Name: a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools
Uploaded: 2019-08-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

우리는 앤드류 화재와 마크 케이의 실험실의 구성원에게 지침과 제안에 감사드립니다.

동물 실험은 워싱턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
작은 RNA 라이브러리 준비
1. RNA 격리
<ol><li>표준 RNA 격리 시약 또는 마이크로RNA를 농축하는 키트를 사용하여 생물학적 공급원으로부터 RNA를 분리합니다. 조직의 경우 액체 질소에서 스냅 냉동 시료로 시작하여 미리 냉각 된 모르타르와 유봉을 사?...

<ol>
	<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+MicroRNAs.">Metazoan MicroRNAs.</a> Cell. 173 (1), 20-51 (2018).</li><li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+class+of+tiny+RNAs+with+probable+regulatory+roles+in+Caenorhabditis+elegans.">An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li><li>Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+small+RNAs+in+animals.">Biogenesis of small RNAs in animals.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loop+position+of+shRNAs+and+pre-miRNAs+is+critical+for+the+accuracy+of+dicer+processing+in+vivo.">The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo.</a> Cell. 151 (4), 900-911 (2012).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-induced+hepatotoxicity+results+from+loss+of+the+first+synthesized+isoform+of+microRNA-122+in+mice.">RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice.</a> Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+removal+in+the+liver+activates+imprinted+microRNAs+and+enables+more+effective+microRNA-mediated+gene+repression.">miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression.</a> Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+Registry.">The microRNA Registry.</a> Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).</li><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).</li><li>Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sailfish+enables+alignment-free+isoform+quantification+from+RNA-seq+reads+using+lightweight+algorithms.">Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Small+RNA+NGS+Libraries+from+Biofluids.">Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids.</a> Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).</li><li>Yamane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hepatitis+C+virus+RNA+target+site+selection+and+host+factor+activities+of+naturally+occurring+miR-122+3+variants.">Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).</li><li>Giraldez, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+multi-center+assessment+of+small+RNA-seq+methods+for+quantitative+miRNA+profiling.">Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling.</a> Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).</li><li>Yeri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+small+RNASeq+library+preparation+kits+using+low+input+RNA.">Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA.</a> BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).</li><li>Coenen-Stass, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methodologies+for+microRNA+biomarker+detection+by+next+generation+sequencing.">Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing.</a> RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).</li><li>Baran-Gale, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+Bias+in+Small+RNA+Library+Preparation+for+Sequencing:+A+New+Protocol+Recovers+MicroRNAs+that+Evade+Capture+by+Current+Methods.">Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods.</a> Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+the+microRNA+cluster+at+the+Dlk1-Dio3+locus+in+lung+adenocarcinoma.">Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma.</a> Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).</li><li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Normalization+Strategies+for+MicroRNA+Quantification.">Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification.</a> Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).</li><li>Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+RNA+ligase+2+truncated+active+site+mutants:+improved+tools+for+RNA+analysis.">T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis.</a> BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).</li><li>Chiang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes &amp; Development. 24 (10), 992-1009 (2010).</li><li>Fromm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Uniform+System+for+the+Annotation+of+Vertebrate+microRNA+Genes+and+the+Evolution+of+the+Human+microRNAome.">A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome.</a> Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).</li></ol>

20 년 전13년 전 microRNAs의 확인에도 불구하고, microRNA 시퀀싱의 과정은 힘든 남아 있고 전문 장비를 필요로, 일상적으로 사내 프로토콜을 채택에서 실험실을 방해14. 그밖 기술은 microRNA 마이크로어레이 및 다중화한 표현 패널 같이 microRNA를 동시에 평가할 수 있습니다; 그러나, 이러한 접근법은 그들의 프로브 세트에 존재하는 microRNAs만 정량화한다는 점에서 제한?...

