Name: a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools
Uploaded: 2019-08-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

Nous tenons à remercier les membres des laboratoires d'Andrew Fire et de Mark Kay pour leurs conseils et leurs suggestions.

Les expériences sur les animaux ont été autorisées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Washington.
Préparation de la petite bibliothèque d'ARN
1. Isolation de l'ARN
<ol><li>Isolez l'ARN d'une source biologique à l'aide d'un réactif d'isolement standard de l'ARN, ou d'un kit qui enrichit les microARN. Pour les tissus, il est préférable de commencer par des échantillons co...

<ol>
	<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+MicroRNAs.">Metazoan MicroRNAs.</a> Cell. 173 (1), 20-51 (2018).</li><li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+class+of+tiny+RNAs+with+probable+regulatory+roles+in+Caenorhabditis+elegans.">An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li><li>Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+small+RNAs+in+animals.">Biogenesis of small RNAs in animals.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loop+position+of+shRNAs+and+pre-miRNAs+is+critical+for+the+accuracy+of+dicer+processing+in+vivo.">The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo.</a> Cell. 151 (4), 900-911 (2012).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-induced+hepatotoxicity+results+from+loss+of+the+first+synthesized+isoform+of+microRNA-122+in+mice.">RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice.</a> Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+removal+in+the+liver+activates+imprinted+microRNAs+and+enables+more+effective+microRNA-mediated+gene+repression.">miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression.</a> Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+Registry.">The microRNA Registry.</a> Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).</li><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).</li><li>Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sailfish+enables+alignment-free+isoform+quantification+from+RNA-seq+reads+using+lightweight+algorithms.">Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Small+RNA+NGS+Libraries+from+Biofluids.">Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids.</a> Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).</li><li>Yamane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hepatitis+C+virus+RNA+target+site+selection+and+host+factor+activities+of+naturally+occurring+miR-122+3+variants.">Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).</li><li>Giraldez, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+multi-center+assessment+of+small+RNA-seq+methods+for+quantitative+miRNA+profiling.">Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling.</a> Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).</li><li>Yeri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+small+RNASeq+library+preparation+kits+using+low+input+RNA.">Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA.</a> BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).</li><li>Coenen-Stass, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methodologies+for+microRNA+biomarker+detection+by+next+generation+sequencing.">Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing.</a> RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).</li><li>Baran-Gale, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+Bias+in+Small+RNA+Library+Preparation+for+Sequencing:+A+New+Protocol+Recovers+MicroRNAs+that+Evade+Capture+by+Current+Methods.">Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods.</a> Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+the+microRNA+cluster+at+the+Dlk1-Dio3+locus+in+lung+adenocarcinoma.">Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma.</a> Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).</li><li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Normalization+Strategies+for+MicroRNA+Quantification.">Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification.</a> Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).</li><li>Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+RNA+ligase+2+truncated+active+site+mutants:+improved+tools+for+RNA+analysis.">T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis.</a> BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).</li><li>Chiang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes &amp; Development. 24 (10), 992-1009 (2010).</li><li>Fromm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Uniform+System+for+the+Annotation+of+Vertebrate+microRNA+Genes+and+the+Evolution+of+the+Human+microRNAome.">A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome.</a> Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).</li></ol>

Malgré l'identification des microARN il y a plus de 20 ans13, le processus de séquençage des microARN reste laborieux et nécessite des équipements spécialisés, empêchant les laboratoires d'adopter régulièrement des protocoles internes14. D'autres techniques peuvent évaluer simultanément les microARN, comme les microréseaux d'ARN et les panneaux d'expression multiplexés; cependant, ces approches sont limitées en ce qu'elles ne quantifient que les microARN pré...

