Name: a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools
Uploaded: 2019-08-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

Vi vil gjerne takke medlemmer av laboratorier av Andrew fire og Markus Kay for veiledning og forslag.

Animal eksperimenter ble godkjent av den institusjonelle Animal Care og bruk komité ved University of Washington.
Liten RNA-bibliotek forberedelse
1. RNA-isolasjon
<ol><li>Isoler RNA fra en biologisk kilde ved hjelp av en standard RNA isolasjons reagens, eller et sett som beriker for microRNAs. For vev, er det best å starte med prøver snap-frosset i flytende nitrogen og bakken til et pulver ved hjelp av en pre-kjølt mørtel og m...

<ol>
	<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+MicroRNAs.">Metazoan MicroRNAs.</a> Cell. 173 (1), 20-51 (2018).</li><li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+class+of+tiny+RNAs+with+probable+regulatory+roles+in+Caenorhabditis+elegans.">An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li><li>Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+small+RNAs+in+animals.">Biogenesis of small RNAs in animals.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loop+position+of+shRNAs+and+pre-miRNAs+is+critical+for+the+accuracy+of+dicer+processing+in+vivo.">The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo.</a> Cell. 151 (4), 900-911 (2012).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-induced+hepatotoxicity+results+from+loss+of+the+first+synthesized+isoform+of+microRNA-122+in+mice.">RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice.</a> Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+removal+in+the+liver+activates+imprinted+microRNAs+and+enables+more+effective+microRNA-mediated+gene+repression.">miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression.</a> Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+Registry.">The microRNA Registry.</a> Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).</li><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).</li><li>Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sailfish+enables+alignment-free+isoform+quantification+from+RNA-seq+reads+using+lightweight+algorithms.">Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Small+RNA+NGS+Libraries+from+Biofluids.">Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids.</a> Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).</li><li>Yamane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hepatitis+C+virus+RNA+target+site+selection+and+host+factor+activities+of+naturally+occurring+miR-122+3+variants.">Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).</li><li>Giraldez, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+multi-center+assessment+of+small+RNA-seq+methods+for+quantitative+miRNA+profiling.">Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling.</a> Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).</li><li>Yeri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+small+RNASeq+library+preparation+kits+using+low+input+RNA.">Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA.</a> BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).</li><li>Coenen-Stass, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methodologies+for+microRNA+biomarker+detection+by+next+generation+sequencing.">Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing.</a> RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).</li><li>Baran-Gale, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+Bias+in+Small+RNA+Library+Preparation+for+Sequencing:+A+New+Protocol+Recovers+MicroRNAs+that+Evade+Capture+by+Current+Methods.">Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods.</a> Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+the+microRNA+cluster+at+the+Dlk1-Dio3+locus+in+lung+adenocarcinoma.">Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma.</a> Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).</li><li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Normalization+Strategies+for+MicroRNA+Quantification.">Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification.</a> Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).</li><li>Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+RNA+ligase+2+truncated+active+site+mutants:+improved+tools+for+RNA+analysis.">T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis.</a> BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).</li><li>Chiang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes &amp; Development. 24 (10), 992-1009 (2010).</li><li>Fromm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Uniform+System+for+the+Annotation+of+Vertebrate+microRNA+Genes+and+the+Evolution+of+the+Human+microRNAome.">A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome.</a> Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).</li></ol>

Til tross for identifisering av microRNAs over 20 år siden13, prosessen med microRNA sekvensering fortsatt arbeidskrevende og krever spesialisert utstyr, hindrer laboratorier fra rutinemessig vedta interne protokoller14. Andre teknikker kan samtidig evaluere microRNAs, som microRNA Microarrays og multiplekset uttrykks paneler; Imidlertid er disse tilnærmingene begrenset i at de bare kvantifisere microRNAs stede i sin sonde satt. På grunn av dette, savner de viktige funks...

