Name: a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools
Uploaded: 2019-08-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

Biz rehberlik ve öneriler için Andrew Fire ve Mark Kay laboratuvarları üyelerine teşekkür etmek istiyorum.

Hayvan deneyleri Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
Küçük RNA kitaplık hazırlığı
1. RNA yalıtımı
<ol><li>Standart bir RNA izolasyon reaktifi veya mikroRNA'lar için zenginleşen bir kit kullanarak RNA'yı biyolojik bir kaynaktan izole edin. Dokular için, önceden soğutulmuş harç ve havan topu kullanarak sıvı nitrojen ve zemin de dondurulmuş numuneler ile ba...

<ol>
	<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+MicroRNAs.">Metazoan MicroRNAs.</a> Cell. 173 (1), 20-51 (2018).</li><li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+class+of+tiny+RNAs+with+probable+regulatory+roles+in+Caenorhabditis+elegans.">An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li><li>Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+small+RNAs+in+animals.">Biogenesis of small RNAs in animals.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+loop+position+of+shRNAs+and+pre-miRNAs+is+critical+for+the+accuracy+of+dicer+processing+in+vivo.">The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo.</a> Cell. 151 (4), 900-911 (2012).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-induced+hepatotoxicity+results+from+loss+of+the+first+synthesized+isoform+of+microRNA-122+in+mice.">RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice.</a> Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+removal+in+the+liver+activates+imprinted+microRNAs+and+enables+more+effective+microRNA-mediated+gene+repression.">miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression.</a> Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).</li><li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+Registry.">The microRNA Registry.</a> Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).</li><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).</li><li>Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sailfish+enables+alignment-free+isoform+quantification+from+RNA-seq+reads+using+lightweight+algorithms.">Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Small+RNA+NGS+Libraries+from+Biofluids.">Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids.</a> Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).</li><li>Yamane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+hepatitis+C+virus+RNA+target+site+selection+and+host+factor+activities+of+naturally+occurring+miR-122+3+variants.">Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).</li><li>Giraldez, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+multi-center+assessment+of+small+RNA-seq+methods+for+quantitative+miRNA+profiling.">Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling.</a> Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).</li><li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing.">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).</li><li>Yeri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercially+available+small+RNASeq+library+preparation+kits+using+low+input+RNA.">Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA.</a> BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).</li><li>Coenen-Stass, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methodologies+for+microRNA+biomarker+detection+by+next+generation+sequencing.">Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing.</a> RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).</li><li>Baran-Gale, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+Bias+in+Small+RNA+Library+Preparation+for+Sequencing:+A+New+Protocol+Recovers+MicroRNAs+that+Evade+Capture+by+Current+Methods.">Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods.</a> Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).</li><li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing.">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).</li><li>Valdmanis, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+the+microRNA+cluster+at+the+Dlk1-Dio3+locus+in+lung+adenocarcinoma.">Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma.</a> Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).</li><li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Normalization+Strategies+for+MicroRNA+Quantification.">Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification.</a> Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).</li><li>Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+RNA+ligase+2+truncated+active+site+mutants:+improved+tools+for+RNA+analysis.">T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis.</a> BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).</li><li>Chiang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes &amp; Development. 24 (10), 992-1009 (2010).</li><li>Fromm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Uniform+System+for+the+Annotation+of+Vertebrate+microRNA+Genes+and+the+Evolution+of+the+Human+microRNAome.">A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome.</a> Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).</li></ol>

20 yıl önce13üzerinde mikroRNA belirlenmesine rağmen , mikroRNA sıralama süreci zahmetli kalır ve özel ekipman gerektirir, rutin in-house protokolleri benimseyen laboratuvarları engelleyen14. Diğer teknikler aynı anda mikroRNA'ları değerlendirebilir, mikroRNA mikrodizileri ve çok katlı ekspresyon panelleri gibi; ancak, bu yaklaşımlar sadece sonda setlerinde bulunan mikroRNA'ları ölçtükleri için sınırlıdır. Bu nedenle, onlar küçük RNA sıralama ?...

