Name: a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools
Uploaded: 2019-08-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

Wir danken den Mitgliedern der Laboratorien von Andrew Fire und Mark Kay für die Anleitung und Anregungen.

Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Washington genehmigt.
Kleine RNA-Bibliotheksvorbereitung
1. RNA-Isolation
<ol><li>Isolieren Sie RNA aus einer biologischen Quelle mit einem Standard-RNA-Isolationsreagenz oder einem Kit, das für microRNAs anreichert. Für Gewebe ist es am besten, mit Proben zu beginnen, die in flüssigem Stickstoff eingefroren und zu einem Pulver gemahlen werden, ...

<ol>
	<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+MicroRNAs.">Metazoan MicroRNAs.</a> Cell. 173 (1), 20-51 (2018).</li><li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+class+of+tiny+RNAs+with+probable+regulatory+roles+in+Caenorhabditis+elegans.">An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li><li>Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+small+RNAs+in+animals.">Biogenesis of small RNAs in animals.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loop+position+of+shRNAs+and+pre-miRNAs+is+critical+for+the+accuracy+of+dicer+processing+in+vivo.">The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo.</a> Cell. 151 (4), 900-911 (2012).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-induced+hepatotoxicity+results+from+loss+of+the+first+synthesized+isoform+of+microRNA-122+in+mice.">RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice.</a> Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+removal+in+the+liver+activates+imprinted+microRNAs+and+enables+more+effective+microRNA-mediated+gene+repression.">miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression.</a> Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+Registry.">The microRNA Registry.</a> Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).</li><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).</li><li>Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sailfish+enables+alignment-free+isoform+quantification+from+RNA-seq+reads+using+lightweight+algorithms.">Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Small+RNA+NGS+Libraries+from+Biofluids.">Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids.</a> Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).</li><li>Yamane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hepatitis+C+virus+RNA+target+site+selection+and+host+factor+activities+of+naturally+occurring+miR-122+3+variants.">Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).</li><li>Giraldez, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+multi-center+assessment+of+small+RNA-seq+methods+for+quantitative+miRNA+profiling.">Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling.</a> Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).</li><li>Yeri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+small+RNASeq+library+preparation+kits+using+low+input+RNA.">Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA.</a> BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).</li><li>Coenen-Stass, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methodologies+for+microRNA+biomarker+detection+by+next+generation+sequencing.">Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing.</a> RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).</li><li>Baran-Gale, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+Bias+in+Small+RNA+Library+Preparation+for+Sequencing:+A+New+Protocol+Recovers+MicroRNAs+that+Evade+Capture+by+Current+Methods.">Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods.</a> Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+the+microRNA+cluster+at+the+Dlk1-Dio3+locus+in+lung+adenocarcinoma.">Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma.</a> Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).</li><li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Normalization+Strategies+for+MicroRNA+Quantification.">Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification.</a> Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).</li><li>Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+RNA+ligase+2+truncated+active+site+mutants:+improved+tools+for+RNA+analysis.">T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis.</a> BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).</li><li>Chiang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes &amp; Development. 24 (10), 992-1009 (2010).</li><li>Fromm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Uniform+System+for+the+Annotation+of+Vertebrate+microRNA+Genes+and+the+Evolution+of+the+Human+microRNAome.">A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome.</a> Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).</li></ol>

Trotz der Identifizierung von microRNAs vor über 20 Jahren13, bleibt der Prozess der microRNA-Sequenzierung mühsam und erfordert spezielle Ausrüstung, die Laboratorien daran hindert, routinemäßig interne Protokolle zu übernehmen14. Andere Techniken können microRNAs gleichzeitig bewerten, wie microRNA-Mikroarrays und Multiplexexpressionspanels; Diese Ansätze sind jedoch insofern begrenzt, als sie nur die in ihrem Prüfpunkt vorhandenen microRNAs quantifizieren. Aus d...

