Name: a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools
Uploaded: 2019-08-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

Nos gustaría dar las gracias a los miembros de los laboratorios de Andrew Fire y Mark Kay por su orientación y sugerencias.

Los experimentos con animales fueron autorizados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Washington.
Preparación de la biblioteca de ARN pequeño
1. Aislamiento de ARN
<ol><li>Aísle el ARN de una fuente biológica utilizando un reactivo de aislamiento de ARN estándar, o un kit que enriquezca para los microARN. Para los tejidos, lo mejor es comenzar con muestras congeladas en nitrógeno líqu...

<ol>
	<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+MicroRNAs.">Metazoan MicroRNAs.</a> Cell. 173 (1), 20-51 (2018).</li><li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+class+of+tiny+RNAs+with+probable+regulatory+roles+in+Caenorhabditis+elegans.">An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li><li>Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+small+RNAs+in+animals.">Biogenesis of small RNAs in animals.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loop+position+of+shRNAs+and+pre-miRNAs+is+critical+for+the+accuracy+of+dicer+processing+in+vivo.">The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo.</a> Cell. 151 (4), 900-911 (2012).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-induced+hepatotoxicity+results+from+loss+of+the+first+synthesized+isoform+of+microRNA-122+in+mice.">RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice.</a> Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+removal+in+the+liver+activates+imprinted+microRNAs+and+enables+more+effective+microRNA-mediated+gene+repression.">miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression.</a> Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+Registry.">The microRNA Registry.</a> Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).</li><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).</li><li>Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sailfish+enables+alignment-free+isoform+quantification+from+RNA-seq+reads+using+lightweight+algorithms.">Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Small+RNA+NGS+Libraries+from+Biofluids.">Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids.</a> Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).</li><li>Yamane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hepatitis+C+virus+RNA+target+site+selection+and+host+factor+activities+of+naturally+occurring+miR-122+3+variants.">Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).</li><li>Giraldez, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+multi-center+assessment+of+small+RNA-seq+methods+for+quantitative+miRNA+profiling.">Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling.</a> Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).</li><li>Yeri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+small+RNASeq+library+preparation+kits+using+low+input+RNA.">Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA.</a> BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).</li><li>Coenen-Stass, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methodologies+for+microRNA+biomarker+detection+by+next+generation+sequencing.">Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing.</a> RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).</li><li>Baran-Gale, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+Bias+in+Small+RNA+Library+Preparation+for+Sequencing:+A+New+Protocol+Recovers+MicroRNAs+that+Evade+Capture+by+Current+Methods.">Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods.</a> Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+the+microRNA+cluster+at+the+Dlk1-Dio3+locus+in+lung+adenocarcinoma.">Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma.</a> Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).</li><li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Normalization+Strategies+for+MicroRNA+Quantification.">Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification.</a> Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).</li><li>Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+RNA+ligase+2+truncated+active+site+mutants:+improved+tools+for+RNA+analysis.">T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis.</a> BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).</li><li>Chiang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes &amp; Development. 24 (10), 992-1009 (2010).</li><li>Fromm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Uniform+System+for+the+Annotation+of+Vertebrate+microRNA+Genes+and+the+Evolution+of+the+Human+microRNAome.">A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome.</a> Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).</li></ol>

A pesar de la identificación de microARN hace más de 20 años13, el proceso de secuenciación de microARN sigue siendo laborioso y requiere equipos especializados, impidiendo a los laboratorios adoptar rutinariamente protocolos internos14. Otras técnicas pueden evaluar simultáneamente los microARN, como microarrays de microARN y paneles de expresión multiplexados; sin embargo, estos enfoques son limitados en el que sólo cuantifican los microRNAs presentes en su conjun...