İlk olarak 1993 yılında keşfedilen1, şimdi yaklaşık 2000 mikroRNA'ların insan genomu 2'de bulunduğu tahmin edilmektedir. MikroRNA'lar genellikle 21-24 nükleotit uzunluğunda olan kodlamayan küçük RNA'lardır. Bunlar gen ekspresyonunun transkripsiyon sonrası düzenleyicileridir, genellikle protein ekspresyonunu bastırmak ve mRNA'yı düşürmek için hedef genlerin 3-untranslated bölgesindeki (3-UTR) tamamlayıcı bölgelere bağlanır. MikroRNA'ların ölçülmesi gen ekspresyonu hakkında değerli bilgiler verebilir vebu amaçla çeşitli protokoller geliştirilmiştir 3.
Küçük RNA sıralaması ve açık kaynak biyoinformatik araçları kullanarak normalleştirilmiş okumaları analiz etmek için tanımlanmış, tekrarlanabilir ve uzun süreli bir protokol geliştirdik. Daha da önemlisi, protokolümüz hem endojen mikroRNA'ların hem de mikroRNA benzeri türler üreten dışa dönük olarak teslim edilen yapılarla eşzamanlı olarak tanımlanmasını sağlarken, bu haritayı ribozomal RNA'lar da dahil olmak üzere diğer küçük RNA türlerine en aza indirgemektedir ( rRNA'lar), RNA türetilmiş küçük RNA'ları (tsRNA'lar), tekrartüretilen küçük RNA'ları ve mRNA bozunma ürünlerini aktarın. Neyse ki, mikroRNA'lar 5 fosforilve 2-3hidroksile 4, bu diğer küçük RNA ve mRNA bozunma ürünlerinden ayırmak için kaldıraçlı bir özelliktir. MikroRNA klonlama ve sıralama için genellikle daha hızlı ve çok katlı daha kolay olan çeşitli ticari seçenekler mevcuttur; ancak, kit reaktiflerinin tescilli doğası ve sık sık yapılan değişiklikler numune çalıştırmalarını karşılaştırmayı zorlaştırır. Stratejimiz akrilamid ve agarose jel arıtma adımları ile mikroRNA'ların sadece doğru boyutunu toplama optimize eder. Bu protokolde, açık kaynak araçlarını kullanarak sıra okumalarını mikroRNA'lara hizalama yordamı da açıklıyoruz. Bu yönergeler kümesi, kütüphane hazırlama yöntemimiz veya ticari bir yöntemin kullanılıp kullanılmadığına bakılmaksızın, özellikle acemi bilişim kullanıcıları için yararlı olacaktır.
Bu protokol yayınlanmış birçok çalışmada kullanılmıştır. Örneğin, Dicer enziminin küçük saç tokası RNA'larını kök-döngü yapısının iç halkasından iki nükleotit uzaklıkta niskenin de bıraktığı mekanizmayı tanımlamak için kullanılmıştır - sözde "döngü sayma kuralı"5. Ayrıca rekombinant adeno ilişkili viral vektörlerden (rAAV) ifade edilen teslim edilen küçük saç tokası RNA'larının (shRNA) göreceli bolluğunu belirlemek ve karaciğerden önce tolere edilebilen shRNA ekspresyonunun eşiğini belirlemek için de bu yöntemleri uyguladık. aşırı shRNA ekspresyonu6 ile ilişkili toksisite . Bu protokolü kullanarak, karaciğerde mikroRNA-122 'nin yokluğuna yanıt veren mikroRNA'lar tespit ettik - yüksek derecede ifade edilmiş hepatikmikroRNA - aynı zamanda bu mikroRNA 7'nin bozulma paterni karakterize ederken. Protokolümüzü çok sayıda deneyde tutarlı bir şekilde kullandığımız için, numune hazırlıklarını boylamolarak gözlemleyebildik ve fark edilebilir bir toplu iş etkisi olmadığını gördük.
Bu protokolü paylaşırken amacımız, kullanıcıların uygun fiyatlı ekipman ve reaktifler ve ücretsiz biyoinformatik araçları kullanarak, hemen hemen her doku veya hücre hattında mikroRNA'ların yüksek kaliteli, tekrarlanabilir niceliksel olarak üretebilmelerini sağlamaktır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19:1 bis-acrylamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 bp DNA step ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G4511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phenol/chloroform</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide RNA loading dye</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Buffer II</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>Blue color helps in visualizing pellet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>45-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRVana microRNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>For generating small RNA sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nusieve low-melting agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (laboratory sealing film)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-ethylene glycol 8000</td>
			<td>NEB</td>
			<td>included with M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>For quantifying DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2, truncated</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0242S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>For assessing RNA quality and concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base pH 7.5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal miRNA cloning linker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a complete pipeline for isolating and sequencing micrornas, and analyzing them using open source tools

Tüm insan transkriptlerinin yarısının mikroRNA'lar tarafından düzenlendiği düşünülmektedir. Bu nedenle, mikroRNA ekspresyonu nicel hastalık durumlarında altta yatan mekanizmaları ortaya çıkarabilir ve terapötik hedefler ve biyobelirteçler sağlayabilir. Burada, mikroRNA'ların doğru bir şekilde nasıl ölçültüldeceğiz ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Kısaca, bu yöntem mikroRNA'ları izole etmeyi, yüksek işlem lisi diziliş için uygun adaptörlere bağlamayı, son ürünleri güçlendirmeyi ve örnek bir kitaplık hazırlamayı tanımlar. Daha sonra, elde edilen sıralama okumalarını mikroRNA saç tokalarına nasıl hizalayacağımızı ve diferansiyel ifadelerini nasıl ölçeceğimize, normalleştireceğimize ve hesaplayacağımızı açıklarız. Çok yönlü ve sağlam, bu kombine deneysel iş akışı ve biyoinformatik analiz kullanıcıların doku çıkarma ile başlamak ve mikroRNA nicelik ile bitirmek sağlar.

