Name: a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools
Uploaded: 2019-08-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer aos membros dos laboratórios de Andrew Fire e Mark Kay por orientação e sugestões.

Experimentos com animais foram autorizados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Washington.
Preparação pequena da biblioteca do RNA
1. isolação do RNA
<ol><li>Isole o RNA de uma fonte biológica usando um reagente padrão do isolamento do RNA, ou um jogo que enriquece para microRNAs. Para os tecidos, é melhor começar com amostras snap-congelado em nitrogênio líquido e terra a um pó usan...

<ol>
	<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+MicroRNAs.">Metazoan MicroRNAs.</a> Cell. 173 (1), 20-51 (2018).</li><li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+class+of+tiny+RNAs+with+probable+regulatory+roles+in+Caenorhabditis+elegans.">An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li><li>Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+small+RNAs+in+animals.">Biogenesis of small RNAs in animals.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loop+position+of+shRNAs+and+pre-miRNAs+is+critical+for+the+accuracy+of+dicer+processing+in+vivo.">The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo.</a> Cell. 151 (4), 900-911 (2012).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-induced+hepatotoxicity+results+from+loss+of+the+first+synthesized+isoform+of+microRNA-122+in+mice.">RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice.</a> Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+removal+in+the+liver+activates+imprinted+microRNAs+and+enables+more+effective+microRNA-mediated+gene+repression.">miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression.</a> Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+Registry.">The microRNA Registry.</a> Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).</li><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).</li><li>Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sailfish+enables+alignment-free+isoform+quantification+from+RNA-seq+reads+using+lightweight+algorithms.">Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Small+RNA+NGS+Libraries+from+Biofluids.">Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids.</a> Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).</li><li>Yamane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hepatitis+C+virus+RNA+target+site+selection+and+host+factor+activities+of+naturally+occurring+miR-122+3+variants.">Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).</li><li>Giraldez, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+multi-center+assessment+of+small+RNA-seq+methods+for+quantitative+miRNA+profiling.">Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling.</a> Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).</li><li>Yeri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+small+RNASeq+library+preparation+kits+using+low+input+RNA.">Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA.</a> BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).</li><li>Coenen-Stass, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methodologies+for+microRNA+biomarker+detection+by+next+generation+sequencing.">Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing.</a> RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).</li><li>Baran-Gale, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+Bias+in+Small+RNA+Library+Preparation+for+Sequencing:+A+New+Protocol+Recovers+MicroRNAs+that+Evade+Capture+by+Current+Methods.">Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods.</a> Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+the+microRNA+cluster+at+the+Dlk1-Dio3+locus+in+lung+adenocarcinoma.">Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma.</a> Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).</li><li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Normalization+Strategies+for+MicroRNA+Quantification.">Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification.</a> Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).</li><li>Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+RNA+ligase+2+truncated+active+site+mutants:+improved+tools+for+RNA+analysis.">T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis.</a> BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).</li><li>Chiang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes &amp; Development. 24 (10), 992-1009 (2010).</li><li>Fromm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Uniform+System+for+the+Annotation+of+Vertebrate+microRNA+Genes+and+the+Evolution+of+the+Human+microRNAome.">A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome.</a> Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).</li></ol>

Apesar da identificação de microRNAs há mais de 20 anos,13, o processo de sequenciamento de microRNA permanece trabalhoso e requer equipamentos especializados, impedindo que os laboratórios adotem rotineiramente os protocolos em casa14. Outras técnicas podem simultaneamente avaliar microRNAs, como Microarrays microRNA e painéis de expressão multiplexados; Entretanto, estas aproximações são limitadas que quantificam somente o microRNAs atual em seu jogo da ponta de...

