Name: a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools
Uploaded: 2019-08-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

हम मार्गदर्शन और सुझावों के लिए एंड्रयू फायर और मार्क Kay की प्रयोगशालाओं के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा.

पशु प्रयोगों वाशिंगटन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अधिकृत किया गया.
छोटे आरएनए पुस्तकालय की तैयारी
1. आरएनए अलगाव
<ol><li>एक मानक आरएनए अलगा...

<ol>
	<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+MicroRNAs.">Metazoan MicroRNAs.</a> Cell. 173 (1), 20-51 (2018).</li><li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+class+of+tiny+RNAs+with+probable+regulatory+roles+in+Caenorhabditis+elegans.">An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li><li>Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+small+RNAs+in+animals.">Biogenesis of small RNAs in animals.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loop+position+of+shRNAs+and+pre-miRNAs+is+critical+for+the+accuracy+of+dicer+processing+in+vivo.">The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo.</a> Cell. 151 (4), 900-911 (2012).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-induced+hepatotoxicity+results+from+loss+of+the+first+synthesized+isoform+of+microRNA-122+in+mice.">RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice.</a> Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+removal+in+the+liver+activates+imprinted+microRNAs+and+enables+more+effective+microRNA-mediated+gene+repression.">miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression.</a> Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+Registry.">The microRNA Registry.</a> Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).</li><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).</li><li>Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sailfish+enables+alignment-free+isoform+quantification+from+RNA-seq+reads+using+lightweight+algorithms.">Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Small+RNA+NGS+Libraries+from+Biofluids.">Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids.</a> Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).</li><li>Yamane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hepatitis+C+virus+RNA+target+site+selection+and+host+factor+activities+of+naturally+occurring+miR-122+3+variants.">Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).</li><li>Giraldez, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+multi-center+assessment+of+small+RNA-seq+methods+for+quantitative+miRNA+profiling.">Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling.</a> Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).</li><li>Yeri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+small+RNASeq+library+preparation+kits+using+low+input+RNA.">Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA.</a> BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).</li><li>Coenen-Stass, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methodologies+for+microRNA+biomarker+detection+by+next+generation+sequencing.">Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing.</a> RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).</li><li>Baran-Gale, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+Bias+in+Small+RNA+Library+Preparation+for+Sequencing:+A+New+Protocol+Recovers+MicroRNAs+that+Evade+Capture+by+Current+Methods.">Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods.</a> Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+the+microRNA+cluster+at+the+Dlk1-Dio3+locus+in+lung+adenocarcinoma.">Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma.</a> Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).</li><li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Normalization+Strategies+for+MicroRNA+Quantification.">Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification.</a> Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).</li><li>Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+RNA+ligase+2+truncated+active+site+mutants:+improved+tools+for+RNA+analysis.">T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis.</a> BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).</li><li>Chiang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes &amp; Development. 24 (10), 992-1009 (2010).</li><li>Fromm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Uniform+System+for+the+Annotation+of+Vertebrate+microRNA+Genes+and+the+Evolution+of+the+Human+microRNAome.">A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome.</a> Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).</li></ol>

20 साल पहले13से अधिक microRNAs की पहचान के बावजूद , microRNA अनुक्रमण की प्रक्रिया कठिन बनी हुई है और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, नियमित रूप से घर में प्रोटोकॉल14अपनाने से प्रयोगशालाओं में बाधा . अन...