Kütüphane hazırlığında yer alan adımların şeması Küçük RNA çıkarma, sıralama ve hizalamanın genel şeması Şekil2'de özetlenmiştir. Bir erkek ve bir dişi fareden karaciğer örnekleri toplandı ve sıvı nitrojeniçinde dondurulmuş olarak tutturdu. Toplam RNA çıkarıldı ve kalite ve konsantrasyon açısından değerlendirildi.
Küçük RNA sır...

Watch this Scientific Journal Video about A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools at JoVE.com

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Burada, küçük RNA'ları yalıtmak, mikroRNA'lar için zenginleştirmek ve yüksek iş elde etme sıralaması için numune hazırlamak için adım adım bir strateji tanımlıyoruz. Daha sonra açık kaynak araçlarını kullanarak sıra okumaları nasıl işleyip mikroRNA'lara hizalayan açıklarız.

MikroRNA'ları Yalıtmak ve Sıralamak ve Açık Kaynak Araçlarını Kullanarak Analiz Etmek Için Komple Bir Boru Hattı

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Küçük RNA sıralaması ve açık kaynak biyoinformatik araçları kullanarak normalleştirilmiş okumaları analiz etmek için tanımlanmış, tekrarlanabilir ve uzun süreli bir protokol geliştirdik. Stratejimizin en önemli avantajları, jel saflaştırma yoluyla mikroRNA'ları doğru bir şekilde toplaması ve mikroRNA'ların nasıl toplanılsa da biyoinformatik analizinin uygulanabildiğidir. MikroRNA'ların yüksek iş elde sıralaması hastalık mekanizmaları, mikroRNA'ların işlenmesi ve küçük RNA'lar sağlayan gen terapisi yaklaşımlarının doğru niceliği hakkında bilgi verebilir.RNase'siz bir ortamda çalıştığınızdan ve tüm RNA ürünlerini prosedür boyunca buzda tuttuğundan emin olun. Jel kesme adımlarını görselleştirmek, görüntüleyenlerin akış aşağı uygulamaları için gereken ürünlerin doğru boyutunu belirlemelerine yardımcı olur. Üç ana adaptör ligasyonu için, 11 mikrolitre RNA'yı 1,5 mikrolitre ATP içermeyen 10X T4RNA ligaz reaksiyon tamponu, bir mikrolitre polietilen glikol ve 0,5 mikrolitre üç prime bağlayıcı ile birleştirin.Numuneleri termocycler üzerinde 95 derecede 30 ila 40 saniye ısıtın ve ardından bir dakika buzüzerinde soğutulun. Bir mikrolitre T4RNA ligaz iki ekleyin ve reaksiyonu oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya yatırın. Örnekler kuluçkaya yatarken, plastik bir döküme 0,8 milimetre ayrılmış cam plakalar arasında %15 poliacyrilamid jel dökün ve bir tarak takın.Jel katılaştırıldığında, artık üre kuyularını yıkamak için tanka ve pipete 0,5 5X TBE ekleyin. Poliakrilamid jeli 375 voltta 25 dakika önceden çalıştırdıktan sonra, her numune arasında en az bir şerit bırakarak numuneleri yükleyin. Jel yönünü takip etmek ve jeli sabit 375 voltta çalıştırmak için asimetrik bir desende en az iki işaretçi kümesinden 20 mikrolitre yükleyin.15 dakika sonra, koşmak geri kalanı için sabit bir 425 volt artış ve yaklaşık iki saat boyunca jel çalıştırın. Çalışma sonunda, cam plakalar jel kaldırmak ve plastik bir sayfa koruyucu üzerine jel yerleştirmek için bir plaka ayırıcı kullanın. Distile suyun 500 mikrolitre içinde ethidium bromür beş mikrolitre seyreltin ve üst ışık mavi marker hemen üzerinde marker şeritler üzerine boya ekleyin.Daha sonra, ultraviyole ışık altında her şeritte alt marker üst jelleri kesmek ve laboratuvar sızdırmazlık filmi dört dört santimetre kare parçaları aktarmak için temiz bir jilet kullanın. 