Erstmals 19931 entdeckt, wird heute geschätzt, dass fast 2000 microRNAs im menschlichen Genom2vorhanden sind. MicroRNAs sind kleine nicht-kodierende RNAs, die in der Regel 21-24 Nukleotide lang sind. Sie sind posttranskriptielle Regulatoren der Genexpression, die oft an komplementäre Stellen in der 3-unübersetzten Region (3-UTR) von Zielgenen binden, um die Proteinexpression zu unterdrücken und mRNA zu degradieren. Die Quantifizierung von microRNAs kann wertvolle Einblicke in die Genexpression geben und zu diesem Zweck wurden mehrere Protokolle entwickelt3.
Wir haben ein definiertes, reproduzierbares und langjähriges Protokoll für die kleine RNA-Sequenzierung und für die Analyse normalisierter Lesevorgänge mit Open-Source-Bioinformatik-Tools entwickelt. Wichtig ist, dass unser Protokoll die gleichzeitige Identifizierung sowohl endogenes microRNAs als auch exogen gelieferter Konstrukte ermöglicht, die microRNA-ähnliche Arten produzieren, während gleichzeitig Lesevorgänge, die auf andere kleine RNA-Arten, einschließlich ribosomaler RNAs ( ( rRNAs), übertragen RNA-abgeleitete kleine RNAs (tsRNAs), wiederholte kleine RNAs und mRNA-Abbauprodukte. Glücklicherweise sind microRNAs 5-phosphorylierte und 2-3 hydroxylierte4, eine Funktion, die genutzt werden kann, um sie von diesen anderen kleinen RNAs und mRNA Abbauprodukten zu trennen. Für das Klonen und Sequenzieren von microRNA gibt es mehrere kommerzielle Optionen, die oft schneller und einfacher zu multiplexen sind. Die proprietäre Natur von Kit-Reagenzien und deren häufige Modifikationen machen den Vergleich von Probenläufen jedoch schwierig. Unsere Strategie optimiert das Sammeln nur der richtigen Größe von microRNAs durch Acrylamid- und Agarose-Gel-Reinigungsschritte. In diesem Protokoll beschreiben wir auch ein Verfahren zum Ausrichten von Sequenzlesevorgängen an microRNAs mithilfe von Open-Source-Tools. Dieser Satz von Anweisungen wird besonders nützlich für Unerfahrene Informatik-Benutzer sein, unabhängig davon, ob unsere Bibliotheksvorbereitungsmethode oder eine kommerzielle Methode verwendet wird.
Dieses Protokoll wurde in mehreren veröffentlichten Studien verwendet. Zum Beispiel wurde es verwendet, um den Mechanismus zu identifizieren, durch den das Dicer-Enzym kleine Haarnadel-RNAs in einem Abstand von zwei Nukleotiden von der internen Schleife der Stammschleifenstruktur - der sogenannten "Schleifenzählregel"5- spaltet. Wir folgten auch diesen Methoden, um die relative Häufigkeit der gelieferten kleinen Haarnadel-RNAs (shRNA) zu identifizieren, die aus rekombinanten adenoassoziierten viralen Vektoren (rAAVs) exprimiert wurden, um den Schwellenwert der shRNA-Expression zu identifizieren, der vor der Leber toleriert werden kann. Toxizität im Zusammenhang mit überschüssiger shRNA-Expression6. Mit diesem Protokoll identifizierten wir auch microRNAs in der Leber, die auf das Fehlen von microRNA-122 - einer hochgradig exprimierenden leberischen microRNA - reagieren und gleichzeitig das Abbaumuster dieser microRNA7charakterisieren. Da wir unser Protokoll in zahlreichen Experimenten konsequent eingesetzt haben, konnten wir Probenpräparate längs beobachten und feststellen, dass es keine erkennbaren Chargeneffekte gibt.
Bei der Gemeinsamen Nutzung dieses Protokolls ist es unser Ziel, den Anwendern die Möglichkeit zu geben, eine qualitativ hochwertige, reproduzierbare Quantifizierung von microRNAs in praktisch jeder Gewebe- oder Zelllinie mit erschwinglichen Geräten und Reagenzien und kostenlosen Bioinformatik-Tools zu generieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19:1 bis-acrylamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 bp DNA step ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phenol/chloroform</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide RNA loading dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Buffer II</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Blue color helps in visualizing pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>45-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRVana microRNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>For generating small RNA sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusieve low-melting agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory sealing film)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-ethylene glycol 8000</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included with M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>For quantifying DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base pH 7.5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal miRNA cloning linker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools

Die Hälfte aller menschlichen Transkripte wird angenommen, dass durch microRNAs reguliert werden. Daher kann die Quantifizierung der microRNA-Expression zugrunde liegende Mechanismen in Krankheitszuständen aufdecken und therapeutische Ziele und Biomarker bereitstellen. Hier erfahren Wir, wie microRNAs genau quantifiziert werden können. Kurz beschrieben diese Methode die Isolierung von microRNAs, die Anlage artizieren sie an Adapter, die für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz geeignet sind, die Erweiterung der Endprodukte und das Vorbereiten einer Beispielbibliothek. Anschließend erklären wir, wie die erhaltenen Sequenzierungs-Lesevorgänge an microRNA-Haarnadeln ausgerichtet und ihre Differentialexpression quantifiziert, normalisiert und berechnet werden. Vielseitig und robust, diese kombinierte experimentelle Workflow-und bioinformatische Analyse ermöglicht es Benutzern, mit der Gewebeextraktion zu beginnen und mit microRNA-Quantifizierung zu beenden.