पहली बार 19931में खोज की गई , अब यह अनुमान लगाया गया है कि मानव जीनोम2में लगभग 2000 माइक्रोआरएन मौजूद हैं . MicroRNAs छोटे गैर-कोडिंग आरएनए हैं जो आम तौर पर 21-24 न्यूक्लिओटाइड लंबे होते हैं। वे जीन अभिव्यक्ति के बाद-transcriptional नियामकों, अक्सर 3-untranslated क्षेत्र में पूरक साइटों के लिए बाध्यकारी हैं (3-UTR) लक्ष्य जीन के प्रोटीन अभिव्यक्ति को दबाने और mrna नीचा. परिमाणीकरण microRNAs जीन अभिव्यक्ति में मूल्यवान अंतर्दृष्टि दे सकते हैं और कई प्रोटोकॉल इस उद्देश्य के लिए विकसित किया गया है3.
हम छोटे आरएनए अनुक्रमण के लिए एक परिभाषित, reproduible, और लंबे समय से चली आ रही प्रोटोकॉल विकसित किया है, और खुला स्रोत bioinformatics उपकरण का उपयोग कर सामान्यीकृत पढ़ता का विश्लेषण करने के लिए. महत्वपूर्ण बात यह है कि हमारे प्रोटोकॉल दोनों अंतर्जात microRNAs और exogenously दिया निर्माण है कि microRNA की तरह प्रजातियों का उत्पादन की एक साथ पहचान सक्षम बनाता है, जबकि कम से कम है कि अन्य छोटे आरएनए प्रजातियों के नक्शे पढ़ता है, रिबोसोमल आरएनए सहित ( आर.आर.एन.ए.), स्थानांतरण आरएनए व्युत्पन्न छोटे आरएनए (टीएसआरएन), दोहराने से व्युत्पन्न छोटे आरएनए, और एमआरएनए अवक्रमण उत्पाद। सौभाग्य से, microRNAs 5-फॉस्फोरीलेटा हुआ और2-3 हाइड्रॉक्सीलेटा 4, एक विशेषता है कि उन्हें इन अन्य छोटे RNAs और MRNA गिरावट उत्पादों से अलग leveraged किया जा सकता है. microRNA क्लोनिंग और अनुक्रमण है कि अक्सर तेज और मल्टीप्लेक्स के लिए आसान कर रहे हैं के लिए कई वाणिज्यिक विकल्प मौजूद हैं; हालांकि, किट अभिकर्मकों और उनके लगातार संशोधनों के स्वामित्व प्रकृति नमूना चुनौतीपूर्ण चलाता है की तुलना करता है. हमारी रणनीति acrylamide और agarose जेल शुद्धि कदम के माध्यम से microRNAs के केवल सही आकार इकट्ठा करने का अनुकूलन. इस प्रोटोकॉल में, हम भी अनुक्रम aligning के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन खुला स्रोत उपकरण का उपयोग microRNAs करने के लिए पढ़ता है. निर्देशों का यह सेट विशेष रूप से नौसिखिया informatics उपयोगकर्ताओं के लिए उपयोगी हो जाएगा, चाहे हमारे पुस्तकालय तैयारी विधि या एक वाणिज्यिक विधि प्रयोग किया जाता है की परवाह किए बिना.
इस प्रोटोकॉल कई प्रकाशित अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है. उदाहरण के लिए, इसका उपयोग उस तंत्र की पहचान करने के लिए किया गया था जिसके द्वारा डाइजर एंजाइम स्टेम-लूप संरचना के आंतरिक लूप से दो न्यूक्लिओटाइड की दूरी पर छोटे हेयरपिन आरएनए को छोड़ देता है - तथाकथित "लूप-काउंटिंग नियम"5। हम भी वितरित छोटे hairpin RNAs के रिश्तेदार बहुतायत की पहचान करने के लिए इन तरीकों का पालन किया (shRNA) रिकॉमबिनेंट एडेनो-संबद्ध वायरल वैक्टर (rAAVs) से व्यक्त, shRNA अभिव्यक्ति की सीमा है कि जिगर से पहले सहन किया जा सकता की सीमा की पहचान करने के लिए अधिक shRNA अभिव्यक्ति के साथ जुड़े विषाक्तता6| इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने यकृत में माइक्रोआरएन की भी पहचान की जो माइक्रोआरएनए-122 की अनुपस्थिति का जवाब देती है - एक अत्यधिक व्यक्त यकृत microRNA - जबकि इसमाइक्रोआरएनए 7 के निम्नीकरण पैटर्न की भी विशेषता है। क्योंकि हम कई प्रयोगों में लगातार हमारे प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है, हम नमूना तैयारी longitudinally निरीक्षण करने में सक्षम किया गया है, और देखते हैं कि वहाँ कोई स्पष्ट बैच प्रभाव हैं.
इस प्रोटोकॉल साझा करने में, हमारा लक्ष्य उपयोगकर्ताओं को उच्च गुणवत्ता उत्पन्न करने के लिए सक्षम करने के लिए है, लगभग किसी भी ऊतक या सेल लाइन में microRNAs के reproduible परिमाणीकरण, सस्ती उपकरण और अभिकर्मकों का उपयोग कर, और मुक्त bioinformatics उपकरण.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19:1 bis-acrylamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 bp DNA step ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phenol/chloroform</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide RNA loading dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Buffer II</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Blue color helps in visualizing pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>45-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRVana microRNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>For generating small RNA sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusieve low-melting agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory sealing film)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-ethylene glycol 8000</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included with M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>For quantifying DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base pH 7.5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal miRNA cloning linker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools

सभी मानव प्रतिलिपि के आधे microRNAs द्वारा विनियमित माना जाता है. इसलिए, microRNA अभिव्यक्ति परिमाणक रोग राज्यों में अंतर्निहित तंत्र प्रकट कर सकते हैं और चिकित्सीय लक्ष्य और biomarkers प्रदान करते हैं. यहाँ, हम विस्तार से कैसे सही microRNAs मात्रा निर्धारित करने के लिए. संक्षेप में, इस विधि microRNAs अलग करने का वर्णन करता है, उन्हें उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए उपयुक्त adapters के लिए ligating, अंतिम उत्पादों बढ़ाना, और एक नमूना पुस्तकालय की तैयारी. फिर, हम समझा कैसे प्राप्त अनुक्रमण संरेखित करने के लिए microRNA hairpins को पढ़ता है, और मात्रा, सामान्य, और उनके अंतर अभिव्यक्ति की गणना. बहुमुखी और मजबूत, इस संयुक्त प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह और bioinformatic विश्लेषण उपयोगकर्ताओं ऊतक निष्कर्षण और microRNA परिमाणीकरण के साथ खत्म करने के साथ शुरू करने के लिए सक्षम बनाता है.

पुस्तकालय की तैयारी में शामिल कदमों की योजना चित्र 2में छोटे आरएनए निष्कर्षण, अनुक्रमण और संरेखण का एक समग्र योजनाबद्ध रूपरेखा दी गई है। एक पुरुष और एक मादा माउस से जिग?...

Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

यहाँ, हम छोटे RNAs अलग करने के लिए एक कदम दर कदम रणनीति का वर्णन, microRNAs के लिए समृद्ध, और उच्च throughput अनुक्रमण के लिए नमूने की तैयारी. हम तो अनुक्रम को संसाधित करने के लिए कैसे का वर्णन पढ़ता है और उन्हें microRNAs करने के लिए संरेखित करें, खुला स्रोत उपकरण का उपयोग कर.

Isolating और अनुक्रमMicroRNAs के लिए एक पूरी पाइपलाइन, और उन्हें मुक्त स्रोत उपकरण का उपयोग का विश्लेषण

