera utilizando secuenciación de nanoporos

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Un protocolo in vitro para evaluar los niveles, funciones y genes objetivo asociados de MicroRNA en células tumorales

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generación de organoides tumorales a partir de modelos de ratón de ingeniería genética del cáncer de próstata

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

El uso de células tumorales mamarias de ratón en un ensayo de invasión in vitro como medida del comportamiento de las células oncogénicas

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Un protocolo basado en FACS para aislar el ARN de las células secundarias de Drosophila Male Accessory Glands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...