Name: a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools
Uploaded: 2019-08-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

アンドリュー・ファイアとマーク・ケイの研究室のメンバーに指導と提案を感謝します。

動物実験は、ワシントン大学の機関動物ケア・使用委員会によって承認されました。
小さなRNAライブラリの準備
1. RNA分離
<ol><li>標準的なRNA単離試薬、またはマイクロRNA用に濃縮するキットを使用して、生物学的供給源からRNAを単離します。組織の場合は、液体窒素でスナップ冷凍サンプルから始め、あらかじめ冷やされた?...

<ol>
	<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+MicroRNAs.">Metazoan MicroRNAs.</a> Cell. 173 (1), 20-51 (2018).</li><li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+class+of+tiny+RNAs+with+probable+regulatory+roles+in+Caenorhabditis+elegans.">An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li><li>Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+small+RNAs+in+animals.">Biogenesis of small RNAs in animals.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loop+position+of+shRNAs+and+pre-miRNAs+is+critical+for+the+accuracy+of+dicer+processing+in+vivo.">The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo.</a> Cell. 151 (4), 900-911 (2012).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-induced+hepatotoxicity+results+from+loss+of+the+first+synthesized+isoform+of+microRNA-122+in+mice.">RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice.</a> Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+removal+in+the+liver+activates+imprinted+microRNAs+and+enables+more+effective+microRNA-mediated+gene+repression.">miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression.</a> Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+Registry.">The microRNA Registry.</a> Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).</li><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).</li><li>Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sailfish+enables+alignment-free+isoform+quantification+from+RNA-seq+reads+using+lightweight+algorithms.">Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Small+RNA+NGS+Libraries+from+Biofluids.">Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids.</a> Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).</li><li>Yamane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hepatitis+C+virus+RNA+target+site+selection+and+host+factor+activities+of+naturally+occurring+miR-122+3+variants.">Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).</li><li>Giraldez, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+multi-center+assessment+of+small+RNA-seq+methods+for+quantitative+miRNA+profiling.">Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling.</a> Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).</li><li>Yeri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+small+RNASeq+library+preparation+kits+using+low+input+RNA.">Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA.</a> BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).</li><li>Coenen-Stass, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methodologies+for+microRNA+biomarker+detection+by+next+generation+sequencing.">Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing.</a> RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).</li><li>Baran-Gale, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+Bias+in+Small+RNA+Library+Preparation+for+Sequencing:+A+New+Protocol+Recovers+MicroRNAs+that+Evade+Capture+by+Current+Methods.">Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods.</a> Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+the+microRNA+cluster+at+the+Dlk1-Dio3+locus+in+lung+adenocarcinoma.">Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma.</a> Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).</li><li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Normalization+Strategies+for+MicroRNA+Quantification.">Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification.</a> Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).</li><li>Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+RNA+ligase+2+truncated+active+site+mutants:+improved+tools+for+RNA+analysis.">T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis.</a> BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).</li><li>Chiang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes &amp; Development. 24 (10), 992-1009 (2010).</li><li>Fromm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Uniform+System+for+the+Annotation+of+Vertebrate+microRNA+Genes+and+the+Evolution+of+the+Human+microRNAome.">A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome.</a> Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).</li></ol>

20年以上前の13年以上前にマイクロRNAを同定したにもかかわらず、マイクロRNAシーケンシングのプロセスは依然として骨の折れるものであり、特殊な装置を必要とし、研究室が社内プロトコル14を日常的に採用するのを妨げている。他の技術は、マイクロRNAマイクロアレイや多重発現パネルのようなマイクロRNAを同時に評価することができます。ただし、こ?...