Descoberto pela primeira vez em 19931, estima-se agora que cerca de 2000 microRNAs estão presentes no genoma humano2. MicroRNAs são pequenos não-codificando RNAs que são tipicamente 21-24 nucleotídeos longo. São reguladores pós-transcripcionais da expressão gênica, muitas vezes vinculando-se a sítios complementares na região 3-não traduzida (3-UTR) de genes alvo para reprisarem a expressão protéica e degradar o mRNA. Quantificando microRNAs pode dar uma visão valiosa sobre a expressão gênica e vários protocolos foram desenvolvidos para esta finalidade3.
Nós desenvolvemos um protocolo definido, reprodutível, e de longa data para o sequenciamento de RNA pequeno, e para analisar leituras normalizadas usando ferramentas de Bioinformática de código aberto. É importante ressaltar que nosso protocolo possibilita a identificação simultânea de microRNAs endógenos e construções exogenamente entregues que produzem espécies semelhantes a microRNA, enquanto minimiza leituras que mapeiam para outras espécies de RNA pequenas, incluindo RNAs ribossômicas ( rRNAs), transferir RNAs pequenas derivadas de RNA (tsRNAs), RNAs pequenas derivadas de repetição e produtos de degradação de mRNA. Felizmente, os microRNAs são 5-fosforilados e 2-3 hidroxilados4, um recurso que pode ser aproveitado para separá-los dessas outras pequenas RNAs e produtos de degradação de mRNA. Existem várias opções comerciais para a clonagem e sequenciamento do microRNA que muitas vezes são mais rápidas e fáceis de multiplexação; no entanto, a natureza proprietária de reagentes de kit e suas modificações freqüentes faz comparando amostra corre desafiador. Nossa estratégia otimiza a coleta apenas o tamanho correto de microRNAs através de acrilamida e etapas de purificação de gel de agarose. Neste protocolo, também descrevemos um procedimento para alinhar leituras de sequência a microRNAs usando ferramentas de código aberto. Este conjunto de instruções será especialmente útil para usuários de informática novatos, independentemente de se o nosso método de preparação de biblioteca ou um método comercial é usado.
Este protocolo tem sido utilizado em vários estudos publicados. Por exemplo, ele foi usado para identificar o mecanismo pelo qual a enzima Dicer cliva pequenas RNAs hairpin a uma distância de dois nucleotídeos do laço interno da estrutura de loop-tronco-a chamada "regra de contagem de loop"5. Nós igualmente seguimos estes métodos para identificar a abundância relativa de RNAs pequenos entregados do hairpin (shRNA) expressado dos vetores virais adeno-associados de recombinação (rAAVs), para identificar o ponto inicial da expressão de shRNA que pode ser tolerada antes do fígado toxicidade associada à expressão excessiva de shRNA6. Usando este protocolo, nós igualmente identificamos microRNAs no fígado que respondem à ausência de microRNA-122-um microRNA hepatic altamente expressado-ao igualmente caracterizar o teste padrão da degradação deste microRNA7. Porque nós usamos nosso protocolo consistentemente em experiências numerosas, nós pudemos observar longitudinalmente preparações da amostra, e vemos que não há nenhum efeito discernível do grupo.
Ao compartilhar este protocolo, nosso objetivo é permitir que os usuários gerem alta qualidade, quantificação reprodutível de microRNAs em praticamente qualquer linha de tecido ou célula, usando equipamentos e reagentes acessíveis e ferramentas de Bioinformática gratuitas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19:1 bis-acrylamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 bp DNA step ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phenol/chloroform</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide RNA loading dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Buffer II</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Blue color helps in visualizing pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>45-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRVana microRNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>For generating small RNA sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusieve low-melting agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory sealing film)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-ethylene glycol 8000</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included with M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>For quantifying DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base pH 7.5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal miRNA cloning linker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools

A metade de todas as transcrições humanas é pensada para ser regulada por microRNAs. Portanto, a quantificação da expressão de microRNA pode revelar mecanismos subjacentes nos Estados de doença e fornecer alvos terapêuticos e biomarcadores. Aqui, detalhamos como quantificar com precisão microRNAs. Resumidamente, este método descreve isolando microRNAs, ligando-os a adaptadores adequados para sequenciamento de alta taxa de transferência, amplificando os produtos finais e preparando uma biblioteca de exemplo. Em seguida, explicamos como alinhar as leituras de sequenciamento obtidas aos grampos de cabelo microRNA e quantificar, normalizar e calcular sua expressão diferencial. Versátil e robusto, este fluxo de trabalho experimental combinado e a análise Bioinformatica permitem que os usuários comecem com a extração do tecido e termine com quantificação de microRNA.

Esquema das etapas envolvidas na preparação da biblioteca Um esquema geral de extração, seqüenciamento e alinhamento de RNA pequeno é descrito na Figura 2. Amostras de fígado de um macho e de um rato fêmea foram coletadas e estalaram congelado no nitrogênio líquido. O RNA total foi extraído e avaliado quanto à qualidade e concentração.
O sequenciamento de...

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A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Aqui, descrevemos uma estratégia passo a passo para isolar pequenas RNAs, enriquecedora para microRNAs e preparando amostras para sequenciamento de alta taxa de transferência. Em seguida, descrevemos como processar leituras de sequência e alinhá-las ao microRNAs, usando ferramentas de código aberto.

Um pipeline completo para isolar e sequenciar MicroRNAs e analisá-los usando ferramentas de código aberto