12 küçük kareler üretmek için yatay yaklaşık üç kesim ve dikey iki kesim ile jel kesin. Sızdırmazlık filminin üzerine 400 mikrolitre 0,3 molar sodyum klorür ekleyin ve jel parçalarını 1,5 mililitresilikonlu tüplere yönlendirin.Numuneleri bir gecede dört derece lik bir fındıkçıda çalkalayın. Ertesi sabah, her bir süpernatantın 400 mikrolitresini yeni tüplere aktarın. Tüp başına mililitre glikojen ko-precipitant başına 15 miligram% 100 etanol ve bir mikrolitre ekleyin.Sonra tüpleri eksi 80 derecede bir saat saklayın. Beş prime bağlayıcı ligasyon için, ilk çözülmüş örnekleri aşağı spin ve suda pelet resuspend. Daha sonra, her numuneye 100 mikromol beş prime bağlayıcı, bir mikrolitre T4RNA ligaz tamponu, bir mikrolitre 10 milimolar ATP ve bir mikrolitre polietilen glikol ekleyin.Reaksiyonları buza koymadan önce 30 saniye boyunca 90 derecede ısıtın. Daha sonra her tüpe bir mikrolitre T4RNA ligaz ekleyin ve reaksiyonları oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya yatırın. Ters transkripsiyon için, önsantrik tarafından örnekleri toplamak ve nükleaz içermeyen su 8,25 mikrolitre hava kurutulmuş pelet resuspend.Tamamlayıcı DNA sentez kitinden 0,5 mikrolitre 100 mikromolar ters transkriptaz astar ve 5 mikrolitre 2X ters transkriptaz reaksiyon karışımı ekleyin. 42 santigrat derecede üç dakika sonra, bir termocycler 42 santigrat derece bir 30 dakikalık kuluçka için her örnek için 10X ters transkriptaz enzim 1.5 mikrolitre ekleyin. Nötralizasyondan sonra, 29,5 mikrolitre su, beş mikrolitre 10X taq tamponu, bir mikrolitre nükleozit trifosfat, iki mikrolitre 25 mikromolar ileri astar, 25 mikromolar ters astar iki mikrolitre, taq polimeraz 0,5 mikrolitre ve ters transkripsiyonu tamamlayıcı DNA 10 mikrolitre ile bir PCR reaksiyonu hazırlayın.Sonra iki PCR reaksiyonu çalıştırın. Agarose jel arınma için, düşük erime agarose ile% 4 agarose jel hazırlamak ve yükleme boya ve 100 baz çifti ve 25 baz çifti boyutu belirteçleri ile jel üzerine PCR ürün 40 mikrolitre veya daha fazla yük. Jel çalıştırdıktan sonra, 125 baz çifti bandı üzerinde bant kesilmiş ve üreticinin talimatlarına göre bir jel çıkarma kiti kullanın.Son sıra kitaplığını ölçmek için uygun ekipmanı kullanmadan önce jel bandını oda sıcaklığında tamponda eritmek için çalkalayın. Ardından, dizi verilerini analiz etmek için uygun açık kaynak biyoinformatik araçlarını kullanın. Bu temsili PCR reaksiyonu düşük erime agarose jel, elde edilen linker bağlayıcı ürün ve doymamış karşı doymuş örnekleri ile karşılaştırıldığında doğru klonlanmış ürünün edinimi görülebilir.İnsan mikroRNA saç tokaları hizalama sonra, her çoğaltma mikroRNA okuma sayıları arasında güçlü bir uyum görülebilir. Toplam 306 mikroRNA türü tespit edildi ve mikroRNA 122'ye en fazla okuma sayısı saptandı. MikroRNA'ların doğru bir şekilde geri kazanılmasını sağlamak için jelleri uygun boyutta kesmeyi unutmamak önemlidir.MikroRNA'ları sıraladıktan sonra, kullanıcılar ilgi dokularındaki mikroRNA dağılımını karakterize etmek için biyoinformatik analizi uygulayabilirler. Bu teknik, mikroRNA'ların nasıl işlendiğini ve bazı kanserlerde hangi mikroRNA kümelerinin değiştirildiğini belirlemek için kullanılmıştır. Ethidium bromür kullanırken ve ultraviyole ışık altında jellere bakarken dikkatli olun.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Genetics

Unit 1

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Hedef yeni nesil sıralama ve Biyoinformatik boru hattı anayasal hastalığı genetik belirleyicileri değerlendirmek için

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow giriş genom Kütüphane hazırlık bir tek Tardigrade örnekten sıralama

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

İzole, sıralama ve insan Mezenkimal Kök hücreleri ekstrasellüler mikroRNA'lar analiz

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizleri roman proteinler açıklayacak OpenProt veritabanı kullanarak kanonik olmayan açık okuma çerçevesi tercüme

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...