1993年1月に初めて発見され、現在では2000マイクロRNA近くがヒトゲノム2に存在すると推定されている。マイクロRNAは、典型的には21〜24ヌクレオチド長い小さな非コードRNAである。それらは遺伝子発現の転写後調節因子であり、多くの場合、タンパク質発現を抑え、mRNAを分解する標的遺伝子の3非翻訳領域(3-UTR)の相補部位に結合する。マイクロRNAの定量化は、遺伝子発現に関する貴重な洞察を与えることができ、いくつかのプロトコルは、この目的のために開発されています 3.
当社は、小型RNAシーケンシングおよびオープンソースバイオインフォマティクスツールを使用して正規化された読み取りを分析するための、定義された、再現性のある、長年にわたるプロトコルを開発しました。重要なことに、我々のプロトコルは、内因性マイクロRNAと外因的に送達されたマイクロRNAの両方を同時に同定し、リボソームRNAを含む他の小さなRNA種への読み取りを最小限に抑え、その読み取りを最小限に抑えることが可能です。rRNA)、RNA由来の小RNA(tsRNA)、反復由来の小RNA、およびmRNA分解産物を転写する。幸いなことに、マイクロRNAは5リン酸化および2-3ヒドロキシレート4であり、これらの他の小さなRNAおよびmRNA分解産物からそれらを分離するために利用することができる特徴である。マイクロRNAのクローニングとシーケンシングには、多くの場合、より迅速かつ簡単に多重化できるいくつかの商用オプションが存在します。しかし、キット試薬の独自の性質とその頻繁な変更は、サンプルランの比較を困難にします。当社の戦略は、アクリルアミドとアガロースゲル精製ステップを通じて、マイクロRNAの正しいサイズのみを収集するように最適化します。このプロトコルでは、オープンソースツールを使用してシーケンス読み取りをmicroRNAに合わせる手順についても説明します。この一連の命令は、私たちのライブラリの準備方法や商用方法を使用しているかどうかにかかわらず、初心者の情報学のユーザーに特に役立ちます。
このプロトコルは、いくつかの公開された研究で使用されています。例えば、ダイサー酵素がステムループ構造の内部ループから2つのヌクレオチドの距離で小さなヘアピンRNAを切断するメカニズムを同定するために使用された-いわゆる「ループカウントルール」5。我々はまた、これらの方法に従って、組換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAV)から発現される送達された小さなヘアピンRNA(shRNA)の相対的な存在量を同定し、肝臓の前に許容できるshRNA発現の閾値を同定した。過剰なshRNA発現に関連する毒性6.このプロトコルを用いて、我々はまた、このマイクロRNA7の分解パターンを特徴付けながら、高度に発現した肝マイクロRNAであるマイクロRNA-122の不在に応答する肝臓のマイクロRNAを同定した。私たちは、多くの実験で一貫してプロトコルを使用してきたので、我々は縦方向にサンプル調製物を観察することができ、識別可能なバッチ効果がないことを確認しました。
このプロトコルを共有する上で、私たちの目標は、手頃な価格の機器や試薬、および無料のバイオインフォマティクスツールを使用して、事実上あらゆる組織または細胞株で高品質で再現可能なマイクロRNAの定量を生成できるようにすることです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19:1 bis-acrylamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 bp DNA step ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phenol/chloroform</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide RNA loading dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Buffer II</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Blue color helps in visualizing pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>45-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRVana microRNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>For generating small RNA sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusieve low-melting agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory sealing film)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-ethylene glycol 8000</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included with M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>For quantifying DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base pH 7.5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal miRNA cloning linker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools

すべての人間の転写物の半分は、マイクロRNAによって調節されると考えられている.したがって、マイクロRNA発現の定量化は、疾患状態の根本的なメカニズムを明らかにし、治療標的およびバイオマーカーを提供することができる。ここでは、マイクロRNAを正確に定量する方法について詳しく述べる。簡単に言えば、この方法では、マイクロRNAの分離、ハイスループットシーケンシングに適したアダプターへのライゲーション、最終製品の増幅、サンプルライブラリの作成について説明します。次に、得られたシーケンシング読み取りをマイクロRNAヘアピンに合わせる方法を説明し、その微分発現を定量化、正規化、および計算する方法を説明する。多目的で、強い、この結合された実験ワークフローおよびバイオインフォマティクスの分析はユーザーがティッシュの抽出から始まり、マイクロRNAの定量で終わることを可能にする。