Først oppdaget i 19931, er det nå anslått at nesten 2000 microRNAs er til stede i den menneskelige Genova2. MicroRNAs er små ikke-koding RNAs som vanligvis er 21-24 nukleotider lang. De er post-transcriptional regulatorer av genuttrykk, ofte bindende for komplementære steder i 3-uoversatt regionen (3-UTR) av mål gener å undertrykke protein uttrykk og forringe mRNA. Kvantifisere microRNAs kan gi verdifull innsikt i genuttrykk og flere protokoller er utviklet for dette formålet3.
Vi har utviklet en definert, reproduserbar og langvarig protokoll for små RNA-sekvenser, og for å analysere normalisert leser ved hjelp av åpen kildekode-Bioinformatikk verktøy. Viktigere, vår protokoll muliggjør samtidig identifisering av både endogene microRNAs og exogenously levert konstruksjoner som produserer microRNA-lignende arter, mens minimere leser som kart til andre små RNA arter, inkludert ribosomal RNAs ( rRNAs), overføre RNA-avledet små RNAs (tsRNAs), REPEAT-avledet liten RNAs, og mRNA nedbrytningsprodukter. Heldigvis, microRNAs er 5-fosforylert og 2-3 hydroksylerte4, en funksjon som kan utnyttes til å skille dem fra disse andre små RNAs og mRNA fornedrelse produkter. Flere kommersielle alternativer finnes for microRNA kloning og sekvensering som ofte er raskere og enklere å multiplex; den proprietære typen av Kit-reagenser og de hyppige endringene gjør imidlertid det utfordrende å sammenligne prøvekjøringer. Strategien vår optimaliserer innsamling av kun riktig størrelse på microRNAs gjennom akrylamid og agarose. I denne protokollen beskriver vi også en prosedyre for å samkjøre sekvens leser til microRNAs ved hjelp av åpen kildekode-verktøy. Dette settet med instruksjoner vil være spesielt nyttig for uerfarne informatikk brukere, uavhengig av om vårt bibliotek forberedelse metode eller en kommersiell metode brukes.
Denne protokollen har blitt brukt i flere publiserte studier. For eksempel ble det brukt til å identifisere mekanismen som Dicer enzymet kløyver små hæler RNAs i en avstand på to nukleotider fra den interne sløyfen av stammen-loop struktur-den såkalte "loop-telling regelen"5. Vi har også fulgt disse metodene for å identifisere den relative overflod av leverte små hæler RNAs (shRNA) uttrykt fra rekombinant adeno-assosiert viral vektorer (rAAVs), for å identifisere terskelen til shRNA uttrykk som kan tolereres før leveren toksisitet forbundet med overflødig shRNA-uttrykk6. Ved hjelp av denne protokollen, vi også identifisert microRNAs i leveren som reagerer på fraværet av microRNA-122-en svært uttrykt hepatic microRNA-samtidig også karakteriserer nedbrytning mønster av denne microRNA7. Fordi vi har brukt vår protokoll konsekvent i mange eksperimenter, har vi vært i stand til å observere prøve preparater lengderetningen, og se at det ikke er noen merkbar batch effekter.
I deler denne protokollen, er vårt mål å gjøre det mulig for brukere å generere høy kvalitet, reproduserbar kvantifisering av microRNAs i praktisk talt alle vev eller cellelinje, ved hjelp av rimelig utstyr og reagenser, og gratis Bioinformatikk verktøy.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19:1 bis-acrylamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 bp DNA step ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phenol/chloroform</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide RNA loading dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Buffer II</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Blue color helps in visualizing pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>45-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRVana microRNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>For generating small RNA sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusieve low-melting agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory sealing film)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-ethylene glycol 8000</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included with M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>For quantifying DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base pH 7.5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal miRNA cloning linker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools

Halvparten av alle menneskelige transkripsjoner antas å være regulert av microRNAs. Kvantifisere microRNA-uttrykk kan derfor avdekke underliggende mekanismer i sykdomstilstander og gi terapeutiske mål og biomarkører. Her detalj vi hvordan du nøyaktig kvantifisere microRNAs. Kort, denne metoden beskriver isolere microRNAs, ligating seg å adapter egnet til høy-produksjon sekvensering, forsterke det final produktene, og forbereder en eksemplar bibliotek. Deretter forklarer vi hvordan du kan justere den oppnådde sekvensering leser til microRNA pinner, og kvantifisere, normalisere, og beregne deres differensial uttrykk. Allsidig og robust, denne kombinert eksperimentell arbeidsflyt og Bioinformatic analyse gjør det mulig for brukere å begynne med vev utvinning og finish med microRNA kvantifisering.

