Name: tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas
Uploaded: 2019-09-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas at JoVE.com

Bu çalışma Ellison Medical Foundation hibe AG-NS-0843-11 ve NCI Kanser Merkezi Destek Hibe P30CA030199 a.S. içinde NIH Pilot Grant tarafından desteklenmiştir.

Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute'un onaylı IACUC protokolü nün ardından farelerin barınma, tedavisi ve kurban edilmesi gerçekleştirildi.
1. Reaktif hazırlama
<ol><li>100 mL hücre izolasyonu ortamı hazırlayın: F10 orta %10 at serumu (HS) ile desteklenir.</li>
	<li>50 mL kollajenaz tip II çözeltisini hazırlayın: hücre izolasyon uytonunun 50 mL'sinde 1 g kollajenaz tipi II tozunu çözündürün (çok bağlı olarak birim sayısı değiştiğinden, 1 mL'lik or...

<ol>
	<li>Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+resistance+to+cancer+therapies.">Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).</li><li>Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+an+old+idea--a+paradigm+shift.">Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift.</a> Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+liver+cancer+stem+cells.">Molecular biology of liver cancer stem cells.</a> Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).</li><li>Crous, A. M., Abrahamse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cancer+stem+cells+and+low-intensity+laser+irradiation:+a+potential+future+therapy.">Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (5), 129 (2013).</li><li>Tomao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+molecular+profiles+of+ovarian+cancer:+an+update+on+cancer+stem+cells.">Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells.</a> Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).</li><li>Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+stem+cells:+new+insight+into+a+stubborn+disease.">Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease.</a> Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).</li><li>Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+prostate+cancer+stem+cells:+markers+and+methods.">Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).</li><li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice.">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li><li>Lee, C. -. H., Yu, C. -. C., Wang, B. -. Y., Chang, W. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorsphere+as+an+effective+in+vitro+platform+for+screening+anti-+cancer+stem+cell+drugs.">Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs.</a> Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).</li><li>Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+adult+and+pediatric+rhabdomyosarcoma+in+the+surveillance,+epidemiology+and+end+results+program.">Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).</li><li>Blum, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+overlapping+sarcoma+subtypes+initiated+from+muscle+stem+and+progenitor+cells.">Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells.</a> Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).</li><li>Rubin, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+unanticipated+relationship+between+undifferentiated+pleomorphic+sarcoma+and+embryonal+rhabdomyosarcoma.">Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).</li><li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+rhabdomyosarcomas+in+conditional+Pax3:Fkhr+mice:+cooperativity.">Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity.</a> of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes &amp; Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).</li><li>Tremblay, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+transducer+YAP1+transforms+activated+satellite+cells+and+is+a+potent+effector+of+embryonal+rhabdomyosarcoma+formation.">The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation.</a> Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).</li><li>Hatley, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+rhabdomyosarcoma+originating+from+the+adipocyte+lineage.">A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage.</a> Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).</li><li>Drummond, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Drives+Fusion-Negative+Rhabdomyosarcoma+Initiated+From+Non-myogenic+Endothelial+Progenitors.">Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors.</a> Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).</li><li>Almazan-Moga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+Pathway+Inhibition+Hampers+Sphere+and+Holoclone+Formation+in+Rhabdomyosarcoma.">Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma.</a> Stem Cells International. , (2017).</li><li>Walter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+positive+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population+is+enriched+in+rhabdospheres.">CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li><li>Ciccarelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+MEK/ERK+pathway+in+sustaining+tumorigenicity+and+in+vitro+radioresistance+of+embryonal+rhabdomyosarcoma+stem-like+cell+population.">Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population.</a> Molecular Cancer. 15, (2016).</li><li>Deel, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transcriptional+Coactivator+TAZ+Is+a+Potent+Mediator+of+Alveolar+Rhabdomyosarcoma+Tumorigenesis.">The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis.</a> Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).</li><li>Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Stem+Cells+Give+Rise+to+Rhabdomyosarcomas+in+a+Severe+Mouse+Model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).</li><li>Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+mdx+mice+display+a+reduced+life+span+and+are+susceptible+to+spontaneous+rhabdomyosarcoma.">Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma.</a> The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).</li><li>Kessel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+3D+Tumor+Spheroid+Screening+Method+for+Cancer+Drug+Discovery+Using+Celigo+Image+Cytometry.">High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry.</a> SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).</li><li>Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Tumorsphere+Formation+Assays.">In vitro Tumorsphere Formation Assays.</a> Bio-Protocol. 3 (3), (2013).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+tumorsphere+culture+system+for+the+efficient+and+low-cost+enrichment+of+cancer+stem+cells+with+natural+polymers.">A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers.</a> Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).</li><li>Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+molecular+pathways+of+FLT3+in+the+pathogenesis+of+acute+myeloid+leukemia:+biology+and+therapeutic+implications.">Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications.</a> Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).</li><li>Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+is+required+for+Flt3L-dependent+dendritic+cell+differentiation.">STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation.</a> Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).</li><li>Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+melphalan+on+mouse+myeloma+(adj.+PC-5)+and+hemopoietic+stem+cells.">Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells.</a> Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).</li><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells.">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197 (4302), 461-463 (1977).</li><li>Hamburger, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+tumor+clonogenic+assay+as+a+model+system+in+cell+biology.">The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology.</a> The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).</li><li>Jimenez-Hernandez, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRP1-positive+lung+cancer+cells+possess+tumor-initiating+properties.">NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties.</a> Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+(3D)+models+in+cancer+research:+an+update.">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Salerno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphere-forming+cell+subsets+with+cancer+stem+cell+properties+in+human+musculoskeletal+sarcomas.">Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas.</a> International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).</li></ol>