Découverte pour la première fois en 19931, on estime aujourd'hui que près de 2000 microARN sont présents dans le génome humain2. Les microARN sont de petits ARN non codants qui sont généralement 21-24 nucléotides de long. Ils sont des régulateurs post-transcriptionnels de l'expression génique, souvent liés à des sites complémentaires dans la région 3 non traduites (3-UTR) des gènes cibles pour réprimer l'expression des protéines et dégrader l'ARNm. La quantification des microARN peut donner un aperçu précieux de l'expression des gènes et plusieurs protocoles ont été développés à cette fin3.
Nous avons développé un protocole défini, reproductible et de longue date pour le séquençage de l'ARN, et pour l'analyse des lectures normalisées à l'aide d'outils de bioinformatique open source. Fait important, notre protocole permet l'identification simultanée des microARN endogènes et des constructions exogènes livrées qui produisent des espèces de forme microARN, tout en minimisant les lectures de cette carte à d'autres petites espèces d'ARN, y compris les ARN ribosomal ( rRNAs), transférer les petits ARN dérivés de l'ARN (tsRNAs), les petits ARN dérivés de la répétition et les produits de dégradation de l'ARNm. Heureusement, les microARN sont 5 phosphorylés et 2-3 hydroxylé4 , une caractéristique qui peut être exploitée pour les séparer de ces autres petits ARN et les produits de dégradation de l'ARNm. Plusieurs options commerciales existent pour le clonage et le séquençage de microARN qui sont souvent plus rapides et plus faciles au multiplex ; cependant, la nature exclusive des réactifs de kit et leurs modifications fréquentes rendent difficile la comparaison des exécutions d'échantillon. Notre stratégie optimise la collecte de la taille correcte des microARN par des étapes de purification de l'acrylamide et du gel d'agarose. Dans ce protocole, nous décrivons également une procédure pour aligner la séquence se lit aux microARN à l'aide d'outils open source. Cet ensemble d'instructions sera particulièrement utile pour les utilisateurs d'informatique novices, que notre méthode de préparation de bibliothèque ou une méthode commerciale soit utilisée.
Ce protocole a été utilisé dans plusieurs études publiées. Par exemple, il a été utilisé pour identifier le mécanisme par lequel l'enzyme Dicer fend de petits ARN en épingle à cheveux à une distance de deux nucléotides de la boucle interne de la structure de la boucle de tige - la soi-disant "règle de comptage de boucle"5. Nous avons également suivi ces méthodes pour identifier l'abondance relative des petits ARN en épingle à cheveux livrés (ardendain) exprimés à partir de vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV), afin d'identifier le seuil d'expression de l'ARNc qui peut être toléré avant le foie toxicité associée à l'expression shRNA excessive6. En utilisant ce protocole, nous avons également identifié des microARN dans le foie qui répondent à l'absence de microARN-122 - un microARN hépatique très exprimé - tout en caractérisant le modèle de dégradation de ce microARN7. Parce que nous avons utilisé notre protocole de façon cohérente dans de nombreuses expériences, nous avons été en mesure d'observer les préparations d'échantillons longitudinalement, et de voir qu'il n'y a pas d'effets de lots perceptibles.
En partageant ce protocole, notre objectif est de permettre aux utilisateurs de générer une quantification reproductible et de haute qualité des microARN dans pratiquement n'importe quelle ligne de tissus ou de cellules, en utilisant des équipements et des réactifs abordables, et des outils de bioinformatique gratuits.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19:1 bis-acrylamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 bp DNA step ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phenol/chloroform</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide RNA loading dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Buffer II</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Blue color helps in visualizing pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>45-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRVana microRNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>For generating small RNA sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusieve low-melting agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory sealing film)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-ethylene glycol 8000</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included with M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>For quantifying DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base pH 7.5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal miRNA cloning linker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools

On pense que la moitié de toutes les transcriptions humaines sont réglementées par des microARN. Par conséquent, la quantification de l'expression des microARN peut révéler des mécanismes sous-jacents dans les états de la maladie et fournir des cibles thérapeutiques et des biomarqueurs. Ici, nous détaillons comment quantifier avec précision les microARN. En bref, cette méthode décrit l'isolation des microARN, leur ligature à des adaptateurs adaptés au séquençage à haut débit, amplifiant les produits finaux et préparant une bibliothèque d'échantillons. Ensuite, nous expliquons comment aligner les lectures de séquençage obtenues sur les épingles à cheveux microARN, et quantifier, normaliser et calculer leur expression différentielle. Polyvalente et robuste, cette analyse combinée du flux de travail expérimental et de la bioinformatique permet aux utilisateurs de commencer par l'extraction des tissus et de terminer avec la quantification des microARN.

