Name: a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools
Uploaded: 2019-08-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

ברצוני להודות לחברי המעבדות של אנדרו פייר ומארק קיי להדרכה והצעות.

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש באוניברסיטת וושינגטון.
הכנה לספריית RNA קטנה
1. בידוד RNA
<ol><li>לבודד RNA ממקור ביולוגי באמצעות מגיב רגיל בידוד RNA, או ערכת המעשירה עבור microRNAs. לרקמות, מוטב להתחיל בדגימות שהוקפ...

<ol>
	<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+MicroRNAs.">Metazoan MicroRNAs.</a> Cell. 173 (1), 20-51 (2018).</li><li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+class+of+tiny+RNAs+with+probable+regulatory+roles+in+Caenorhabditis+elegans.">An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li><li>Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+small+RNAs+in+animals.">Biogenesis of small RNAs in animals.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loop+position+of+shRNAs+and+pre-miRNAs+is+critical+for+the+accuracy+of+dicer+processing+in+vivo.">The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo.</a> Cell. 151 (4), 900-911 (2012).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-induced+hepatotoxicity+results+from+loss+of+the+first+synthesized+isoform+of+microRNA-122+in+mice.">RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice.</a> Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+removal+in+the+liver+activates+imprinted+microRNAs+and+enables+more+effective+microRNA-mediated+gene+repression.">miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression.</a> Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+Registry.">The microRNA Registry.</a> Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).</li><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).</li><li>Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sailfish+enables+alignment-free+isoform+quantification+from+RNA-seq+reads+using+lightweight+algorithms.">Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Small+RNA+NGS+Libraries+from+Biofluids.">Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids.</a> Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).</li><li>Yamane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hepatitis+C+virus+RNA+target+site+selection+and+host+factor+activities+of+naturally+occurring+miR-122+3+variants.">Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).</li><li>Giraldez, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+multi-center+assessment+of+small+RNA-seq+methods+for+quantitative+miRNA+profiling.">Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling.</a> Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).</li><li>Yeri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+small+RNASeq+library+preparation+kits+using+low+input+RNA.">Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA.</a> BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).</li><li>Coenen-Stass, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methodologies+for+microRNA+biomarker+detection+by+next+generation+sequencing.">Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing.</a> RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).</li><li>Baran-Gale, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+Bias+in+Small+RNA+Library+Preparation+for+Sequencing:+A+New+Protocol+Recovers+MicroRNAs+that+Evade+Capture+by+Current+Methods.">Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods.</a> Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+the+microRNA+cluster+at+the+Dlk1-Dio3+locus+in+lung+adenocarcinoma.">Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma.</a> Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).</li><li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Normalization+Strategies+for+MicroRNA+Quantification.">Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification.</a> Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).</li><li>Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+RNA+ligase+2+truncated+active+site+mutants:+improved+tools+for+RNA+analysis.">T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis.</a> BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).</li><li>Chiang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes &amp; Development. 24 (10), 992-1009 (2010).</li><li>Fromm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Uniform+System+for+the+Annotation+of+Vertebrate+microRNA+Genes+and+the+Evolution+of+the+Human+microRNAome.">A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome.</a> Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).</li></ol>

למרות הזיהוי של מיקרורונאס לפני יותרמ-20שנה, תהליך הרצף של מיקרואורנה ממשיך להיות מפרך ודורש ציוד מיוחד, מעבדות הידרינג מאימוץ שגרתי של פרוטוקולים בבית14. טכניקות אחרות יכולות להעריך בו את microRNAs, כגון מיקרומערכים ולוחות ביטוי מרושני; עם זאת, גישות אלה מוגבלות בכך ש?...