ライブラリの準備に関わるステップの概略図 小さな RNA 抽出、シーケンス、および位置合わせの全体的な概略を図2に概説します。 1匹のオスと1匹の雌マウスからの肝臓サンプルを採取し、液体窒素中で凍結した。全RNAを抽出し、品質と濃度について評価した。
小さなRNAシーケ...

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A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

ここでは、小型RNAを分離し、マイクロRNAを強化し、ハイスループットシーケンス用のサンプルを準備するためのステップバイステップの戦略について説明します。次に、オープン ソース ツールを使用して、シーケンスの読み取りを処理し、マイクロRNA に整列する方法について説明します。

MicroRNAを分離およびシーケンシングし、オープンソースツールを使用してそれらを分析するための完全なパイプライン

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

我々は、小さなRNAシーケンシングとオープンソースバイオインフォマティクスツールを用いた正規化された読み取り解析を分析するための、定義された、再現性のある、そして長年のプロトコルを開発しました。当社の戦略の主な利点は、ゲル精製を通じてマイクロRNAを正確に収集し、マイクロRNAの収集方法に関係なくバイオインフォマティクス分析を適用できることです。マイクロRNAの高スループットシーケンシングは、疾患メカニズム、マイクロRNAの処理、および小さなRNAを提供する遺伝子治療アプローチの正確な定量化に関する洞察を明らかにすることができます。RNaseフリーの環境で動作し、手順を通してすべてのRNA製品を氷の上に保つようにしてください。ゲル切削ステップを視覚化することで、下流アプリケーションに必要な製品の正しいサイズを見極めるのに役立ちます。3つの素数アダプターライゲーションの場合、11マイクロリットルのRNAを1.5マイクロリットルのATPフリー10X T4RNAリガーゼ反応バッファー、ポリエチレングリコール1マイクロリットル、3つのプライムリンカーの0.5マイクロリットルと組み合わせます。サーモサイクラーで95°Cでサンプルを30~40秒間加熱し、氷の上で1分間冷却します。T4RNAリガーゼ2の1マイクロリットルを加え、2時間室温で反応をインキュベートします。サンプルがインキュベートされている間に、プラスチック鋳造で0.8ミリメートル分離ガラス板の間に15%ポリアシリルアミドゲルを注ぎ、櫛を挿入します。ゲルが固まったら、タンクに0.5 5X TBEを加え、ピペットを激しく加えて残留尿素のウェルを洗浄します。ポリアクリルアミドゲルを375ボルトで25分間前走した後、各サンプルの間に少なくとも1車線を残してサンプルをロードする。20マイクロリットルのマーカーを非対称パターンにロードして、ゲルの向きを追跡し、一定の375ボルトでゲルを実行します。15分後、残りの走行のために一定の425ボルトに増加し、約2時間ゲルを実行します。実行の最後に、プレートセパレータを使用してガラス板からゲルを取り除き、ゲルをプラスチックページプロテクターに置きます。5マイクロリットルのエチジウム臭化物を500マイクロリットルの蒸留水で希釈し、トップライトブルーマーカーのすぐ上のマーカーレーンに染料を加えます。次に、きれいなカミソリの刃を使用して、紫外線下の各レーンの上部から下のマーカーにゲルをカットし、実験室のシーリングフィルムの4センチメートル四方に作品を移します。ゲルを水平に約3カット、垂直に2カットで切り、12個の小さな正方形を作り出します。400マイクロリットルの0.3モル塩化ナトリウムを封止フィルムに加え、ゲル片を1.5ミリリットルのシリコンチューブに導きます。一晩摂氏4度でヌテーターのサンプルを攪拌します。翌朝、各上清の400マイクロリットルを新しいチューブに移します。100%エタノールの1ミリリットルと1ミリリットルの15ミリグラムの1ミリリットルを1本のグリコーゲン共沈殿物をチューブあたりに加えます。その後、マイナス80度で1時間チューブを保存します。5つのプライムリンカーライゲーションの場合、まず解凍したサンプルをスピンダウンし、ペレットを水中に再懸濁させます。次に、0.5マイクロモル5プライムリンカー、T4RNAリガーゼバッファー1マイクロリットル、1マイクロリットルの10ミリモルATP、および各サンプルにポリエチレングリコール1マイクロリットルを加えます。