Schéma des étapes de la préparation de la bibliothèque Un schéma global de petite extraction, de séquençage et d'alignement de l'ARN est décrit à la figure 2. Des échantillons de foie d'un mâle et d'une souris femelle ont été recueillis et congelés dans de l'azote liquide. L'ARN total a été extrait et évalué pour la qualité et la concentration.
Le s?...

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A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Ici, nous décrivons une stratégie étape par étape pour isoler les petits ARN, enrichir les microARN et préparer des échantillons pour le séquençage à haut débit. Nous décrivons ensuite comment traiter les lectures de séquences et les aligner sur les microARN, à l'aide d'outils open source.

Un pipeline complet pour isoler et séquencer les microARN et les analyser à l'aide d'outils Open Source

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Nous avons développé un protocole défini, reproductible et de longue date pour le séquençage de petits ARN et pour l’analyse des lectures normalisées à l’aide d’outils bioinformatiques opensource. Les principaux avantages de notre stratégie sont qu’elle recueille avec précision les microARN par purification de gel et que l’analyse bioinformatique peut être appliquée indépendamment de la façon dont les microARN sont collectées. Le séquençage à haut débit des microARN peut révéler un aperçu des mécanismes de la maladie, du traitement des microARN et de la quantification précise des approches de thérapie génique qui fournissent de petits ARN.Assurez-vous de travailler dans un environnement exempt de RNase et de garder tous les produits ARN sur la glace tout au long de la procédure. La visualisation des étapes de coupe du gel aidera les téléspectateurs à identifier la taille correcte des produits nécessaires pour les applications en aval. Pour trois ligatures d’adaptateurs de premier plan, combinez 11 microlitres d’ARN avec 1,5 microlitres de tampon de réaction de ligase 10X T4RNA libre de l’ATP, un microlitre de polyéthylène glycol et 0,5 microlitres de trois maillons principaux.Chauffer les échantillons à 95 degrés Celsius sur un thermocycleur pendant 30 à 40 secondes, puis les refroidir sur la glace pendant une minute. Ajouter un microlitre de ligase T4RNA deux et incuber la réaction à température ambiante pendant deux heures. Pendant que les échantillons couvent, versez un gel polyacyrilamide de 15 % entre 0,8 millimètre de plaques de verre séparées dans un plâtre en plastique et insérez un peigne.Lorsque le gel s’est solidifié, ajouter 0,5 5 X TBE au réservoir et pipette vigoureusement pour laver les puits d’urée résiduelle. Après avoir pré-couru le gel de polyacrylamide pendant 25 minutes à 375 volts, chargez les échantillons en laissant au moins une voie entre chaque échantillon. Chargez 20 microlitres d’au moins deux ensembles de marqueurs dans un modèle asymétrique pour garder une trace de l’orientation du gel et faire fonctionner le gel à une constante 375 volts.Après 15 minutes, augmenter à une constante 425 volts pour le reste de la course et faire fonctionner le gel pendant environ deux heures. À la fin de la course, utilisez un séparateur de plaque pour enlever le gel des plaques de verre et placer le gel sur un protecteur de page en plastique. Diluer cinq microlitres de bromure d’éthidium dans 500 microlitres d’eau distillée et ajouter le colorant sur les voies marqueurs juste au-dessus du marqueur bleu clair supérieur.Ensuite, utilisez une lame de rasoir propre pour couper les gels du marqueur supérieur au marqueur inférieur dans chaque voie sous la lumière ultraviolette et transférer les morceaux à un carré de quatre par quatre centimètres de film d’étanchéité de laboratoire. Couper le gel avec environ trois coupes horizontalement et deux coupes verticalement pour produire 12 petits carrés. Ajouter 400 microlitres de