התגלה לראשונה ב 19931, כעת מוערך כי כמעט 2000 microRNAs נמצאים בגנום האדם2. MicroRNAs הם קטנים שאינם קידוד RNAs כי הם בדרך כלל 21-24 נוקלאוטידים ארוך. הם הרגולטורים לאחר ההמרה של ביטוי גנים, לעתים קרובות מחייב לאתרים המשלימים באזור 3-untranslated (3-UTR) של גנים היעד כדי לדכא את הביטוי חלבון לבזות mRNA. כימות מיקרו-משתמשים יכולים לתת תובנה רבת ערך לביטוי גנים ופרוטוקולים מספר פותחו למטרה זו3.
פיתחנו פרוטוקול מוגדר, מיובן וארוך לרצפי RNA קטנים, ולניתוח קריאות מנורמלות באמצעות כלים ביואינפורמטיקה בקוד פתוח. חשוב מכך, הפרוטוקול שלנו מאפשר את הזיהוי הסימולטני של שני המבנים האנדוגניים והמוצרים שנמסרו באופן שונה המייצרים מינים של מיקרוני אורנה, בעוד הפחתת קריאות המפה למיני RNA קטנים אחרים, כולל RNAs ( rRNAs), העברת מוצרים קטנים (tsRNAs) מתוצרת RNA, מוצרי השפלה קטנים והשפלות של mRNA. למרבה המזל, microRNAs הם 5-זרחליום ו-2-3 הphosphorylated4, תכונה זה יכול להיות ממונפת כדי להפריד אותם ממוצרי rnas קטנים אחרים mrna השפלה. מספר אפשרויות מסחריות קיימות עבור שיבוט ורצפי מיקרואורנה, שלעיתים קרובות מהיר וקל יותר לקולנוע; עם זאת, האופי הקנייני של ריאגנטים קיט ושינויים תכופים שלהם עושה השוואת מדגם פועל מאתגרת. האסטרטגיה שלנו ממטבת איסוף רק את הגודל הנכון של microRNAs באמצעות אקרילide ו agarose ג'ל שלבי הטיהור. בפרוטוקול זה, אנו מתארים גם פרוצדורה ליישור קריאות רצף ל-microRNAs באמצעות כלי קוד פתוח. קבוצה זו של הוראות תהיה שימושית במיוחד עבור משתמשי אינפורמטיקה מתחילים, בין אם שיטת ההכנה של הספרייה שלנו או שיטה מסחרית משמש.
פרוטוקול זה נעשה בשימוש במספר מחקרים שפורסמו. לדוגמה, הוא שימש כדי לזהות את המנגנון שעליו האנזים Dicer משאיר הקטן RNAs במרחק של שני נוקלאוטידים מן הלולאה הפנימית של מבנה לולאה גזע-כביכול "החוק ספירת לולאה"5. אנו גם בעקבות שיטות אלה כדי לזהות את השפע היחסי של משלוח RNAs קטן (מרין) הביע רקומביננטי adeno-וקטורים ויראליים הקשורים (rAAVs), כדי לזהות את הסף של ביטוי מרין כי יכול להיות נסבל לפני הכבד רעילות הקשורה בביטוי שרין עודף6. באמצעות פרוטוקול זה, זיהינו גם את מיקרו-מיקרונאס בכבד המגיבים להיעדר מיקרו-ארנה-122-מיקרומין הכבד מתבטאת במידה רבה, תוך שהיא גם מתכונת השפלה של מיקרוארנה7. מכיוון שאנחנו השתמשנו בפרוטוקול שלנו בעקביות בניסויים רבים, היינו מסוגלים להתבונן בlongitudinally ההכנות למדגם, ולראות שאין תופעות אצווה ניכרת.
בשיתוף פרוטוקול זה, המטרה שלנו היא לאפשר למשתמשים לייצר באיכות גבוהה, כימות הזדהות של Mic, כמעט כל רקמה או קו התא, באמצעות ציוד במחיר סביר, ריאגנטים, וכלים ביואינפורמטיקה חופשית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19:1 bis-acrylamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 bp DNA step ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phenol/chloroform</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide RNA loading dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Buffer II</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Blue color helps in visualizing pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>45-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRVana microRNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>For generating small RNA sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusieve low-melting agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory sealing film)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-ethylene glycol 8000</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included with M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>For quantifying DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base pH 7.5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal miRNA cloning linker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools

חצי מכל התעתיקים האנושיים נחשבים למווסתים על ידי מיקרו-נאס. לפיכך, ביטוי המונח מיקרואורנה יכול לחשוף את המנגנונים הבסיסיים במצבי מחלה ולספק מטרות טיפוליות וביטויים. כאן, אנו מפרטים כיצד לכמת במדויק microRNAs. בקצרה, שיטה זו מתארת את הבידוד של microRNAs, מחברת אותם למתאמים המתאימים לרצפי התפוקה הגבוהה, מגביר את המוצרים הסופיים ומכינים ספריה לדוגמה. לאחר מכן נסביר כיצד ליישר את הרצף המתקבל לסיכות השיער, ולכמת, לנרמל ולחשב את הביטוי הדיפרנציאלי שלהם. מגוונת ואיתנה, תהליך העבודה הניסיוני המשולב וניתוח ביולוגי מאפשר למשתמשים להתחיל בהפקת רקמות ולסיים עם כימות הכמת של מיקרואורנה.