1993년에 처음발견된 1, 현재 거의 2000개의 마이크로RNA가 인간 게놈2에존재하는 것으로 추정된다. MicroRNAs는 전형적으로 21-24 뉴클레오티드 긴 작은 비코딩 RNA입니다. 그(것)들은 단백질 발현을 억압하고 mRNA를 저하시키기 위하여 표적 유전자의 3-번역되지 않은 지역 (3-UTR)에 있는 상보적인 사이트에 수시로 결합하는 유전자 발현의 사후 전사 조절자입니다. 마이크로RNA를 정량화하면 유전자 발현에 대한 귀중한 통찰력을 제공할수 있으며 이 목적을 위해 여러 프로토콜이 개발되었습니다 3.
당사는 작은 RNA 시퀀싱을 위한 정의되고 재현 가능하며 오래 지속되는 프로토콜을 개발했으며, 오픈 소스 생물정보학 도구를 사용하여 정규화된 판독을 분석했습니다. 중요한 것은, 우리의 프로토콜은 내인성 microRNAs와 외인성 으로 마이크로RNA 와 같은 종을 생성하는 생성물 모두를 동시에 식별할 수 있게 하는 동시에, 리보솜 RNA를 포함한 다른 작은 RNA 종에 대한 지도를 최소화하는 동시에 ( rRNA), RNA 유래 작은 RNA(tsRNAs), 반복 유래 작은 RNA 및 mRNA 분해 산물을 전달한다. 다행히, microRNAs는 5-인산화 및 2-3 하이드록시레이트4,이러한 다른 작은 RNA 및 mRNA 분해 산물로부터 이들을 분리하는 데 활용할 수 있는 특징이다. 종종 멀티플렉스에 더 빠르고 쉽게 마이크로RNA 복제 및 시퀀싱을 위한 몇몇 상업적인 선택권존재; 그러나 키트 시약의 독점적 특성과 빈번한 수정으로 인해 샘플 실행을 비교하기가 어렵습니다. 우리의 전략은 아크릴아미드와 아가로즈 젤 정제 단계를 통해 정확한 크기의 마이크로RNA만 수집을 최적화합니다. 이 프로토콜에서는 오픈 소스 도구를 사용하여 시퀀스 읽기를 microRNAs에 정렬하는 절차도 설명합니다. 이 지침 세트는 라이브러리 준비 방법또는 상용 방법이 사용되는지 여부에 관계없이 초보자 정보학 사용자에게 특히 유용합니다.
이 프로토콜은 여러 출판 된 연구에서 사용 되었습니다. 예를 들어, Dicer 효소가 줄기 루프 구조의 내부 루프로부터 2개의 뉴클레오티드의 거리에서 작은 헤어핀 RNA를 절단하는 메커니즘을 식별하기 위해사용되었다 - 소위 "루프 카운팅 규칙"5. 우리는 또한 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터 (rAAv)에서 발현된 전달된 작은 머리핀 RNAs (shRNA)의 상대적인 풍부를 확인하기 위하여 이 방법을 따랐습니다, 간 이전에 용납될 수 있는 shRNA 발현의 임계값을 확인하기 위하여 과잉 shRNA 발현과 관련된 독성6. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 또한 microRNA-122의 부재에 반응하는 간에서 microRNA를 확인했습니다 - 고도로 발현된 간microRNA - 또한 이 microRNA 7의 분해 패턴을 특성화하는 동안. 우리는 수많은 실험에서 우리의 프로토콜을 일관되게 사용했기 때문에, 우리는 종로적으로 견본 준비를 관찰하고, 확인할 수 있는 배치 효력이 없다는 것을 볼 수 있었습니다.
이 프로토콜을 공유하는 우리의 목표는 사용자가 저렴한 장비 및 시약, 무료 생물 정보학 도구를 사용하여 거의 모든 조직 또는 세포주에서 microRNAs의 고품질, 재현 가능한 정량화를 생성 할 수 있도록하는 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19:1 bis-acrylamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 bp DNA step ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phenol/chloroform</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide RNA loading dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Buffer II</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Blue color helps in visualizing pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>45-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRVana microRNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>For generating small RNA sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusieve low-melting agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory sealing film)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-ethylene glycol 8000</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included with M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>For quantifying DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base pH 7.5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal miRNA cloning linker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools

모든 인간 적인 전사체의 반은 microRNAs에 의해 통제되기 위하여 생각됩니다. 따라서 microRNA 발현을 정량화하면 질병 상태의 기본 메커니즘을 밝히고 치료 대상 및 바이오마커를 제공할 수 있습니다. 여기서는 마이크로RNA를 정확하게 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 간단히 말해서, 이 방법은 microRNAs를 분리하고, 고처리량 시퀀싱에 적합한 어댑터에 합착하고, 최종 제품을 증폭하고, 샘플 라이브러리를 준비하는 방법을 설명합니다. 이어서, 얻어진 시퀀싱 읽기를 마이크로RNA 헤어핀에 정렬하고, 정량화, 정규화 및 차등 발현을 계산하는 방법을 설명한다. 다재다능하고 견고한 이 결합된 실험 워크플로우와 생물정보학 분석을 통해 사용자는 조직 추출을 시작하고 microRNA 정량화로 마무리할 수 있습니다.