Schemader der Schritte bei der Bibliotheksvorbereitung Abbildung 2ist ein Gesamtschema der Extraktion, Sequenzierung und Ausrichtung kleiner RNA dargestellt. Leberproben von einem Mann und einer weiblichen Maus wurden gesammelt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die gesamte RNA wurde extrahiert und auf Qualität und Konzentration bewertet.
Kleine RNA-Sequenzieru...

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A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Hier beschreiben wir eine schrittweise Strategie zur Isolierung kleiner RNAs, zur Anreicherung von microRNAs und zur Vorbereitung von Proben für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Anschließend wird beschrieben, wie Sequenzlesevorgänge verarbeitet und mithilfe von Open-Source-Tools an microRNAs ausgerichtet werden.

Eine vollständige Pipeline zum Isolieren und Sequenzieren von MicroRNAs und deren Analyse mithilfe von Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Wir haben ein definiertes, reproduzierbares und langjähriges Protokoll für die kleine RNA-Sequenzierung und zur Analyse normalisierter Lesevorgänge mit Open-Source-Bioinformatik-Tools entwickelt. Die Hauptvorteile unserer Strategie sind, dass sie microRNAs durch Gelreinigung genau sammelt und dass die Bioinformatik-Analyse unabhängig davon angewendet werden kann, wie die microRNAs gesammelt werden. Die hohe Durchsatzsequenzierung von microRNAs kann Einblicke in Krankheitsmechanismen, die Verarbeitung von microRNAs und die genaue Quantifizierung von Gentherapieansätzen, die kleine RNAs liefern, aufzeigen.Achten Sie darauf, in einer RNase freien Umgebung zu arbeiten und alle RNA-Produkte während des gesamten Verfahrens auf Eis zu halten. Die Visualisierung der Gelschneideschritte hilft den Betrachtern, die richtige Größe der Produkte zu ermitteln, die für nachgelagerte Anwendungen erforderlich sind. Kombinieren Sie für drei Prime-Adaptor-Ligation11 Mikroliter RNA mit 1,5 MikroliterAT-freiem 10X T4RNA-Ligase-Reaktionspuffer, einem Mikroliter Polyethylenglykol und 0,5 Mikrolitern dreier Hauptlinker.Erhitzen Sie die Proben bei 95 Grad Celsius auf einem Thermocycler für 30 bis 40 Sekunden, gefolgt von einer Abkühlung auf Eis für eine Minute. Fügen Sie einen Mikroliter T4RNA Ligase zwei hinzu und inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Während die Proben inkubieren, gießen Sie ein 15%polyacyrilamidgel zwischen 0,8 Millimeter getrennten Glasplatten in einen Kunststoffguss und legen Sie einen Kamm ein.Wenn das Gel erstarrt ist, 0,5 5X TBE in den Tank und Pipette kräftig hinzufügen, um die Brunnen von Restharnstoff zu waschen. Nachdem Sie das Polyacrylamid-Gel 25 Minuten lang bei 375 Volt vorlaufen lassen, laden Sie die Proben und lassen Sie dabei mindestens eine Spur zwischen jeder Probe zurück. Laden Sie 20 Mikroliter von mindestens zwei Sätzen von Markern in einem asymmetrischen Muster, um die Gelausrichtung zu verfolgen und das Gel mit konstanten 375 Volt auszuführen.Nach 15 Minuten auf konstante 425 Volt für den Rest des Laufs erhöhen und das Gel für etwa zwei Stunden laufen. Verwenden Sie am Ende des Laufs einen Plattenabscheider, um das Gel von den Glasplatten zu entfernen und das Gel auf einen Kunststoffseitenschutz zu legen. Fünf Mikroliter Ethidiumbromid in 500 Mikroliter destilliertem Wasser verdünnen und den Farbstoff auf die Markerspuren direkt über dem oberen hellblauen Marker geben.Als nächstes verwenden Sie eine saubere Rasierklinge, um die Gele von der oberen zur unteren Markierung in jeder Spur unter ultraviolettem Licht zu schneiden und die Stücke auf ein vier mal vier Zentimeter großes Quadrat Labordichtungsfolie zu übertragen. Schneiden Sie das Gel mit etwa drei Schnitten horizontal und zwei Schnitten vertikal, um 12 kleine Quadrate zu produzieren. 