Descubierto por primera vez en 19931, ahora se estima que casi 2000 microARN están presentes en el genoma humano2. Los MicroRNAs son ARN pequeños que no codifican y que suelen tener entre 21 y 24 nucleótidos de largo. Son reguladores post-transcripcionales de la expresión génica, a menudo uniéndose a sitios complementarios en la región 3 no traducida (3-UTR) de genes diana para reprimir la expresión de proteínas y degradar el ARNm. La cuantificación de los microARN puede proporcionar información valiosa sobre la expresión génica y se han desarrollado varios protocolos para este propósito3.
Hemos desarrollado un protocolo definido, reproducible y de larga data para la secuenciación de ARN pequeño, y para analizar lecturas normalizadas utilizando herramientas bioinformáticas de código abierto. Es importante destacar que nuestro protocolo permite la identificación simultánea de microARN endógenos y construcciones exógenas que producen especies similares a microARN, al tiempo que minimiza las lecturas que se asignan a otras especies de ARN pequeños, incluyendo ARN ribosomales ( rRNAs), transferir ARN pequeños derivados del ARN derivados del ARN (trnA), ARN pequeños derivados de repetición y productos de degradación de ARNm. Afortunadamente, los microRNAs son 5-fosforilados y 2-3 hidroxilados4, una característica que se puede aprovechar para separarlos de estos otros pequeños ARN y productos de degradación de ARNm. Existen varias opciones comerciales para la clonación y secuenciación de microARN que a menudo son más rápidas y fáciles de multiplexar; sin embargo, la naturaleza propietaria de los reactivos del kit y sus modificaciones frecuentes hace que comparar las corridas de muestras sea un reto. Nuestra estrategia optimiza la recolección de sólo el tamaño correcto de los microRNAs a través de pasos de purificación de gel de acrilamida y agarosa. En este protocolo, también se describe un procedimiento para alinear las lecturas de secuencia con los microRNAs mediante herramientas de código abierto. Este conjunto de instrucciones será especialmente útil para los usuarios de informática novato, independientemente de si se utiliza nuestro método de preparación de bibliotecas o un método comercial.
Este protocolo se ha utilizado en varios estudios publicados. Por ejemplo, se utilizó para identificar el mecanismo por el cual la enzima Dicer corta ARN de horquilla pequeña a una distancia de dos nucleótidos del bucle interno de la estructura de bucle de tallo - la llamada "regla de recuento de bucles"5. También seguimos estos métodos para identificar la abundancia relativa de ARN de horquilla pequeña (shRNA) entregados a partir de vectores virales adeno-asociados a la recombinante (RAAVs), para identificar el umbral de expresión de ARNS pequeños que se puede tolerar antes del hígado toxicidad asociada con el exceso de expresión de ARNH6. Utilizando este protocolo, también identificamos microARN en el hígado que responden a la ausencia de microARN-122 - un microARN hepático altamente expresado - al mismo tiempo que caracterizan el patrón de degradación de este microARN7. Debido a que hemos utilizado nuestro protocolo consistentemente en numerosos experimentos, hemos sido capaces de observar los preparativos de la muestra longitudinalmente, y ver que no hay efectos de lote discernibles.
Al compartir este protocolo, nuestro objetivo es permitir a los usuarios generar cuantificación reproducible de microRNAs de alta calidad en prácticamente cualquier tejido o línea celular, utilizando equipos y reactivos asequibles, y herramientas bioinformáticas gratuitas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19:1 bis-acrylamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 bp DNA step ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phenol/chloroform</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide RNA loading dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Buffer II</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Blue color helps in visualizing pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>45-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRVana microRNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>For generating small RNA sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusieve low-melting agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory sealing film)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-ethylene glycol 8000</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included with M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>For quantifying DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base pH 7.5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal miRNA cloning linker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools

Se cree que la mitad de todas las transcripciones humanas están reguladas por microARN. Por lo tanto, la cuantificación de la expresión de microARN puede revelar mecanismos subyacentes en los estados de la enfermedad y proporcionar dianas terapéuticas y biomarcadores. Aquí, detallamos cómo cuantificar con precisión los microRNAs. Brevemente, este método describe el aislemiento de microARN, ligando a adaptadores adecuados para la secuenciación de alto rendimiento, la amplificación de los productos finales y la preparación de una biblioteca de muestras. A continuación, explicamos cómo alinear las lecturas de secuenciación obtenidas con horquillas microRNA, y cuantificar, normalizar y calcular su expresión diferencial. Versátil y robusto, este flujo de trabajo experimental combinado y análisis bioinformático permite a los usuarios comenzar con la extracción de tejidos y terminar con la cuantificación de microARN.