反応を氷の上に置く前に、摂氏90度で30秒間加熱します。次に、各チューブにT4RNAリガーゼ1マイクロリットルを加え、室温で2時間反応をインキュベートします。逆転写の場合は、遠心分離によってサンプルを収集し、空気乾燥ペレットを8.25マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水で再懸濁します。100マイクロモル逆転写酵素プライマーの0.5マイクロモル逆転写酵素と相補的なDNA合成キットから2X逆転写酵素反応ミックスの5マイクロリットルを追加します。摂氏42度で3分後、サーモサイクラーで摂氏42度で30分間インキュベーションするために、各サンプルに10倍の逆転写酵素1.5マイクロリットルを加えます。中和後、29.5マイクロリットルの水、5マイクロリットルの10X taqバッファー、1マイクロリットルのヌクレオシド三リン酸、25マイクロモルフォワードプライマーの2マイクロリットル、25マイクロモル逆プライマーの2マイクロリットル、taqポリメラーゼの0.5マイクロリットル、および10マイクロリットルの逆転分解DNAを用いてPCR反応を調製する。次に、2 つの PCR 反応を実行します。アガロースゲル精製の場合、低融解アガロースを含む4%アガロースゲルを調製し、40マイクロリットル以上のPCR産物をローディング色素と100塩基対および25塩基対サイズマーカーでゲルにロードします。ゲルを実行した後、125塩基対バンドの上にバンドをカットし、メーカーの指示に従ってゲル抽出キットを使用します。適切な装置を使用して最終的なシーケンスライブラリを定量化する前に、ゲルバンドを室温でバッファーに溶解させます。次に、適切なオープンソースバイオインフォマティクスツールを使用して、シーケンスデータを分析します。この代表的なPCR反応では、低メルトアガロースゲルに対して、得られたリンカー産物と不飽和対飽和サンプルと比較して正しいクローン生成物の獲得が観察できる。ヒトマイクロRNAヘアピンにアライメントした後、各反復におけるマイクロRNA読み取りカウント間の強い一致が観察される。マイクロRNA 122にマッピングする読み取りの数が最も多い合計306種のマイクロRNAが検出された。マイクロRNAの正確な回復を可能にするために、ゲルを適切なサイズで切断することを忘れないでください。マイクロRNAをシーケンシングした後、ユーザーは、関心のある組織内のマイクロRNAの分布を特徴付けるためにバイオインフォマティクス分析を適用することができます。この技術は、マイクロRNAがどのように処理され、特定の癌でどのマイクロRNAのセットが変化するかを特定するために使用されてきた。臭化エチジウムを取り扱う際や、紫外線下でゲルを見る際には、必ず注意してください。

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Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクス パイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

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A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

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迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

超低入力ヒトゲノム単一 Tardigrade の標本からのライブラリの準備

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

分離、シーケンスおよびヒト間葉系幹細胞からの細胞のマイクロ Rna を分析

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

ナノポアシーケンシングを用いた全血からの mRNA の配列決定

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

非正規の開いたリーディング ・ フレームから翻訳された蛋白質を発表する OpenProt データベースを利用した質量分析を用いたプロテオミクス解析

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...