סכמטית של צעדים שמעורבים בהכנה לספרייה סכמטית כללי של חילוץ, רצף ויישור של RNA קטנים מתוארים באיור 2. דגימות כבד מזכר אחד ועכבר נקבה אחת נאספו והצמד קפוא בחנקן נוזלי. סה כ RNA חולץ והוערך עבור איכות וריכוז.
רצפ...

Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה צעד אחר צעד עבור בידוד RNAs קטנים, העשרת עבור microRNAs, והכנת דגימות עבור רצף תפוקה גבוהה. לאחר מכן נתאר כיצד לעבד רצף וליישר אותם ל-microRNAs, באמצעות כלי קוד פתוח.

צינור מלא לבידוד ולרצף של מיקרו-משתמשים וניתוחם באמצעות כלי קוד פתוח

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

פיתחנו פרוטוקול מוגדר, ניתן לשחזור וותיק עבור רצף RNA קטן וניתוח קריאות מנורמלות באמצעות כלים ביואינפורמטיקה opensource. היתרונות העיקריים של האסטרטגיה שלנו הם שהיא אוספת במדויק microRNAs באמצעות טיהור ג'ל, כי ניתוח ביואינפורמטיקה ניתן ליישם ללא קשר לאופן שבו microRNAs נאספים. רצף תפוקה גבוה של microRNAs יכול לחשוף תובנה לתוך מנגנוני המחלה, עיבוד microRNAs, ואת כימות מדויק של גישות ריפוי גנטי המספקים RNAs קטנים.הקפד לעבוד בסביבה חופשית RNase ולשמור את כל מוצרי RNA על קרח לאורך כל ההליך. הדמיה של שלבי חיתוך הג'ל תסייע לצופים לזהות את הגודל הנכון של המוצרים הדרושים ליישומים במורד הזרם. לקבלת שלוש רצועות מתאם עיקריות, שלבו 11 מיקרוליטרים של RNA עם 1.5 מיקרוליטרים של חיץ תגובת רצועות T4RNA ללא ATP, מיקרוליטר אחד של פוליאתילן גליקול ו-0.5 מיקרוליטר של שלושה מקשרים עיקריים.מחממים את הדגימות ב-95 מעלות צלזיוס על תרמוצ'יקלר למשך 30 עד 40 שניות, ולאחר מכן מתקררים על הקרח למשך דקה אחת. מוסיפים מיקרוליטר אחד של T4RNA ligase 2 ו דגירה התגובה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. בזמן שהדגימות דגירה, יוצקים ג'ל פוליאצ'יארילאמיד 15%בין 0.8 מילימטר צלחות זכוכית מופרדות ביצוק פלסטיק ומכניסים מסרק.כאשר הג'ל התגבש, מוסיפים 0.5 5X TBE למיכל ו pipette במרץ לשטוף את בארות של אוריאה שיורית. לאחר טרום הפעלת ג'ל פוליאקרילמיד במשך 25 דקות ב 375 וולט, לטעון את הדגימות משאיר לפחות נתיב אחד בין כל מדגם. לטעון 20 microliters של לפחות שני סטים של סמנים בתבנית סימטרית כדי לעקוב אחר כיוון הג'ל ולהפעיל את הג'ל קבוע 375 וולט.לאחר 15 דקות, להגדיל קבוע 425 וולט לשאר הריצה ולהפעיל את הג'ל במשך כשעתיים. בסוף הריצה, השתמש מפריד צלחת כדי להסיר את הג'ל מצלחות הזכוכית ולה מניחים את הג'ל על מגן דף פלסטיק. מדללים חמישה מיקרוליטרים של אתידיום ברומיד ב-500 מיקרוליטרים של מים מזוקקים ומוסיפים את הצבע לנתיבי הסמן ממש מעל הסמן הכחול בהיר העליון.לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח נקי כדי לחתוך את הג'לים מהסמן העליון לתחתון בכל נתיב תחת אור אולטרה סגול ולהעביר את החלקים לריבוע של ארבעה על ארבעה סנטימטרים של סרט איטום מעבדה. חותכים את הג'ל עם כשלושה חתכים אופקית ושני חתכים אנכית כדי לייצר 12 ריבועים קטנים. הוסף 400 microliters של 0.3 כלוריד נתרן טוחן על סרט האיטום ולהנחות את חתיכות ג'ל לתוך 1.5 צינורות סיליקון מיליליטר.להתסיס את הדגימות על מטורף בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, להעביר 400 microliters של כל על טבעי לצינורות חדשים. מוסיפים מיליליטר אחד של 100%אתנול ומיקרוליטר אחד של 15 מיליגרם למיליליטר גליקוגן קו-ציסטליטר לצינור.