Name: a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools
Uploaded: 2019-08-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

ونود أن نشكر أعضاء مختبرات أندرو فاير ومارك كاي على التوجيه والاقتراحات.

وقد أذنت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة واشنطن بإجراء تجارب حيوانية.
إعداد مكتبة RNA صغيرة
1. عزل الحمض النووي الريبي
<ol><li>عزل الحمض النووي الريبي من مصدر بيولوجي باستخدام كاشف عزل RNA قياسي، أو مجموعة تثري الميكروRNAs. بال...

<ol>
	<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+MicroRNAs.">Metazoan MicroRNAs.</a> Cell. 173 (1), 20-51 (2018).</li><li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+class+of+tiny+RNAs+with+probable+regulatory+roles+in+Caenorhabditis+elegans.">An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li><li>Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+small+RNAs+in+animals.">Biogenesis of small RNAs in animals.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loop+position+of+shRNAs+and+pre-miRNAs+is+critical+for+the+accuracy+of+dicer+processing+in+vivo.">The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo.</a> Cell. 151 (4), 900-911 (2012).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-induced+hepatotoxicity+results+from+loss+of+the+first+synthesized+isoform+of+microRNA-122+in+mice.">RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice.</a> Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+removal+in+the+liver+activates+imprinted+microRNAs+and+enables+more+effective+microRNA-mediated+gene+repression.">miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression.</a> Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+Registry.">The microRNA Registry.</a> Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).</li><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).</li><li>Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sailfish+enables+alignment-free+isoform+quantification+from+RNA-seq+reads+using+lightweight+algorithms.">Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Small+RNA+NGS+Libraries+from+Biofluids.">Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids.</a> Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).</li><li>Yamane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hepatitis+C+virus+RNA+target+site+selection+and+host+factor+activities+of+naturally+occurring+miR-122+3+variants.">Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).</li><li>Giraldez, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+multi-center+assessment+of+small+RNA-seq+methods+for+quantitative+miRNA+profiling.">Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling.</a> Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).</li><li>Yeri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+small+RNASeq+library+preparation+kits+using+low+input+RNA.">Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA.</a> BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).</li><li>Coenen-Stass, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methodologies+for+microRNA+biomarker+detection+by+next+generation+sequencing.">Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing.</a> RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).</li><li>Baran-Gale, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+Bias+in+Small+RNA+Library+Preparation+for+Sequencing:+A+New+Protocol+Recovers+MicroRNAs+that+Evade+Capture+by+Current+Methods.">Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods.</a> Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+the+microRNA+cluster+at+the+Dlk1-Dio3+locus+in+lung+adenocarcinoma.">Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma.</a> Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).</li><li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Normalization+Strategies+for+MicroRNA+Quantification.">Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification.</a> Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).</li><li>Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+RNA+ligase+2+truncated+active+site+mutants:+improved+tools+for+RNA+analysis.">T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis.</a> BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).</li><li>Chiang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes &amp; Development. 24 (10), 992-1009 (2010).</li><li>Fromm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Uniform+System+for+the+Annotation+of+Vertebrate+microRNA+Genes+and+the+Evolution+of+the+Human+microRNAome.">A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome.</a> Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).</li></ol>

على الرغم من تحديد microRNAs منذ أكثر من 20 عاما13، فإن عملية تسلسل microRNA لا تزال شاقة وتتطلب معدات متخصصة ، مما يعوق المختبرات من اعتماد البروتوكولات الداخلية بشكل روتيني14. تقنيات أخرى يمكن أن تقيم في وقت واحد microRNAs، مثل microRNA microarrays ولوحات التعبير متعددة المضاعفات؛ ومع ?...