Tümör klojen iyotlar, FACS izolasyonu ve tümörsphere formasyon testi: tümör klojeni tahlilleri, tümör klojeni tahlilleri ve tümörsphere oluşumu tahlillerinden TBM'lerin izolasyonu ve karakterizasyonu için birden fazla yöntem kullanılmıştır. Tümör klojenisi titreti ilk olarak 1971 yılında tanımlanmıştır, kök hücre çalışmaları için kullanılan, ve sadece daha sonra kanser biyolojisi29uygulanan,30. Bu yöntem yumuşak jeller kültürl...

Kanser heterojen bir hastalıktır; ayrıca, aynı tip tümör farklı hastalarda farklı genetik mutasyonlar sunabilir, ve bir hasta içinde bir tümör hücrelerin birden fazla popülasyonları oluşur1. Heterojenlik, kanserin başlatılmasından ve yayılmasından sorumlu hücrelerin belirlenmesinde bir sorun teşkil eder, ancak bunların karakterizasyonu etkin tedavilerin geliştirilmesi için gereklidir. Tümör yayılma hücreleri kavramı (TPC), tümör gelişimine katkıda bulunan hücrelerin nadir bir popülasyon, daha önce kapsamlı olarak gözden geçirilmiştir2. TPTS kanser birden fazla tip karakterize olmasına rağmen, onların güvenilir izolasyon için belirteçleri belirlenmesi çeşitli tümör tipleri için bir sorun olmaya devam etmektedir3,4,5,6 , 7.000 , 8.000 , 9- Bu nedenle, moleküler belirteçlere değil, TPC fonksiyonel özelliklerine (yüksek kendini yenileme ve düşük bağlanma koşullarında büyüme yeteneği) dayanan bir yöntem, tümörküre oluşumu tsay olarak bilinen, yaygın olarak uygulanabilir çoğu tümörden TPC'lerin belirlenmesi. Daha da önemlisi, bu tsay da TPCs genişlemesi için istihdam edilebilir ve böylece doğrudan kanser ilaç tarama ve kanserdirenciçalışmaları 1 ,10.
Rhabdomyosarcoma (RMS) yumuşak doku sarkomu en küçük çocuklarda en sık görülen birformudur 11. Althoug RMS histolojik olarak miyojenik belirteçlerin ekspresyonunun değerlendirilmesi ile saptanabilir, RMS kökenli hücre birden fazla tümör alt tipleri ve tümör gelişimsel uyaranlarının yüksek heterojenliği nedeniyle tek kesin olarak karakterize edilmemiştir. Nitekim, son çalışmalar RMS miyojenik veya non-miyojenik kökenli olup olmadığı hakkında önemli bilimsel tartışma üretti, RMS bağlam12bağlı olarak farklı hücre tiplerinden elde edilebilir düşündüren 12,13, 14.000 , 15.000 , 16.02.20 , 17- Tümör gelişimi ve yüksek oranda kendini yenileme popülasyonları ile ilişkili belirteçlerin karakterizasyonu ile ilgili yolların belirlenmesi için tümörküre oluşumu tetkiklerinin geliştirilmesi için RMS hücre hatları üzerinde çok sayıda çalışma yapılmıştır. 18.000 , 19.09.20 , 20.000 , 21. yıl.
Ancak, tümörküre oluşumu tsay kökenli RMS hücrelerini tanımlamak için potansiyeline rağmen, birincil RMS hücreleri üzerinde istihdam edilebilir güvenilir bir yöntem henüz tarif edilmemiştir. Bu bağlamda, grubumuzdan yeni bir çalışmada duchenne kas distrofisi (DMD) fare modeli22kökenli RMS hücrelerinin belirlenmesi için optimize edilmiş bir tümörsphere oluşumu tetkik istihdam . Kas dokularından izole edilmiş birden fazla pre-tümörijenik hücre tipi, düşük bağlanma koşullarında büyüme yetenekleri açısından test edilerek, distrofik bağlamlarda RMS için başlangıç hücreleri olarak kas kök hücrelerinin tanımlanmasına olanak sağlar. Burada tanımlanan, fare RMS gelişiminden sorumlu son derece nadir hücre popülasyonlarının belirlenmesinde başarıyla kullanılan tümörsphere formasyon uyrmuş test(Şekil 1)için tekrarlanabilir ve güvenilir bir protokoldür.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase cell dissociation reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Detach adherent cells and dissociate tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, protease</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Tissue digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S312500</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF recombinant mouse protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II Flow Cytometry</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>650033</td>