400 Mikroliter 0,3 Mol-Natriumchlorid auf den Dichtfilm geben und die Gelstücke in 1,5 Milliliter silikonisierte Röhren leiten.Die Proben auf einem Nutator bei vier Grad Celsius über Nacht aufmachen. Am nächsten Morgen 400 Mikroliter jedes Überstandes in neue Schläuche übertragen. Fügen Sie einen Milliliter 100% Ethanol und einen Mikroliter von 15 Milligramm pro Milliliter Glykogen Co-Gefälltmirat pro Tube.Dann lagern Sie die Rohre bei minus 80 Grad Celsius für eine Stunde. Für fünf Hauptlinker-Ligation, drehen Sie zuerst die aufgetauten Proben und setzen Sie die Pellets in Wasser wieder aus. Als nächstes fügen Sie 0,5 Mikroliter von 100 Mikromolaren fünf Prime Linker, einen Mikroliter T4RNA Ligase Puffer, einen Mikroliter von 10 Millimolar ATP und ein Mikroliter Polyethylenglykol zu jeder Probe hinzu.Erhitzen Sie die Reaktionen bei 90 Grad Celsius für 30 Sekunden, bevor Sie sie auf Eis legen. Dann fügen Sie einen Mikroliter T4RNA Ligase eins zu jeder Röhre und inkubieren die Reaktionen bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Für die umgekehrte Transkription die Proben per Zentrifugation sammeln und das luftgetrocknete Pellet in 8,25 Mikroliter nukleasefreiem Wasser wieder aufhängen.Fügen Sie 0,5 Mikroliter 100 Mikromolar Reverse Transkriptase Primer und fünf Mikroliter 2X Reverse Transkriptase Reaktionsmischung aus einem komplementären DNA-Synthese-Kit. Nach drei Minuten bei 42 Grad Celsius 1,5 Mikroliter 10-faches Reverse-Transkriptase-Enzym zu jeder Probe für eine 30-minütige Inkubation bei 42 Grad Celsius in einem Thermocycler hinzufügen. Nach der Neutralisation eine PCR-Reaktion mit 29,5 Mikroliter Wasser, fünf Mikroliter 10X Taq Puffer, einem Mikroliter Nukleosidtriphosphat, zwei Mikrolitern 25 Mikromolaren-Vorwärtsprimer, zwei Mikroliter 25 Mikromollar-Reverseprimer, 0,5 Mikroliter Taq-Polymerase und 10 Mikroliter der umgekehrten transkribierten komplementären DNA vorbereiten.Führen Sie dann zwei PCR-Reaktionen aus. Für die Agarose-Gel-Reinigung bereiten Sie ein 4%Agarose-Gel mit niedrigschmelzender Agarose vor und laden Sie 40 Mikroliter oder mehr des PCR-Produkts mit Ladefarbstoff und 100 Basispaar- und 25 Basispaar-Größenmarkern auf das Gel. Nach dem Ausführen des Gels schneiden Sie das Band über dem 125 Basispaarband und verwenden Sie ein Gel-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.Schütteln, um das Gelband im Puffer bei Raumtemperatur aufzulösen, bevor Sie die entsprechende Ausrüstung verwenden, um die endgültige Sequenzbibliothek zu quantifizieren. Verwenden Sie dann die entsprechenden OpenSource-Bioinformatik-Tools, um die Sequenzdaten zu analysieren. In dieser repräsentativen PCR-Reaktion auf Niedrigschmelz-Agarorose-Gel kann die Erfassung des richtigen geklonten Produkts im Vergleich zum erhaltenen Linker-Linker-Produkt und ungesättigten im Vergleich zu gesättigten Proben beobachtet werden.Nach der Ausrichtung an menschlichen microRNA-Haarnadeln kann eine starke Übereinstimmung zwischen den microRNA-Lesezahlen in jeder Replikation beobachtet werden. Insgesamt wurden 306 microRNA-Arten mit der größten Anzahl von Lesekarten auf microRNA 122 nachgewiesen. Es ist wichtig, daran zu denken, die Gele in der entsprechenden Größe zu schneiden, um eine genaue Wiederherstellung der microRNAs zu ermöglichen.Nach der Sequenzierung der microRNAs können Anwender eine Bioinformatik-Analyse anwenden, um die Verteilung von microRNAs in ihrem Gewebe von Interesse zu charakterisieren. Diese Technik wurde verwendet, um zu identifizieren, wie microRNAs verarbeitet werden und welche Sätze von microRNAs bei bestimmten Krebsarten verändert werden. Achten Sie darauf, beim Umgang mit dem Ethidiumbromid und beim Betrachten der Gele unter ultraviolettem Licht Vorsicht walten zu lassen.

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Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

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Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

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Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation und Bioinformatik-Pipeline, um genetische Determinanten der konstitutionelle Krankheit zu bewerten

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Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

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A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

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High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

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Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

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Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

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Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen mithilfe der OpenProt-Datenbank zu enthüllen neue Proteine übersetzt aus dem nicht-kanonischen Open Reading Frames

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