اكتشفت لأول مرة في عام 19931، ويقدر الآن أن ما يقرب من 2000 microRNAs موجودة في الجينوم البشري2. MicroRNAs هي RNAs صغيرة غير الترميز التي عادة ما تكون 21-24 النيوكليوتيدات طويلة. هم منظمون ما بعد النسخ للتعبير الجيني، وغالبا ما تكون ملزمة لمواقع تكميلية في المنطقة 3-Untranslated (3-UTR) من الجينات المستهدفة لقمع التعبير البروتين يتحلل mRNA. ويمكن أن يعطي التحديد الكمي للميكروRNAs نظرة ثاقبة قيّمة في التعبير الجيني وقد وضعت عدة بروتوكولات لهذا الغرض3.
لقد قمنا بتطوير بروتوكول محدد، قابل للاستنساخ، وطويل الأمد لتسلسل الحمض النووي الريبي الصغير، ولتحليل القراءات الطبيعية باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية مفتوحة المصدر. الأهم من ذلك، بروتوكولنا يتيح التعرف في وقت واحد على كل من microRNAs الذاتية وبنيت تسليمها من الخارج التي تنتج الأنواع الشبيهة microRNA، في حين تقليل يقرأ تلك الخريطة لأنواع الرنا الصغيرة الأخرى، بما في ذلك RNAs ريبوسومال ( rRNAs)، نقل RNAs الصغيرة المشتقة من الحمض النووي الريبي (tsRNAs)، RNAs الصغيرة المشتقة من التكرار، ومنتجات تحلل mRNA. لحسن الحظ، microRNAs هي 5-فوسفوريلات و2-3 هيدروكسيلاد 4، وهي ميزة التي يمكن الاستفادة منها لفصلها عن هذه RNAs الصغيرة الأخرى ومنتجات تدهور mRNA. توجد عدة خيارات تجارية لاستنساخ وتسلسل microRNA التي غالباً ما تكون أسرع وأسهل لمضاعفات; ومع ذلك، فإن طبيعة الملكية من الكواشف عدة وتعديلاتها المتكررة يجعل مقارنة عينة يعمل تحديا. استراتيجيتنا يحسن جمع فقط الحجم الصحيح من microRNAs من خلال الأكريلاميد وخطوات تنقية هلام أغاروز. في هذا البروتوكول، نقوم أيضًا بوصف إجراء لمحاذاة تسلسل القراءة إلى microRNAs باستخدام أدوات مفتوحة المصدر. هذه المجموعة من التعليمات ستكون مفيدة بشكل خاص لمستخدمي المعلوماتية المبتدئين، بغض النظر عما إذا كان يتم استخدام طريقة إعداد المكتبة أو طريقة تجارية.
وقد استخدم هذا البروتوكول في العديد من الدراسات المنشورة. على سبيل المثال، تم استخدامه لتحديد الآلية التي أنزيم ديسير يشق RNAs دبوس الشعر الصغيرة على مسافة اثنين من النيوكليوتيدات من الحلقة الداخلية من هيكل حلقة الجذعية - ما يسمى "حلقة العد قاعدة"5. كما اتبعنا هذه الطرق لتحديد الوفرة النسبية لRNAs دبوس الشعر الصغيرة تسليم (shRNA) أعرب عنها من ناقلات الفيروسية المرتبطة بالدينو المؤتلف (rAAVs)، لتحديد عتبة التعبير shRNA التي يمكن التسامح معها قبل الكبد السمية المرتبطة بالتعبير الزائد shRNA6. باستخدام هذا البروتوكول، حددنا أيضا microRNAs في الكبد التي تستجيب لعدم microRNA-122 - microRNA الكبدي أعرب للغاية - في حين تتميز أيضا نمط تدهور هذا microRNA7. لأننا استخدمنا بروتوكولنا باستمرار في العديد من التجارب، تمكنا من مراقبة الاستعدادات عينة طوليا، ونرى أنه لا توجد آثار دفعة واضحة.
في تقاسم هذا البروتوكول، هدفنا هو تمكين المستخدمين من توليد جودة عالية، والقياس الكمي القابلة للاستنساخ من microRNAs في أي الأنسجة أو خط الخلية تقريبا، وذلك باستخدام معدات بأسعار معقولة والكواشف، وأدوات المعلوماتية الحيوية مجانا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19:1 bis-acrylamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 bp DNA step ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phenol/chloroform</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide RNA loading dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Buffer II</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Blue color helps in visualizing pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>45-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRVana microRNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>For generating small RNA sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusieve low-melting agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory sealing film)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-ethylene glycol 8000</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included with M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>For quantifying DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base pH 7.5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal miRNA cloning linker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools

ويعتقد أن نصف جميع النصوص البشرية تنظمها microRNAs. ولذلك، يمكن أن يكشف التحديد الكمي للتعبير microRNA الآليات الكامنة في حالات المرض وتوفير الأهداف العلاجية والمؤشرات الحيوية. هنا، نقوم بتفصيل كيفية قياس الميكروRNAs بدقة. باختصار، يصف هذا الأسلوب عزل microRNAs، ربطها إلى محولات مناسبة لتسلسل الإنتاجية العالية، تضخيم المنتجات النهائية، وإعداد مكتبة عينة. ثم، نشرح كيفية محاذاة قراءات التسلسل التي تم الحصول عليها إلى دبابيس الشعر microRNA، وتحديد كمية، تطبيع، وحساب التعبير التفاضلي. متعدد الاستخدامات وقوية، وهذا الجمع بين سير العمل التجريبي وتحليل المعلوماتية الحيوية تمكن المستخدمين من البدء مع استخراج الأنسجة والانتهاء مع القياس الكمي microRNA.

مخطط للخطوات التي ينطوي عليها إعداد المكتبة ويرد مخطط شامل لاستخراج الحمض النووي الريبي الصغير والتسلسل والمحاذاة في الشكل 2. تم جمع عينات الكبد من فأر واحد من الذكور والإناث والمفاجئة المجمدة في النيتروجين السائل. تم استخراج مجموع الحمض الن...

Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

هنا، نقوم بوصف استراتيجية خطوة بخطوة لعزل RNAs الصغيرة، وإثراء microRNAs، وإعداد عينات لتسلسل الإنتاجية العالية. ثم نقوم بوصف كيفية معالجة تسلسل القراءة ومحاذاتها إلى microRNAs، وذلك باستخدام أدوات مفتوحة المصدر.

خط أنابيب كامل لعزل وتسلسل MicroRNAs، وتحليلها باستخدام أدوات المصادر المفتوحة

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

لقد قمنا بتطوير بروتوكول محدد ، قابل للاستنساخ ، وطويل الأمد لتسلسل الحمض النووي الريبي الصغير ولتحلي القراءات الطبيعية باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية مفتوحة المصدر. المزايا الرئيسية لاستراتيجيتنا هي أنه يجمع بدقة microRNAs من خلال تنقية هلام وأنه يمكن تطبيق تحليل المعلوماتية الحيوية بغض النظر عن كيفية جمع microRNAs. يمكن أن يكشف تسلسل الإنتاجية العالية من microRNAs عن نظرة ثاقبة في آليات المرض ، ومعالجة microRNAs ، وتحديد كمي دقيق للنهج العلاج الجيني التي تقدم RNAs الصغيرة.تأكد من العمل في بيئة حرة RNase وإبقاء جميع المنتجات RNA على الجليد طوال العملية. إن تصور خطوات القطع الهلامية سيساعد المشاهدين على تحديد الحجم الصحيح للمنتجات المطلوبة لتطبيقات المصب. لثلاثة ربط محول رئيس, الجمع بين 11 ميكرولترات من الجيش الملكي النيبالي مع 1.5 ميكرولترات من ATP الحرة 10X T4RNA تفاعل عازلة, ميكرولتر واحد من البولي ايثيلين جلايكول, و 0.5 ميكرولترات من ثلاثة رابط رئيس.سخني العينات على درجة حرارة 95 درجة مئوية على دراجة حرارة لمدة 30 إلى 40 ثانية، يليها التبريد على الجليد لمدة دقيقة واحدة. إضافة ميكرولتر واحد من T4RNA ligase اثنين واحتضان رد فعل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. في حين أن العينات هي احتضان، صب 15٪ polyacyrilamide هلام بين 0.8 ملليمتر لوحات زجاجية منفصلة في يلقي البلاستيك وإدراج مشط.عندما يكون هلام قد توطدت، إضافة 0.5 5X TBE إلى الخزان والماصات بقوة لغسل آبار اليوريا المتبقية. بعد تشغيل ما قبل هلام البولي أكريلاميد لمدة 25 دقيقة في 375 فولت، تحميل العينات ترك على الأقل حارة واحدة في بين كل عينة. تحميل 20 ميكرولترات من مجموعتين على الأقل من علامات في نمط غير متناظرة لتتبع اتجاه هلام وتشغيل الجل في ثابت 375 فولت.بعد 15 دقيقة، وزيادة إلى ثابت 425 فولت لبقية المدى وتشغيل هلام لمدة ساعتين تقريبا. في نهاية الشوط، استخدم فاصل لوحة لإزالة الجل من لوحات الزجاج ووضع الجل على حامي صفحة بلاستيكية. تمييع خمسة ميكرولترات من بروميد الإثيديوم في 500 ميكرولترات من الماء المقطر وإضافة الصبغة إلى الممرات علامة فوق أعلى علامة زرقاء خفيفة.بعد ذلك ، استخدم شفرة حلاقة نظيفة لقطع المواد الهلامية من أعلى إلى علامة أدنى في كل حارة تحت الأشعة فوق البنفسجية ونقل القطع إلى أربعة في أربعة سنتيمترات مربعة من مختبر ختم الفيلم. قطع هلام مع حوالي ثلاث قطع أفقيا واثنين من التخفيضات عموديا لإنتاج 12 مربعات صغيرة. إضافة 400 ميكرولترات من 0.3 كلوريد الصوديوم المولر على فيلم الختم وتوجيه القطع هلام في أنابيب سيليكون 1.5 ملليلتر.تهيج العينات على nutator في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، نقل 400 ميكرولترات من كل اابر إلى أنابيب جديدة. إضافة ملليلتر واحد من 100٪ الإيثانول وميكر واحد من 15 ملليغرام لكل ملليلتر الجليكوجين شارك في الانتقطار لكل أنبوب.ثم تخزين الأنابيب في ناقص 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. لخمسة ربط رابط رئيس الوزراء، تدور أولا أسفل العينات المذابة وإعادة تعليق الكريات في الماء. بعد ذلك، إضافة 0.5 ميكرولترات من 100 ميكرومولار خمسة رابط رئيس الوزراء، وميكر واحد من T4RNA العازلة الليطالية، وميكر واحد من ATP 10 ملليمولار، وميكر واحد من البولي ايثيلين غليكول لكل عينة.