			<td>Fluorescent activated cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td>Component of tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td>Anesthetic reagent for animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FxCycle Violet Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F10347</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16210072</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11550043</td>
			<td>Component of FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16050114</td>
			<td>Component of cell isolation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 transfection reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40234</td>
			<td>Provides support to trasplanted cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplemtns (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>701008</td>
			<td>Eyes ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Component of FACS buffer and used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>6084-1</td>
			<td>GFP plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomyocin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140163</td>
			<td>Component of tumosphere and tumor cells media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human &#946;FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>10018B</td>
			<td>Component of tumosphere media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>427-FL-005</td>
			<td>Recombinant protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Discriminate live and dead cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumorsphere derivation and treatment from primary tumor cells isolated from mouse rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarkom (RMS) çocuklarda en sık görülen yumuşak doku sarkomudur. Önemli çabalar RMS ile ilişkili yaygın mutasyonların belirlenmesini ve farklı RMS alt tiplerinin ayrımcılığa izin vermesine rağmen, prognozu daha da iyileştirmek için yeni tedavilerin geliştirilmesinde hala büyük zorluklar vardır. Miyojenik belirteçlerin ekspresyonu ile tanımlansa da, rms'nin miyojenik mi yoksa miyojenik olmayan kökenleri mi yoksa miyojenik olmayan kökenleri mi olduğu konusunda hala önemli tartışmalar vardır, çünkü menşe hücresi hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışmada fare RMS için tümörfer tetkik için güvenilir bir yöntem sağlanmıştır. Test tümör hücrelerinin fonksiyonel özelliklerine dayanmaktadır ve tümörijenik fonksiyonlar ile tümörnadir popülasyonların belirlenmesini sağlar. Ayrıca rekombinant proteinlerin test edilmesi, transfeksiyon protokollerinin tümörküre testi ile bütünleştirilmesi ve tümör gelişimi ve büyümesinde rol oynayan aday genlerin değerlendirilmesi için yapılan prosedürler de tanımlanmıştır. Ayrıca açıklanan in vivotümörijenik fonksiyonu doğrulamak için alıcı fareler içine tümörkürelerin allogreft nakli için bir prosedürdür . Genel olarak, açıklanan yöntem, farklı bağlamlarda ortaya çıkan RMS'lere uygulanabilen nadir RMS tümörijenik popülasyonların güvenilir bir şekilde tanımlanmasına ve test edilmesine olanak sağlar. Son olarak, protokol ilaç taraması ve terapötik gelecekteki gelişimi için bir platform olarak kullanılabilir.