Esquema de los pasos involucrados en la preparación de la biblioteca En la Figura 2se describe un esquema general de extracción, secuenciación y alineación de ARN pequeños. Se recogieron muestras de hígado de un ratón macho y una hembra y se congelaron en nitrógeno líquido. El ARN total se extrajo y evaluó la calidad y la concentración.
La secuenciación de ...

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A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Aquí, describimos una estrategia paso a paso para aislar pequeños ARN, enriquecer para microARN y preparar muestras para la secuenciación de alto rendimiento. A continuación, describimos cómo procesar lecturas de secuencia y alinearlas con microRNAs, utilizando herramientas de código abierto.

Una tubería completa para aislar y secuenciar microRNAs, y analizarlos mediante herramientas de código abierto

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Hemos desarrollado un protocolo definido, reproducible y de larga data para la secuenciación de ARN pequeño y para analizar lecturas normalizadas utilizando herramientas bioinformáticas de código abierto. Las principales ventajas de nuestra estrategia son que recoge con precisión los microRNAs a través de la purificación de gel y que el análisis bioinformático se puede aplicar independientemente de cómo se recojan los microRNAs. La secuenciación de alto rendimiento de los microRNAs puede revelar información sobre los mecanismos de la enfermedad, el procesamiento de microRNA y la cuantificación precisa de los enfoques de terapia génica que proporcionan ARN pequeños.Asegúrese de trabajar en un entorno libre de RNase y de mantener todos los productos de ARN en hielo durante todo el procedimiento. La visualización de los pasos de corte de gel ayudará a los espectadores a identificar el tamaño correcto de los productos necesarios para aplicaciones posteriores. Para tres ranurados de adaptadores primos, combine 11 microlitros de ARN con 1,5 microlitros de tampón de reacción ligasa 10X T4RNA libre de ATP, un microlitros de polietilenglicol y 0,5 microlitros de tres enlacedores primos.Calienta las muestras a 95 grados centígrados en un termociclador durante 30 a 40 segundos, seguido de enfriar sobre hielo durante un minuto. Añadir un microlitro de T4RNA ligasa dos e incubar la reacción a temperatura ambiente durante dos horas. Mientras las muestras están incubando, vierta un gel de poliacyrilamida al 15% entre placas de vidrio separadas de 0,8 milímetros en un molde de plástico e inserte un peine.Cuando el gel se haya solidificado, añadir 0,5 5X TBE al tanque y pipeta vigorosamente para lavar los pozos de urea residual. Después de pre-ejecutar el gel de poliacrilamida durante 25 minutos a 375 voltios, cargue las muestras dejando al menos un carril entre cada muestra. Cargue 20 microlitros de al menos dos conjuntos de marcadores en un patrón asimétrico para realizar un seguimiento de la orientación del gel y ejecutar el gel a una constante de 375 voltios.Después de 15 minutos, aumentar a una constante 425 voltios para el resto de la carrera y ejecutar el gel durante unas dos horas. Al final de la carrera, utilice un separador de placas para retirar el gel de las placas de vidrio y coloque el gel en un protector de página de plástico. Diluir cinco microlitros de bromuro de etidio en 500 microlitros de agua destilada y añadir el tinte a los carriles de marcador justo por encima del marcador azul claro superior.A continuación, utilice una cuchilla de afeitar limpia para cortar los geles del marcador superior a inferior en cada carril bajo la luz ultravioleta y transferir las piezas a un cuadrado de cuatro por cuatro centímetros de película de sellado de laboratorio. Cortar el gel con unos tres cortes horizontalmente y dos cortes verticalmente para producir 12 cuadrados pequeños. Agregue 400 microlitros de cloruro de sodio molar 0,3 a la película de sellado y guíe las