سخني التفاعلات عند 90 درجة مئوية لمدة 30 ثانية قبل وضعها على الجليد. ثم إضافة ميكرولتر واحد من T4RNA ligase واحد لكل أنبوب واحتضان ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. للنسخ العكسي، وجمع العينات عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه الهواء المجفف في 8.25 ميكرولترات من المياه الحرة النوى.إضافة 0.5 ميكرولتررس من 100 ميكرومولار عكس النص الأساسي و5 microliters من 2X عكس مزيج رد فعل transcriptase من مجموعة تخليق الحمض النووي التكميلية. بعد ثلاث دقائق في 42 درجة مئوية، إضافة 1.5 ميكرولترات من 10X عكس الإنزيم نسخة إلى كل عينة لاحتضان 30 دقيقة في 42 درجة مئوية في ثيرموساير. بعد تحييد, إعداد تفاعل PCR مع 29.5 ميكرولترتر من الماء، وخمسة ميكرولترات من 10X طقطق العازلة، وميكر واحد من ثلاثي الفوسفات النيوكليوسيد، واثنين من microliters من 25 التمهيدي إلى الأمام، واثنين من microliters من 25 التمهيدي العكسي micromolar، 0.5 microlits من البوليميراز التقي، و 10 ميكرولترات من الحمض النووي المكامل عكس.ثم تشغيل اثنين من ردود الفعل PCR. لتنقية جل agarose، إعداد جل agarose 4٪ مع أغاروز منخفض الذوبان وتحميل 40 ميكرولترات أو أكثر من المنتج PCR على هلام مع صبغة التحميل و 100 زوج قاعدة و 25 علامات حجم زوج قاعدة. بعد تشغيل هلام، وقطع الفرقة فوق 125 قاعدة زوج الفرقة واستخدام مجموعة استخراج هلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.هزة لإذابة شريط هلام في المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة قبل استخدام المعدات المناسبة لتحديد مكتبة التسلسل النهائي. ثم استخدم أدوات المعلوماتية الحيوية المفتوحة المصدر المناسبة لتحليل بيانات التسلسل. في هذا التفاعل PCR تمثيلي على هلام agarose منخفضة تذوب، يمكن ملاحظة الحصول على المنتج المستنسخة الصحيحة بالمقارنة مع المنتج رابط رابط التي تم الحصول عليها والعينات غير المشبعة مقابل المشبعة.بعد المحاذاة إلى دبابيس الشعر ميكرورنا الإنسان، يمكن ملاحظة توافق قوي بين ميكرورنا قراءة التهم في كل تكرار. تم اكتشاف ما مجموعه 306 نوع من أنواع ميكرورنا مع أكبر عدد من الخرائط لقراءة ميكرورنا 122. من المهم أن نتذكر أن قطع المواد الهلامية في الحجم المناسب لتمكين الانتعاش دقيقة من microRNAs.بعد تسلسل microRNAs ، يمكن للمستخدمين تطبيق تحليل المعلوماتية الحيوية لتوصيف توزيع microRNAs داخل أنسجتهم ذات الاهتمام. وقد استخدمت هذه التقنية لتحديد كيفية معالجة الميكروبات والمغذيات والمغذيات الدقيقة التي يتم تغييرها في بعض أنواع السرطان. تأكد من ممارسة العناية عند التعامل مع بروميد الإثيديوم وعند النظر إلى المواد الهلامية تحت الضوء فوق البنفسجي.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Genetics

Unit 1

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

عزل الحمض النووي قوية وبناء مكتبة التسلسل الفائق للعينات دار النباتات

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

استهدفت تسلسل الجيل القادم وأنابيب المعلوماتية الحيوية لتقييم المحددات الوراثية للمرض الدستورية

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

الكشف عن حالة نادرة باستخدام الحمض النووي لتصحيح الخطأ وتسلسل الحمض النووي الريبي

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

السريع وخط أنابيب سهلة "توليد طفرات نقطة الجينوم" في C. ايليجانس باستخدام كريسبر/Cas9 "ريبونوكليوبروتينس"

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

معالجات الجينوم الإدخال تسلسل إعداد مكتبة من عينة تارديجرادي واحد

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

عزل، وتسلسلها، وتحليل MicroRNAs خارج الخلية من الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

تسلسل mRNA من الدم الكامل باستخدام التسلسل نانو

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

تحليلات البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي باستخدام قاعدة البيانات أوبينبروت لكشف النقاب عن البروتينات رواية مترجمة من إطارات القراءة المفتوحة غير متعارف عليه

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...