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

हमने छोटे आरएनए अनुक्रमण के लिए एक परिभाषित, प्रजनन योग्य और पुराना प्रोटोकॉल विकसित किया है और ओपनसोर्स बायोइन्फॉर्मेटिक्स टूल का उपयोग करके सामान्यीकृत रीड्स का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया है। हमारी रणनीति के मुख्य फायदे यह हैं कि यह जेल शुद्धिकरण के माध्यम से माइक्रोआरएनए को सही ढंग से एकत्र करता है और बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण को लागू किया जा सकता है चाहे माइक्रोआरएनए कैसे एकत्र किया जाता है। माइक्रोआरएनए के उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण रोग तंत्र, माइक्रोआरएनए के प्रसंस्करण, और जीन थेरेपी दृष्टिकोणों के सटीक मात्राकरण में अंतर्दृष्टि प्रकट कर सकते हैं जो छोटे आरएनए प्रदान करते हैं।एक RNase मुक्त वातावरण में काम करने के लिए और प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर आरएनए उत्पादों के सभी रखने के लिए सुनिश्चित करें । जेल काटने के कदमों की कल्पना करने से दर्शकों को डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक उत्पादों के सही आकार की पहचान करने में मदद मिलेगी। तीन प्राइम अडैप्टर लिगामेंटेशन के लिए, आरएनए के 11 माइक्रोलीटर को एटीपी फ्री 10X T4RNA लिगाज़ रिएक्शन बफर के १.५ माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं, पॉलीथीन ग्लाइकोल का एक माइक्रोलीटर और तीन प्राइम लिंकर के ०.५ माइक्रोलीटर ।नमूनों को 30 से 40 सेकंड के लिए थर्मोसाइकिलर पर 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें, इसके बाद एक मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा किया जाए। T4RNA ligase दो के एक माइक्रोलीटर जोड़ें और दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया इनक्यूबेट । जबकि नमूने इनक्यूबेटिंग कर रहे हैं, एक प्लास्टिक डाली में ०.८ मिलीमीटर अलग ग्लास प्लेटों के बीच एक 15% पॉलीएरिजाइलामाइड जेल डालो और एक कंघी डालें ।जब जेल जम जाता है, तो अवशिष्ट यूरिया के कुओं को धोने के लिए टैंक में 0.5 5X TBE जोड़ें और सख्ती से पिपेट करें। 375 वोल्ट पर 25 मिनट के लिए पॉलीएक्रेलैमाइड जेल को पूर्व-चलाने के बाद, प्रत्येक नमूने के बीच में कम से कम एक लेन छोड़ने वाले नमूनों को लोड करें। जेल अभिविन्यास का ट्रैक रखने और जेल को लगातार 375 वोल्ट पर चलाने के लिए विषम पैटर्न में मार्कर के कम से कम दो सेट के 20 माइक्रोलीटर लोड करें।15 मिनट के बाद, बाकी रन के लिए लगातार 425 वोल्ट तक बढ़ाएं और जेल को लगभग दो घंटे तक चलाएं। रन के अंत में, ग्लास प्लेटों से जेल को हटाने के लिए एक प्लेट विभाजक का उपयोग करें और जेल को प्लास्टिक पृष्ठ रक्षक पर रखें। आसुत पानी के ५०० माइक्रोलीटर में एथिडियम ब्रोमाइड के पांच माइक्रोलीटर पतला और शीर्ष हल्के नीले मार्कर के ठीक ऊपर मार्कर गलियों पर डाई जोड़ें ।इसके बाद, पराबैंगनी प्रकाश के तहत प्रत्येक लेन में ऊपरी से निचले मार्कर तक जैल को काटने के लिए एक साफ रेजर ब्लेड का उपयोग करें और टुकड़ों को प्रयोगशाला सीलिंग फिल्म के चार सेंटीमीटर वर्ग में चार में स्थानांतरित करें। 12 छोटे वर्गों का उत्पादन करने के लिए क्षैतिज रूप से लगभग तीन कटौती और दो कटौती खड़ी के साथ जेल को काटें। सीलिंग फिल्म पर 0.3 मोलर सोडियम क्लोराइड के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें और जेल के टुकड़ों को 1.5 मिलीलीटर सिलिकॉन ट्यूब में गाइड करें।रात चार डिग्री सेल्सियस पर एक नटलेटर पर नमूने आंदोलन किया । अगली सुबह, प्रत्येक सुपरनेट के 400 माइक्रोलीटर को नई ट्यूबों में स्थानांतरित करें। प्रति मिलीलीटर ग्लाइकोजन सह-पूर्वापित प्रति मिलीलीटर 100% इथेनॉल का एक मिलीलीटर और 15 मिलीग्राम का एक माइक्रोलीटर जोड़ें।फिर ट्यूबों को एक घंटे के लिए माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। पांच प्राइम लिंकर लिगेशन के लिए, पहले गल नमूनों को स्पिन करें और छर्रों को पानी में फिर से खर्च करें। इसके बाद, 100 माइक्रोमॉलर फाइव प्राइम लिंकर के 0.5 माइक्रोलीटर, T4RNA ligase बफर का एक माइक्रोलीटर, 10 मिलीमोलर एटीपी का एक माइक्रोलीटर और प्रत्येक नमूने में पॉलीथीन ग्लाइकोल का एक माइक्रोलीटर जोड़ें।प्रतिक्रियाओं को बर्फ पर रखने से पहले 30 सेकंड के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। फिर प्रत्येक ट्यूब में T4RNA ligase के एक माइक्रोलीटर जोड़ें और दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए, अपकेंद्रित्र द्वारा नमूने एकत्र करें और नाभिक मुक्त पानी के 8.25 माइक्रोलीटर में हवा सूखे गोली को फिर से खर्च करें।पूरक डीएनए संश्लेषण किट से 100 माइक्रोमोलर रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस प्राइमर और 2X रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस रिएक्शन मिक्स के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें। ४२ डिग्री सेल्सियस पर तीन मिनट के बाद, एक थर्मोसाइकिलर में ४२ डिग्री सेल्सियस पर एक 30 मिनट इनक्यूबेशन के लिए प्रत्येक नमूने के लिए 10X रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज एंजाइम के १.५ माइक्रोलीटर जोड़ें । बेअसर होने के बाद, 29.5 माइक्रोलीटर पानी के साथ पीसीआर रिएक्शन तैयार करें, 10X ताक बफर के पांच माइक्रोलीटर, न्यूकोसाइड ट्राइफॉस्फेट के एक माइक्रोलीटर, 25 माइक्रोमोलर फॉरवर्ड प्राइमर के दो माइक्रोलीटर, 25 माइक्रोमोलर रिवर्स प्राइमर के दो माइक्रोलीटर, ताक़ पॉलीमरेज के 0.5 माइक्रोलीटर, और रिवर्स ट्रान के 10 माइक्रोलीटर पूरक डीएनए।इसके बाद दो पीसीआर रिएक्शन चलाएं। एगर उठे जेल शुद्धिकरण के लिए, कम पिघलने वाले एग्रेड के साथ 4% एगर उठे जेल तैयार करें और लोडिंग डाई और 100 बेस जोड़ी और 25 बेस जोड़ी आकार मार्कर के साथ जेल पर 40 माइक्रोलीटर या पीसीआर उत्पाद के अधिक लोड करें। जेल चलाने के बाद, 125 बेस जोड़ी बैंड के ऊपर बैंड काटें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करें।अंतिम अनुक्रम पुस्तकालय की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयुक्त उपकरणों का उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर बफर में जेल बैंड को भंग करने के लिए हिलाएं। फिर अनुक्रम डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त ओपनसोर्स बायोइन्फॉर्मेटिक्स टूल का उपयोग करें। कम पिघले हुए एगर उठे जेल पर इस प्रतिनिधि पीसीआर प्रतिक्रिया में, प्राप्त लिंकर लिंकर उत्पाद और असंतृप्त बनाम संतृप्त नमूनों की तुलना में सही क्लोन उत्पाद का अधिग्रहण देखा जा सकता है।मानव माइक्रोआरएनए हेयरपिन के संरेखण के बाद, प्रत्येक दोहराने में माइक्रोआरएनए रीड काउंट के बीच एक मजबूत सामंजस्य देखा जा सकता है। माइक्रोआरएनए 122 को मैपिंग की सबसे बड़ी संख्या के साथ कुल 306 माइक्रोआरएनए प्रजातियों का पता चला। माइक्रोआरएनए की सटीक वसूली को सक्षम करने के लिए उचित आकार पर जैल को काटना याद रखना महत्वपूर्ण है।माइक्रोआरएनए अनुक्रमण के बाद, उपयोगकर्ता अपने ऊतकों के भीतर माइक्रोआरएनए के वितरण की विशेषता के लिए बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण लागू कर सकते हैं। इस तकनीक का उपयोग यह पहचानने के लिए किया गया है कि माइक्रोआरएनए को कैसे संसाधित किया जाता है और कुछ कैंसरों में माइक्रोआरएनए के कौन से सेट बदले जाते हैं। एथिडियम ब्रोमाइड को संभालते समय और पराबैंगनी प्रकाश के तहत जैल को देखते समय देखभाल करना सुनिश्चित करें।