Tümör küreleri tespiti Hücre izolasyonu tümör dokusunda bulunan hücre popülasyonlarının maksimum heterojenliğini elde etmek için optimize edildi. İlk olarak, izole dokular morfolojik olarak farklı alanlar sunduğından, tek tip nadir hücre popülasyonlarını izole etme şansını artırmak için, tümörün birden fazla alanından örnekleme yapıldı(Şekil 1A, soldaki ilk panel). İkinci olarak, hasat edilen numunelerin m...

Watch this Scientific Journal Video about Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas at JoVE.com

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Bu protokol, fare rabdomiyosarkom primer hücrelerinin izolasyonu, tümörsphere oluşumu ve tedavisi ve tümörküre kültürlerinden başlayan allograft transplantasyonu için tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlar.

Mouse Rhabdomiyosarkomlardan İzole Edilen Primer Tümör Hücrelerinden Tümörfer Türevve Tedavisi

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Rabdomiyosarkom, histolojik olarak doku morfolojisi ve miyojenik belirteçlerin ekspresyonu ile karakterize yumuşak doku sarkomlarının nadir bir formudur. Ancak, bu tümörlerin farklı alt tiplerinin varlığı ve oluşumuna katkıda bulunan uyaranların heterojenliği göz önüne alındığında, menşe hücresinin tanımlanması çok zor olmuştur. Burada farelerden taze hasat tümör dokularından başlayarak rabdomiyosarkomların menşe hücresinin tanımlanması için tekrarlanabilir ve güvenilir yöntemler tarif ve bu tetkik tümör küre oluşumu tetkik.Tümörlü sferans formasyon uyruplamanın başlıca avantajları, tümör kaynaklı hücrelerde bulunduğu bilinen hücresel özelliklere dayanması ve spesifik hücre popülasyonunun genişlemesi ve zenginleşmesi için de kullanılabilmeözelliğidir. Ayrıca, küresel yapısı tümör ortamını taklit eder, böylece ilaç tarama çalışmaları olarak kullanılabilir. Bu yöntem, moleküler belirteçler hakkında önceden bilgi gerektirmediği, ancak kültür koşullarının optimizasyonu gerektirebileceği nden diğer tümör tipine uygulanma potansiyeline sahiptir.Tümörküre oluşturmak için biraz zaman alabilir, Özellikle tümör içinde nadir bir hücre popülasyonu belirlemeye çalışıyorsanız. Bu nedenle, denemelerinizin sonuçlarını olumsuz etkileyebileceğinden, her gün alt kültür plakanıza bakmanız önerilemez. 37 santigrat derecede bir kuvözde beş mililitre izolasyon medyası olan 10 santimetrelik bir plakayı ısıtarak başlayın.Tümör dokusunun 500 ila 1000 miligram ağırlığında ve tabağa yerleştirin. Tümör dokusu ile plaka steril bir kültür başlık getirmek ve bir jilet ile kıyma. Optimum sindirim için, kıyılmış parçaların boyutları düzgün olduğundan emin olun.Kıyma lı doku ve hücre izolasyon ortamını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Plakayı dört mililitre daha ortamla yıkayın ve tüpün içine ekleyin. Tüpkolajenaz çözeltisi mililitre başına 700 adet ekleyin ve 1 1 / 2 saat boyunca 37 derece santigrat bir sallayarak su banyosunda kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez g doku aşağı spin. Pelet bozmadan supernatant Aspire, sonra ikinci sindirim çözeltisi 10 mililitre pelet resuspend ve 30 dakika daha sallayarak su banyosunda kuluçka. İkinci sindirimden sonra, pipet hücre süspansiyon yukarı ve aşağı ve 50 mililitrelik santrifüj tüp üzerinde 70 mikrometrelik naylon filtre ile geçmek.Daha sonra filtreyi 10 mililitre hücre izolasyon ukalalığı ile yıkayın ve 5 dakika boyunca 300 kez g'de dokuyu aşağı doğru döndürün. Supernatant aspire ve tümör hücreli media 20 mililitre pelet resuspend. Süspansiyonu 15 santimetrelik bir kültür plakasına aktarın ve hücreleri bir gecede 37 derecelik bir kuvöze yerleştirin.Ertesi gün, hücre sağkalımını olumsuz etkileyebilecek enkaz ve ölü hücreleri kaldırmak için ortamı değiştirin. Bu noktada, hücre birleşimini değerlendirin ve hücrelerin kuvözde büyümesine izin verin % 90'a ulaşana kadar hücreleri her gün izleyin ve her iki günde bir ortamı değiştirin. Tümörküre türasyonu için, birden fazla geçit yoluyla hücre seçimi önlemek için Passage P1 veya P2 hücreleri kullanın.Hücre çanasını PBS ile yıkayın ve üzerini ayırma solüsyonu ile kapatın. 