chlorure de sodium molaire de 0,3 molaire sur le film d’étanchéité et guider les morceaux de gel dans des tubes siliconés de 1,5 millilitre.Agiter les échantillons sur un nutator à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, transférez 400 microlitres de chaque supernatant dans de nouveaux tubes. Ajouter un millilitre de 100% d’éthanol et un microlitre de 15 milligrammes par millilitre glycogène co-précipitant par tube.Ensuite, conservez les tubes à moins 80 degrés Celsius pendant une heure. Pour cinq ligatures linker premier, d’abord tourner vers le bas les échantillons décongelés et resuspendre les granulés dans l’eau. Ensuite, ajoutez 0,5 microlitres de 100 micromolaires cinq linker principaux, un microlitre de tampon ligase T4RNA, un microlitre de 10 millimillons ATP, et un microlitre de polyéthylène glycol à chaque échantillon.Chauffer les réactions à 90 degrés Celsius pendant 30 secondes avant de les placer sur la glace. Ajouter ensuite un microlitre de ligase T4RNA à chaque tube et incuber les réactions à température ambiante pendant deux heures. Pour la transcription inverse, recueillir les échantillons par centrifugation et réutiliser la pastille séchée à l’air dans 8,25 microlitres d’eau sans nucléase.Ajoutez 0,5 microlitres de 100 amorces de transcriptase inverse micromolaire et cinq microlitres de mélange de réaction de transcriptase inverse de 2X à partir d’un kit complémentaire de synthèse d’ADN. Après trois minutes à 42 degrés Celsius, ajouter 1,5 microlitres d’enzyme de transcriptase inverse 10X à chaque échantillon pour une incubation de 30 minutes à 42 degrés Celsius dans un thermocyclre. Après neutralisation, préparer une réaction PCR avec 29,5 microlitres d’eau, cinq microlitres de tampon 10X taq, un microlitre de triphosphate nucléoside, deux microlitres de 25 amorces avant micromolaires, deux microlitres de 25 amorces inverses micromolaires, 0,5 microlitres de polymétéase taq et 10 microlitres de l’ADN complémentaire transcrit inversé.Ensuite, exécutez deux réactions PCR. Pour la purification du gel d’agarose, préparez un gel agarose de 4 % avec une agarose à faible fond et chargez 40 microlitres ou plus du produit PCR sur le gel avec colorant de chargement et 100 marqueurs de base et 25 marqueurs de taille paire de base. Après avoir fait fonctionner le gel, couper la bande au-dessus de la bande de 125 paires de base et utiliser un kit d’extraction de gel selon les instructions du fabricant.Agiter pour dissoudre la bande de gel dans le tampon à température ambiante avant d’utiliser l’équipement approprié pour quantifier la bibliothèque de séquence finale. Utilisez ensuite les outils bioinformatiques opensource appropriés pour analyser les données de séquence. Dans cette réaction représentative de PCR sur le gel d’agarose de basse fonte, l’acquisition du produit cloné correct comparé au produit obtenu de linker linker et aux échantillons insaturés contre saturés peut être observée.Après l’alignement sur les épingles à cheveux microARN humaines, une forte concordance entre les comptes de lecture microARN dans chaque réplique peut être observée. Un total de 306 espèces de microARN ont été détectées avec le plus grand nombre de lecture cartographiées à microARN 122. Il est important de se rappeler de couper les gels à la taille appropriée pour permettre une récupération précise des microARN.Après le séquençage des microARN, les utilisateurs peuvent appliquer une analyse bioinformatique pour caractériser la distribution des microARN dans leurs tissus d’intérêt. Cette technique a été utilisée pour identifier comment les microARN sont traités et quels ensembles de microARN sont modifiés dans certains cancers. Assurez-vous d’exercer des soins lors de la manipulation du bromure d’éthidium et lorsque vous regardez les gels sous la lumière ultraviolette.

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