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Genetics

Unit 1

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

नकल संख्या बदलाव की जांच सिंगल सेल अनुक्रमण का उपयोग

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

वानस्पतिक नमूनों के लिए मजबूत डीएनए अलगाव और उच्च प्रवाह अनुक्रमण पुस्तकालय निर्माण

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

संवैधानिक रोग के आनुवंशिक निर्धारकों का मूल्यांकन करने के लिए लक्षित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण और Bioinformatics पाइपलाइन

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

त्रुटि-सही डीएनए और आरएनए अनुक्रमण का उपयोग कर दुर्लभ घटना का पता लगाने

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

C. एलिगेंस में जीनोमिक पॉइंट म्यूटेंट पैदा करने के लिए एक रैपिड और सतही पाइपलाइन का उपयोग CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

एक एकल Tardigrade नमूना से Ultralow इनपुट जीनोम अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

परिपत्र गुणसूत्र अनुरूप कब्जा की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग जीन विनियामक अनुक्रम का उच्च प्रवाह पहचान (4c-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

आइसोलेटिंग, अनुक्रमण और मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं से extracellular micrornas का विश्लेषण

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

पूरे रक्त से mRNA के अनुक्रमण नैनोकोर अनुक्रमण का उपयोग

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित Proteomics विश्लेषण OpenProt डेटाबेस का उपयोग कर उपन्यास प्रोटीन गैर-विहित ओपन रीडिंग फ्रेम्स से अनुवादित

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...