5 ila 10 dakika boyunca kuvözde yerleştirin ve sonra bir brightfield mikroskop altında plaka bakarak müfreze onaylamak. Hücreler ayrıldıktan sonra, tabağa tümör hücresi ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonuna bir santrifüj tüpüne aktarın.Hücreleri 5 dakika boyunca 300 kez g'de döndürün, süpernatant'ı çıkarın ve tümörsfer medyasındaki hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri yeniden askıya aldıktan sonra, Trypan mavisi kullanarak sayın ve hücre konsantrasyonu hesaplayın. 96-iyi bir düşük eki plaka hücrelerin uygun sayıda plaka ve deney sonuna kadar kuvöz hücreleri yerleştirin, ortam doldurma sürece plaka rahatsız etmemeye dikkat.Deney tamamlandıktan sonra, bir brightfield mikroskobu altında veya Celigo yazılımı kullanarak tümör küreleri elle tanımlayın. Bu tetkik sonucunda tümör kürelerinin sayısı ve büyüklüğü değerlendirilebilir. Allogreft transplantasyonu için tümör küreleri hazırlamak için, belirli bir hücre tipi veya tedaviden elde edilen tüm tümör küreleri bir araya getirin.Tümör kürelerini santrifüj edin ve süpernatantı bir milimetrelik pipetle dikkatlice çıkarın ve ardından 200 mikrolitrelik pipet, sonra 10 mililitre steril PBS ile yıkayın. Tümör kürelerini tekrar aşağı çevirin ve PBS'yi aspire edin. Tümörsfer peletinin üstüne bir mililitrelik hücre ayırma çözeltisine 500 mikrolitre ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede sallayarak su banyosunda kuluçkaya yatırın.Her 10 dakikada bir sindirim ini kontrol edin. Tüm işlem 30 dakika kadar sürer. Sallayarak su banyosunda tümörkürenin sindirimi tek hücreli bir çözelti elde etmek için yeterli değilse, yukarı ve aşağı borulama yoluyla mekanik bozulma önerilmektedir.Tümörküreler döndükten sonra istikrarlı bir pelet oluşturmaz, bu nedenle süpernatant bir mililitrelik pipet ve 200 mikrolitrelik pipetler ile dikkatle yapılmalıdır. Tek hücreli bir çözelti elde edildikten sonra, tümör hücreli ortam hacmi ekleyin ve 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez g aşağı spin. Bu santrifüjden sonra, sonraki tüm adımlar buz üzerinde yapılmalıdır.Soğuk tümör hücre lisanındaki hücreleri yeniden askıya alın ve Trypan mavisi dışlama kullanarak canlı hücreleri sayın. Allogreft için uygun hücre sayısını belirleyin ve soğuk tümör hücreli media 50 mikrolitre seyreltin. Soğutmak için soğuk tümör hücreli ortama bir pipet ucu yerleştirin ve daha sonra soğuk ECM çözeltisi 50 mikrolitre almak ve hücrelerle tüp eklemek için kullanabilirsiniz, bu işlem sırasında buz Dan ECM tüp kaldırmak için emin olun.Nakil kadar buz üzerinde hücreleri korumak ve buz üzerinde 29-gauge iğne ile kapaklı, 0.5 mililitrelik insülin şırınga yerleştirin. Farenin düzgün bir şekilde anestezi altında olduğunu doğruladıktan sonra, hayvanın sağ tarafını tıraş edin, hücre çözeltisini soğutulmuş şırınganın içine aspire edin ve hücreleri deri altına tıraş edilen bölgeye enjekte edin. Enjeksiyon doğru yapılırsa, deri altında gözle görülür bir yumru oluşacaktır.Bu protokol, yumuşak doku sarkomu gelişiminden sorumlu nadir hücre popülasyonlarının belirlenmesi için güvenilir bir şekilde tümör küreleri oluşturmak için kullanılabilir. Bu sedanın temel bir parçası tümör küreleri ve hücre kümeleri arasında ayrımcılık, hangi açık morfolojik farklılıklar göstermektedir. İlgi proteininin tümör hücreleri üzerinde bir etkiyi tetiklediği optimal konsantrasyonu belirlemek için, proteinin aşağı akım hedeflerinin ifade düzeyini değerlendirmek gerekir.Test edilen genlerin üçünde rekombinant protein tedavisine doza bağımlı bir yanıt saptandı ve biri vermedi. Etkili bir protokol oluşturmak için transfeksiyonun doğal tümör hücreleri üzerindeki etkileri analiz edildi;iki farklı miktarda reaktif test edildi ve verimlilik GFP muhabiri plazmid ile değerlendirildi. Daha düşük miktarda reaktif daha yüksek transfeksiyon verimliliği ile sonuçlandı.Süspansiyondaki hücrelere transfeksiyon yapmak için iki aşamalı bir protokol uygulanması gerekiyordu. Transfeksiyon yapışık hücrelere yapıldı ve 24 saat sonra söküldü ler ve süspansiyona bünyeyle kaplandılar;yedi gün sonra kontrollü tümörküreler GFP ifade edildi. Tümör küreler elde edildikten, tedavi edildikten ve nakledildikten sonra bu farklı tedavinin in vivo tümör büyümesindeki etkisini karşılaştırmak mümkündür.Bu yöntemler bilim adamlarının rabdomiyosarkomların kökeni hücresinin hala ayakta duran sorularını yanıtlamalarını sağlarken aynı zamanda uyuşturucu taramasıiçin de temel oluşturacaktır.