Skjematisk av trinnene involvert i biblioteket forberedelse En generell skjematisk fremstilling av små RNA-ekstraksjon, sekvenser og innretting er skissert i figur 2. Leverprøver fra en mannlig og en kvinnelig mus ble samlet inn og snapper frosset i flytende nitrogen. Total RNA ble ekstrahert og evaluert for kvalitet og konsentrasjon.
Liten RNA-sekvensering gir tilst...

Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Her beskriver vi en trinnvis strategi for å isolere små RNAs, berikende for microRNAs og klargjøre prøver for sekvenser med høy gjennomstrømming. Vi beskriver hvordan du behandler sekvensen leser og justere dem til microRNAs, ved hjelp av åpen kildekode-verktøy.

En fullstendig rørledning for isolere og sekvensering MicroRNAs, og analyserer seg benytter åpen kilde verktøy

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Vi har utviklet en definert, reproduserbar og langvarig protokoll for liten RNA-sekvensering og for å analysere normaliserte lesinger ved hjelp av bioinformatikkverktøy med åpen kildekode. De viktigste fordelene med vår strategi er at den nøyaktig samler microRNAs gjennom gelrensing og at bioinformatikkanalysen kan brukes uavhengig av hvordan microRNAs samles inn. Sekvensering av mikroRPA-er med høy gjennomstrømning kan avsløre innsikt i sykdomsmekanismer, behandling av microRNAer og nøyaktig kvantifisering av genterapitilnærminger som leverer små RNA-er.Sørg for å arbeide i et RNase-fritt miljø og for å holde alle RNA-produktene på is gjennom hele prosedyren. Visualisering av gelkuttetrinnene vil hjelpe seerne med å identifisere riktig størrelse på produktene som kreves for nedstrøms applikasjoner. For tre prime adaptor ligation, kombinere 11 mikroliter RNA med 1,5 mikroliter ATP gratis 10X T4RNA ligase reaksjonsbuffer, en mikroliter av polyetylenglykol, og 0,5 mikroliter av tre prime linker.Varm prøvene ved 95 grader Celsius på en termocycler i 30 til 40 sekunder, etterfulgt av kjøling på is i ett minutt. Tilsett en mikroliter t4RNA ligase to og inkuber reaksjonen ved romtemperatur i to timer. Mens prøvene inkuberer, hell en 15% polyakyrilamidgel mellom 0,8 millimeter separerte glassplater i en plaststøpt og sett inn en kam.Når gelen har størknet, tilsett 0,5 5X TBE til tanken og pipetten kraftig for å vaske brønnene av gjenværende urea. Etter å ha kjørt polyakrylamidgelen i 25 minutter ved 375 volt, last prøvene og la minst ett kjørefelt mellom hver prøve. Legg 20 mikroliter med minst to sett med markører i et asymmetrisk mønster for å holde styr på gelorienteringen og kjøre gelen på konstante 375 volt.Etter 15 minutter øker du til en konstant 425 volt for resten av løpet og kjører gelen i ca to timer. På slutten av løpet, bruk en plateseparator for å fjerne gelen fra glassplatene og legg gelen på en plastsidebeskytter. Fortynn fem mikroliter ethidiumbromid i 500 mikroliter destillert vann og tilsett fargestoffet på markørbanene like over den øverste lyseblå markøren.Deretter bruker du et rent barberblad til å kutte gelene fra øvre til nedre markør i hvert kjørefelt under ultrafiolett lys og overføre bitene til en fire og fire centimeter kvadrat av laboratorietetningsfilm. Klipp gelen med omtrent tre kutt horisontalt og to kutt vertikalt for å produsere 12 små firkanter. Tilsett 400 mikroliter med 0,3 molarnatriumklorid på tetningsfilmen og før gelbitene i 1,5 milliliter silikoniserte rør.Agiter prøvene på en nutator ved fire grader Celsius over natten. Neste morgen, overføre 400 mikroliter av hver supernatant til nye rør. Tilsett en milliliter 100% etanol og en mikroliter på 15 milligram per milliliter glykogen co-precipitant per rør.Deretter lagrer rørene på minus 80 grader Celsius i en time. For fem prime linker ligation, først spinne ned de tinte prøvene og gjenbruk pellets i vann. Deretter legger du til 0,5 mikroliter på 100 mikromos fem prime linker, en mikroliter T4RNA ligase buffer, en mikroliter på 10 millimolar ATP, og en mikroliter polyetylenglykol til hver prøve.Varm reaksjonene ved 90 grader Celsius