라이브러리 준비와 관련된 단계의 회로도 작은 RNA 추출, 시퀀싱 및 정렬의 전반적인 회로도는 그림2에 설명되어 있습니다. 1마리의 수컷 마우스와 1마리의 암컷 마우스로부터의 간 샘플을 수집하고 액체 질소로 냉동 스냅하였다. 총 RNA를 추출하고 품질 및 농도에 대해 평가하였다.
...

Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

여기서는 작은 RNA를 격리하고, microRNAs를 보강하고, 처리량이 높은 시퀀싱을 위한 샘플을 준비하기 위한 단계별 전략을 설명합니다. 그런 다음 시퀀스 읽기를 처리하고 오픈 소스 도구를 사용하여 microRNAs에 정렬하는 방법을 설명합니다.

MicroRNAs를 격리하고 시퀀싱하고 오픈 소스 도구를 사용하여 분석하기 위한 완벽한 파이프라인

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

우리는 작은 RNA 시퀀싱및 오픈 소스 생물 정보학 도구를 사용하여 정규화 된 읽기를 분석하기위한 정의, 재현 가능, 오랜 프로토콜을 개발했습니다. 우리의 전략의 주요 장점은 젤 정화를 통해 microRNA를 정확하게 수집하고 생물 정보학 분석은 microRNA수집 방법에 관계없이 적용될 수 있다는 것입니다. microRNA의 높은 처리량 순서는 질병 기계장치에 대한 통찰력을 드러낼 수 있습니다, microRNA의 처리, 및 작은 RNA를 전달하는 유전자 치료 접근의 정확한 정량화.RNase 무료 환경에서 작업하고 절차 전반에 걸쳐 모든 RNA 제품을 얼음에 보관하십시오. 젤 절삭 단계를 시각화하면 시청자가 다운스트림 응용 프로그램에 필요한 제품의 정확한 크기를 식별하는 데 도움이 됩니다. 3개의 프라임 어댑터 결찰의 경우, 11마이크로리터의 RNA와 ATP 무료 10X T4RNA 리구아제 반응 버퍼, 폴리에틸렌 글리콜1마이크로리터, 3개의 프라임 링커의 0.5 마이크로리터를 결합한다.시료를 온도 순환기에서 섭씨 95도에서 30~40초 동안 가열한 다음 1분간 얼음 위를 냉각합니다. T4RNA 리간슬 2의 마이크로리터 1개를 추가하고 실온에서 2시간 동안 반응을 배양합니다. 시료가 인큐베이팅되는 동안 플라스틱 주조에 0.8mm 분리 유리 판 사이에 15% 폴리아시릴마이드 젤을 붓고 빗을 삽입합니다.젤이 고화되면 탱크에 0.5 5X TBE를 넣고 파이펫을 적극적으로 추가하여 잔류 우레아의 우물을 씻으실 수 있습니다. 375볼트에서 25분 동안 폴리아크릴아미드 젤을 사전 실행한 후 샘플을 적재하여 각 샘플 사이에 적어도 하나의 레인을 남깁니다. 겔 방향을 추적하고 일정한 375 볼트에서 젤을 실행하기 위해 비대칭 패턴으로 적어도 두 세트의 마커 20 마이크로리터를 적재합니다.15 분 후, 실행의 나머지 부분에 대한 일정한 425 볼트로 증가하고 약 2 시간 동안 젤을 실행합니다. 실행의 끝에서, 유리 판에서 젤을 제거하고 플라스틱 페이지 보호자에 젤을 배치 플레이트 분리기를 사용합니다. 증류수 500마이크로리터에 에티듐 브로마이드 5마이크로리터를 희석하고 상단 라이트 블루 마커 바로 위에 있는 마커 레인에 염료를 추가합니다.다음으로, 깨끗한 면도날을 사용하여 자외선 아래 각 차선의 상부에서 아래 마커로 젤을 자르고 조각을 실험실 밀봉 필름의 4센티미터 사각형으로 옮춥니다. 약 3개의 컷으로 젤을 수평으로 자르고 2개의 컷을 수직으로 잘라 12개의 작은 사각형을 생산합니다. 밀봉 필름에 0.3 개의 어금니 나트륨 염화 나트륨 400 마이크로 리터를 추가하고 젤 조각을 1.5 밀리리터 실리콘 튜브로 안내합니다.하룻밤 사이에 4도에서 영양가에 샘플을 동요. 다음 날 아침, 각 상체의 400 마이크로리터를 새로운 튜브로 옮킨다. 1밀리리터 100%에탄올과 15밀리리터당 1밀리리터를 튜브당 글리코겐 공동 침전제를 넣으세요.그런 다음 튜브를 영하 80도에서 1시간 동안 보관합니다. 5개의 프라임 링커 결찰의 경우 먼저 해동된 샘플을 스핀다운하고 물 에서 펠릿을 다시 중단합니다. 