Research

JoVE Journal

Genetics

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes TÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼6028

dan Polyketomycin kullanma A Gösteri: Its Biyosentetik Gen kümesi için bir Doğal Ürün dan<em&gt; Streptomyces diastatochromogenes</em&gt; Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Kromatin fare oosit ilerleme profaz metafaz II analizi için hazırlıklar yaymak

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

İzole, sıralama ve insan Mezenkimal Kök hücreleri ekstrasellüler mikroRNA'lar analiz

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade Telomeric tekrar içeren RNA TERRA görselleştirmek için kanser hücre klonlar nesil

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAÇ-seq tahlil birincil insan CD4 + T lenfositleri kirlenme düşük mitokondrial DNA ile

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Tümör hücrelerinde MicroRNA seviyeleri, fonksiyonları ve Ilişkili hedef genler değerlendirmek için bir In vitro protokol

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Prostat kanseri genetiği Işlenmiş fare modelleri tümör Organoids üretimi

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Onkojenik hücre davranışının bir ölçüsü olarak bir In vitro Invazif tahlil içinde Mouse mammary tümör hücrelerinin kullanımı

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Drosophila Erkek Aksesuar Bezlerinin Sekonder Hücrelerinden RNA'yı Izole etmek için FACS tabanlı Protokol

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...