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Desenvolvemos um protocolo definido, reprodutível e de longa data para sequenciamento de RNA pequeno e para análise de leituras normalizadas usando ferramentas de bioinformática de código aberto. As principais vantagens de nossa estratégia são que ela coleta com precisão microRNAs através da purificação de gel e que a análise bioinformática pode ser aplicada independentemente de como as microRNAs são coletadas. O sequenciamento de alto rendimento das microRNAs pode revelar a percepção sobre os mecanismos da doença, o processamento de microRNAs e a quantificação precisa de abordagens de terapia genética que fornecem pequenas RNAs.Certifique-se de trabalhar em um ambiente livre de RNase e manter todos os produtos de RNA no gelo durante todo o procedimento. Visualizar as etapas de corte de gel ajudará os espectadores a identificar o tamanho correto dos produtos necessários para aplicações a jusante. Para três ligaduras principais adaptadores, combine 11 microliters de RNA com 1,5 microliters de tampão de reação ligase ATP free 10X T4RNA, um microliter de polietileno glicol e 0,5 microliters de três elos principais.Aqueça as amostras a 95 graus Celsius em um termociclador por 30 a 40 segundos, seguido de resfriamento no gelo por um minuto. Adicione um microliter de ligase T4RNA dois e incubar a reação à temperatura ambiente por duas horas. Enquanto as amostras estão incubando, despeje um gel de poliacrilamida de 15% entre placas de vidro separadas de 0,8 milímetros em um molde plástico e insira um pente.Quando o gel se solidificar, adicione 0,5 5X TBE ao tanque e a pipeta vigorosamente para lavar os poços de ureia residual. Depois de pré-executar o gel de poliacrilamida por 25 minutos a 375 volts, carregue as amostras deixando pelo menos uma faixa entre cada amostra. Carregue 20 microliters de pelo menos dois conjuntos de marcadores em um padrão assimétrico para acompanhar a orientação do gel e executar o gel a uma constante de 375 volts.Após 15 minutos, aumente para 425 volts constantes para o resto da corrida e execute o gel por cerca de duas horas. No final da corrida, use um separador de placas para remover o gel das placas de vidro e coloque o gel em um protetor de página de plástico. Diluir cinco microliters de brometo de etídio em 500 microliters de água destilada e adicionar o corante nas pistas de marcadores logo acima do marcador azul claro superior.Em seguida, use uma lâmina de barbear limpa para cortar os géis do marcador superior para inferior em cada pista sob luz ultravioleta e transfira as peças para um quadrado de quatro por quatro centímetros de filme de vedação de laboratório. Corte o gel com cerca de três cortes horizontalmente e dois cortes verticalmente para produzir 12 pequenos quadrados. Adicione 400 microliters de 0,3 cloreto de sódio molar na máquina de selar e guie as peças de gel em tubos siliconados de 1,5 mililitro.Agitar as amostras em um nutador a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, transfira 400 microliters de cada supernatante para novos tubos. Adicione um mililitro de 100% de etanol e um microliter de 15 miligramas por mililitro glycogen co-precipitante por tubo.Em seguida, armazene os tubos a menos 80 graus Celsius por uma hora. Para cinco ligaduras de linker prime, primeiro gire as amostras descongeladas e resuspenque as pelotas na água. Em seguida, adicione 0,5 microliters de 100 micromolar cinco prime linker, um microliter de tampão ligase T4RNA, um microliter de 10 milimólares ATP, e um microliter de polietileno glicol para cada amostra.Aqueça as reações a 90 graus Celsius por 30 segundos antes de colocá-las no gelo. Em seguida, adicione um microliter de ligase T4RNA um a cada tubo e incubar as reações à temperatura ambiente por duas horas. Para transcrição reversa, colete as amostras por centrifugação e resuspenja a pelota seca de ar em 8,25 microliters de água livre de nuclease.Adicione 0,5 microliters de 100 primer de transcriptase reversa micromolar e cinco microliters de mistura de reação de transcriptase reversa 2X de um kit de síntese de DNA complementar. Após três minutos a 42 graus Celsius, adicione 1,5 microliters de enzima transcriptase reversa de 10X a cada amostra para uma incubação de 30 minutos a 42 graus Celsius em um termociclador. Após a neutralização, preparar uma reação pcr com 29,5 microliters de água, cinco microliters de tampão taq 10X, um microliter de triphosfato nucleosídeo, dois microliters de 25 primer dianteiro micromolar, dois microliters de 25 primer reverso micromolar, 0,5 microliters de poliase taqmer, e 10 microliters do DNA reverso transcrito.Em seguida, execute duas reações pcr. Para purificação de gel de agarose, prepare um gel de 4% de agarose com baixa ágarose de fusão e carregue 40 microliters ou mais do produto PCR no gel com corante de carga e par de 100 bases e 25 marcadores de tamanho de par de base. Depois de executar o gel, corte a banda acima da faixa de 125 bases e use um kit de extração de gel de acordo com as instruções do fabricante.Agite para dissolver a banda de gel em tampão à temperatura ambiente antes de usar o equipamento apropriado para quantificar a biblioteca de sequência final. Em seguida, use as ferramentas de bioinformática de código aberto apropriadas para analisar os dados de sequência. Nesta reação representativa do PCR em gel de agarose de baixo derretimento, pode-se observar a aquisição do produto clonado correto em comparação com o produto linker obtido e amostras insaturadas versus saturadas.Após o alinhamento com os grampos de microRNA humanos, pode-se observar uma forte concordância entre as contagens de leitura de microRNA em cada réplica. Um total de 306 espécies de microRNA foram detectadas com o maior número de leituras mapeando para microRNA 122. É importante lembrar de cortar os géis no tamanho apropriado para permitir uma recuperação precisa das microRNAs.Após o sequenciamento das microRNAs, os usuários podem aplicar uma análise bioinformática para caracterizar a distribuição de microRNAs dentro de seus tecidos de interesse. Esta técnica tem sido usada para identificar como microRNAs são processadas e quais conjuntos de microRNAs são alterados em certos cânceres. Certifique-se de exercitar os cuidados ao manusear o brometo de ethidium e ao olhar para os géis sob luz ultravioleta.

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Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

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