piezas de gel en tubos siliconizados de 1,5 mililitros.Agitar las muestras en un nutator a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, transfiera 400 microlitros de cada sobrenadante a nuevos tubos. Añadir un mililitro de 100%etanol y un microlitro de 15 miligramos por mililitro de glucógeno co precipitante por tubo.A continuación, guarde los tubos a menos 80 grados centígrados durante una hora. Para cinco ligaduras de enlaces primos, primero gire hacia abajo las muestras descongeladas y resuspendir los pellets en agua. A continuación, agregue 0,5 microlitros de 100 micromolar cinco enlacedores primos, un microlitro de tampón de ligasa T4RNA, un microlitro de 10 ATP mililolar y un microlitro de polietilenglicol a cada muestra.Calienta las reacciones a 90 grados centígrados durante 30 segundos antes de colocarlas sobre hielo. A continuación, agregue un microlitros de T4RNA ligase uno a cada tubo e incubar las reacciones a temperatura ambiente durante dos horas. Para la transcripción inversa, recoger las muestras por centrifugación y resuspender el pellet seco al aire en 8.25 microlitros de agua libre de nucleasa.Añadir 0,5 microlitros de imprimación de transcriptasa inversa de 100 micromolares y cinco microlitros de mezcla de reacción de transcriptasa inversa 2X de un kit complementario de síntesis de ADN. Después de tres minutos a 42 grados Celsius, agregue 1,5 microlitros de enzima transcriptasa inversa 10X a cada muestra para una incubación de 30 minutos a 42 grados centígrados en un termociclador. Después de la neutralización, preparar una reacción PCR con 29,5 microlitros de agua, cinco microlitros de tampón de taq 10X, un microlitro de trifosfato de nucleósido, dos microlitros de 25 micromolares delanteros, dos microlitros de 25 micromolares de ADN inverso, 0,5 microlitros de taq polimerasa, y 10 microlitros de la mutua transcrita inversa.A continuación, ejecute dos reacciones PCR. Para la purificación del gel de agarosa, prepare un gel de 4% de agarosa con agarosa de baja fusión y cargue 40 microlitros o más del producto PCR en el gel con tinte de carga y 100 marcadores de tamaño de par base y 25. Después de ejecutar el gel, corte la banda por encima de la banda del par base 125 y utilice un kit de extracción de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Agitar para disolver la banda de gel en el tampón a temperatura ambiente antes de utilizar el equipo adecuado para cuantificar la biblioteca de secuencia final. A continuación, utilice las herramientas bioinformáticas de código abierto adecuadas para analizar los datos de secuencia. En esta reacción pcR representativa en gel de agarosa de bajo derretimiento, se puede observar la adquisición del producto clonado correcto en comparación con el producto de vinculador de vinculador obtenido y muestras insaturadas frente a saturadas.Después de la alineación con las horquillas de microARN humano, se puede observar una fuerte concordancia entre los recuentos de lectura de microARN en cada réplica. Se detectaron un total de 306 especies de microARN con el mayor número de lecturas cartografías a microRNA 122. Es importante recordar cortar los geles en el tamaño adecuado para permitir una recuperación precisa de los microRNAs.Después de secuenciar los microRNAs, los usuarios pueden aplicar un análisis bioinformático para caracterizar la distribución de microARN dentro de sus tejidos de interés. Esta técnica se ha utilizado para identificar cómo se procesan los microARN y qué conjuntos de microARN se alteran en ciertos tipos de cáncer. Asegúrese de tener cuidado al manipular el bromuro de etidio y al mirar los geles bajo la luz ultravioleta.

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Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

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Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

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