다음으로, 100 마이크로몰라 5개의 프라임 링커, T4RNA 리구아제 버퍼 1개, 10밀리몰러 ATP의 마이크로리터 1개, 각 샘플에 폴리에틸렌 글리콜 1개의 마이크로리터를 0.5 마이크로리터를 추가합니다.반응을 섭씨 90도에서 30초 동안 가열한 후 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 각 튜브에 T4RNA 리갈아제 1마이크로리터를 추가하고 실온에서 2시간 동안 반응을 배양합니다. 역전사의 경우, 원심분리에 의해 샘플을 수집하고 뉴클레아제 자유물의 8.25 마이크로리터에서 공기 건조 펠릿을 재연한다.보완 DNA 합성 키트에서 100 마이크로몰라 역 전사 프라이머와 2X 역 전사 반응 믹스의 5 개의 마이크로 리터의 0.5 마이크로 리터를 추가합니다. 섭씨 42도에서 3분 후, 각 샘플에 10X 역전사 효소 1.5마이크로리터를 넣고 온도순환기에서 섭씨 42도에서 30분 간 배양합니다. 중화 후, 29.5 마이크로리터의 물, 10X 타크 버퍼5개, 뉴클레오시드 삼위상염 1마이크로리터, 25마이크로몰러 포워드 프라이머 25마이크로리터, 25마이크로몰라 역프라이머 25마이크로리터, taq 폴리머및 10개의 미량리터를 사용하여 PCR 반응을 준비한다.그런 다음 두 개의 PCR 반응을 실행합니다. 아가로즈 젤 정제를 위해, 4%아가로즈 젤을 낮은 녹는 아가로즈로 준비하고 40 마이크로리터 이상을 적재하여 염색염과 100개의 베이스 페어 및 25개의 베이스 쌍 크기 마커를 젤에 적재한다. 젤을 실행한 후 125개의 베이스 페어 밴드 위에 밴드를 자르고 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용하십시오.적절한 장비를 사용하기 전에 실온에서 젤 밴드를 버퍼로 녹여 최종 시퀀스 라이브러리를 정량화합니다. 그런 다음 적절한 오픈소스 생물정보학 도구를 사용하여 서열 데이터를 분석합니다. 이러한 대표적인 PCR 반응에서 저융 아가로즈 젤에 대한 반응에서는, 얻어진 링커 링커 제품 및 포화 시료 대비 불포화에 비해 올바른 복제 제품의 획득을 관찰할 수 있다.인간 microRNA 헤어핀에 정렬 한 후, 각 복제에서 microRNA 판독 카운트 사이의 강한 일치를 관찰 할 수 있습니다. 총 306개의 마이크로RNA 종은 마이크로RNA 122에 매핑하는 가장 많은 수의 판독으로 검출되었다. microRNA의 정확한 복구를 가능하게 하기 위하여 적당한 크기로 젤을 잘라내는 것을 기억하는 것이 중요합니다.microRNAs를 시퀀싱한 후, 사용자는 생물정보학 분석을 적용하여 관심 있는 조직 내에서 microRNA의 분포를 특성화할 수 있습니다. 이 기술은 microRNA가 어떻게 처리되는지 그리고 특정 암에서 어떤 microRNA 세트가 변경되는지 를 확인하기 위하여 이용되었습니다. 에티듐 브로마이드를 다룰 때와 자외선 아래에서 젤을 볼 때주의하십시오.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Genetics

Unit 1

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

연구

유전학

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

다음-세대 시퀀싱과 생물 정보학 파이프라인 헌법 질병의 유전 결정 요인 평가 대상

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 Tardigrade 견본에서 라이브러리 준비

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

질량 분석 기반 Proteomics 분석 소설 단백질을 공개할 OpenProt 데이터베이스를 사용 하 여 비 정식 열려있는 독서 프레임에서 번역

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...