ואז לאחסן את הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. עבור חמש רצועות קישור עיקריות, סובבו תחילה את הדגימות המופשרות והתינו מחדש את הכדורים במים. לאחר מכן, להוסיף 0.5 microliters של 100 micromolar חמישה מקשר הממשלה, מיקרוליטר אחד של חיץ ליגות T4RNA, מיקרוליטר אחד של 10 מילימולר ATP, ומיקרוליטר אחד של פוליאתילן גליקול לכל מדגם.מחממים את התגובות ב-90 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות לפני הנחתן על קרח. לאחר מכן מוסיפים מיקרוליטר אחד של T4RNA ligase אחד לכל צינור להדרור את התגובות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. עבור שעתוק הפוך, לאסוף את הדגימות על ידי צנטריפוגה resuspend את האוויר מיובש גלולה ב 8.25 microliters של מים ללא גרעין.הוסף 0.5 microliters של 100 מיקרומולר הפוך תעתיק פריימר וחמישה microliters של 2X הפוך תעתיק תגובה לערבב מערכת סינתזה DNA משלימה. לאחר שלוש דקות ב 42 מעלות צלזיוס, להוסיף 1.5 microliters של אנזים תעתיק הפוך 10X לכל מדגם עבור דגירה 30 דקות ב 42 מעלות צלזיוס בתרמוציקלר. לאחר נטרול, להכין תגובת PCR עם 29.5 microliters של מים, חמישה microliters של חיץ 10X taq, מיקרוליטר אחד של נוקליוסייד טריפוספט, שני microliters של 25 מיקרומולרים קדימה פריימר, שני microliters של פריימר הפוך 25 מיקרומולאר, 0.5 microliters של פולימראז תד, ו 10 microliters של התעתיק ההפוךלאחר מכן הפעל שתי תגובות PCR. לטיהור ג'ל אגרוז, הכינו ג'ל 4% אגרוז עם אגרוז נמס נמוך והעמיסו 40 מיקרוליטר או יותר של מוצר PCR על הג'ל עם צבע טעינה ו-100 סמני בסיס ו-25 סמני גודל של זוג בסיס. לאחר הפעלת הג'ל, חותכים את הרצועה מעל רצועת 125 זוג הבסיס ולהשתמש בערכת מיצוי ג'ל על פי הוראות היצרן.יש לנער כדי להמיס את רצועת הג'ל במאגר בטמפרטורת החדר לפני השימוש בציוד המתאים לכימות ספריית הרצף הסופית. לאחר מכן השתמש בכלי הביואינפורמטיקה המתאימים למקור פתוח כדי לנתח את נתוני הרצף. בתגובת PCR מייצגת זו על ג'ל אגרוז נמס נמוך, ניתן לראות את רכישת המוצר המשוכפל הנכון בהשוואה למוצר מקשר המשיג ודגימות בלתי רוויות לעומת רוויות.לאחר יישור סיכות שיער microRNA אנושי, קונקורדנס חזק בין ספירת קריאת microRNA בכל שכפול ניתן לראות. בסך הכל זוהו 306 מיני מיקרו-רנ"א עם המספר הגדול ביותר של קריאות המיפוי למיקרו-רנ"א 122. חשוב לזכור לחתוך את הג'לים בגודל המתאים כדי לאפשר התאוששות מדויקת של microRNAs.לאחר רצף microRNAs, משתמשים יכולים ליישם ניתוח ביואינפורמטיקה כדי לאפיין את התפלגות microRNAs בתוך הרקמות שלהם עניין. טכניקה זו שימשה כדי לזהות כיצד microRNAs מעובדים אילו קבוצות של microRNAs משתנים בסרטן מסוימים. הקפד לממש טיפול בעת טיפול ברומיד אתידיום וכאשר מסתכלים על הג'לים תחת אור אולטרה סגול.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Genetics

Unit 1

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

ממוקד הדור הבא רצפי וכן ביואינפורמטיקה צינור להעריך גורמים גנטיים של המחלה החוקתי

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו Rna חוץ-תאי של גזע Mesenchymal אנושי

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

ניתוחים פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה משימוש במסד הנתונים OpenProt לחשוף את הרומן חלבונים מתורגם ממסגרות קאנונית קריאה פתוחה

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...