i 30 sekunder før du plasserer dem på is. Deretter legger du til en mikroliter T4RNA ligase en til hvert rør og inkubere reaksjonene ved romtemperatur i to timer. For omvendt transkripsjon, samle prøvene ved sentrifugering og gjenbruke lufttørket pellet i 8,25 mikroliter kjerner fri vann.Tilsett 0,5 mikroliter med 100 mikromolar reverstranskriptase primer og fem mikroliter av 2X omvendt transkripsjon reaksjon blanding fra en komplementær DNA syntese kit. Etter tre minutter ved 42 grader Celsius, tilsett 1,5 mikroliter på 10X omvendt transkripsjonsenzym til hver prøve for en 30 minutters inkubasjon ved 42 grader Celsius i en termocycler. Etter nøytralisering, forberede en PCR reaksjon med 29,5 mikroliter vann, fem mikroliter med 10X taq buffer, en mikroliter nukleosid trifosfat, to mikroliter av 25 mikromolar fremover primer, to mikroliter på 25 mikropor omvendt primer, 0,5 mikroliter taq polymerase, og 10 mikroliter av omvendt transkribert komplementære DNA.Kjør deretter to PCR-reaksjoner. For agarose gel rensing, forberede en 4% agarose gel med lav smeltende agarose og laste 40 mikroliter eller mer av PCR produktet på gelen med lasting fargestoff og 100 base par og 25 base par størrelse markører. Etter å ha kjørt gelen, kutt båndet over 125 base pair band og bruk et gelekstraksjonssett i henhold til produsentens instruksjoner.Rist for å oppløse gelbåndet i buffer ved romtemperatur før du bruker riktig utstyr til å kvantifisere det endelige sekvensbiblioteket. Bruk deretter de riktige opensource bioinformatikkverktøyene til å analysere sekvensdataene. I denne representative PCR-reaksjonen på fettsmelter agarose gel, kan oppkjøpet av riktig klonet produkt i forhold til det oppnådde linker linkerproduktet og umettede versus mettede prøver observeres.Etter justering til menneskelige microRNA hårnåler, kan en sterk konkordans mellom microRNA lese teller i hver repliker kan observeres. Totalt 306 microRNA arter ble oppdaget med størst antall leser kartlegging til microRNA 122. Det er viktig å huske å kutte gelene i riktig størrelse for å muliggjøre en nøyaktig gjenoppretting av microRNAs.Etter sekvensering av microRNAs, kan brukerne bruke en bioinformatikkanalyse for å karakterisere fordelingen av microRNAs i deres vev av interesse. Denne teknikken har blitt brukt til å identifisere hvordan microRNAs behandles og hvilke sett med microRNAs endres i visse kreftformer. Pass på å trene forsiktighet når du håndterer ethidiumbromid og når du ser på gelene under ultrafiolett lys.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Genetics

Unit 1

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolasjon og høy gjennomstrømming sekvensering biblioteket konstruksjon for Herbarium prøver

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Neste generasjons sekvensering og bioinformatikk rørledning for å evaluere genetisk determinanter av konstitusjonelle sykdom

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjelden hendelse gjenkjenning feil-korrigert DNA og RNA sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

En rask og lettvint rørledning for generering Genomic punkt mutanter i C. elegans bruker CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow inngang genomet sekvensering biblioteket forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøven

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høy gjennomstrømming identifikasjon av regulatoriske gensekvenser med neste generasjons sekvensering av runde kromosom konformasjon fange (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolere, sekvensering og analysere ekstracellulære MicroRNAs fra menneskelige stamceller

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sekvensering av mRNA fra hele Blood bruke Nanopore sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Masse massespektrometri-baserte Proteomikk analyser bruker OpenProt databasen å avsløre romanen proteiner oversatt fra ikke-kanoniske åpent lesing rammer

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...