Name: live-cell fluorescence microscopy to investigate subcellular protein localization and cell morphology changes in bacteria
Uploaded: 2019-11-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria at JoVE.com

Nous remercions les membres de notre laboratoire pour leurs commentaires sur cet article. Ces travaux ont été financés par une subvention de démarrage de l'Université de Floride du Sud (PE).

1. Conditions générales de croissance
<ol><li>Inoculer 2 ml de milieu de croissance approprié complété par des antibiotiques (si nécessaire) avec une seule colonie de la souche à imager. Incuber ces cultures de semences pendant la nuit à 22 oC dans un incubateur secouant. REMARQUE : Les conditions de croissance bactérienne spécifiques utilisées dans cet article sont fournies sous la section des résultats représentatifs.</li>
	<li>Diluer les cultures de nuit 1:20 dans les médias frais dans un flacon de ...

<ol>
	<li>Coltharp, C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+microscopy+for+microbiology.">Superresolution microscopy for microbiology.</a> Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).</li><li>Holden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanistic+principles+of+bacterial+cell+division+with+super-resolution+microscopy.">Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).</li><li>Hsu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+color+palette+of+fluorescent+d-amino+acids+for+in+situ+labeling+of+bacterial+cell+walls.">Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls.</a> Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).</li><li>Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cytological+profiling+rapidly+identifies+the+cellular+pathways+targeted+by+antibacterial+molecules.">Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+poly(L-lysine)+substrates+on+attached+Escherichia+coli+bacteria.">Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria.</a> Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).</li><li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy.">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19 (3), 373-385 (1999).</li><li>Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+workingperson's+guide+to+deconvolution+in+light+microscopy.">A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy.</a> Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).</li><li>Eswara, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+Staphylococcus+aureus+cell+division+protein+directly+regulates+FtsZ+dynamics.">An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Haeusser, D. P., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splitsville:+structural+and+functional+insights+into+the+dynamic+bacterial+Z+ring.">Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).</li><li>Du, S., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Heart+of+Bacterial+Cytokinesis:+The+Z+Ring.">At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring.</a> Trends in microbiology. , (2019).</li><li>Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+discovery+and+development+of+antibacterial+agents+targeting+the+cell-division+protein+FtsZ.">Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).</li><li>Brzozowski, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+Role+of+a+SLOG+Superfamily+Protein+YpsA+in+Gram-Positive+Bacteria.">Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).</li><li>Elsen, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+action+of+the+cell-division+inhibitor+PC190723:+modulation+of+FtsZ+assembly+cooperativity.">Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).</li><li>Haydon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inhibitor+of+FtsZ+with+potent+and+selective+anti-staphylococcal+activity.">An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity.</a> Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).</li><li>Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+TEM:+new+insights+from+cryo-microscopy.">Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).</li><li>Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+cell+signaling+using+genetically+encoded+fluorescent+reporters.">Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).</li><li>Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Microscopy+Reveals+That+Levels+of+Cyclic+di-GMP+Vary+among+Bacillus+subtilis+Subpopulations.">Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations.</a> Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).</li><li>Schneider, J. P., Basler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+biology+of+bacterial+cells.">Shedding light on biology of bacterial cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).</li><li>Yao, Z., Carballido-Lopez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+for+bacterial+cell+biology:+from+localization+to+dynamics,+from+ensembles+to+single+molecules.">Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules.</a> Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+for+quantification+of+filamentous+bacteria.">Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria.</a> BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).</li><li>Ursell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=precise+quantification+of+bacterial+cellular+dimensions+across+a+genomic-scale+knockout+library.">precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library.</a> BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).</li></ol>

La microscopie est restée un pilier dans les études relatives aux organismes microbiens. Compte tenu de la taille des cellules à l'échelle du micron, les études sur le niveau d'une seule cellule ont traditionnellement été utilisées sur la microscopie électronique (EM). Bien que l'EM soit devenue une technique assez puissante ces dernières années, elle a ses propres limites intrinsèques en plus de l'accès limité des utilisateurs16. Les améliorations apportées aux techniques de micro...

Le domaine de la biologie cellulaire bactérienne a été considérablement amélioré par les progrès récents dans les techniques de microscopie1,2. Entre autres instruments, les microscopes capables de mener des expériences de microscopie à fluorescence en timelapse demeurent un outil précieux. Les chercheurs peuvent surveiller divers événements physiologiques en temps réel à l'aide de protéines fluorescentes telles que les fusions transcriptionnelle et translationnelle de la protéine fluorescente verte (GFP), les acides fluorescents D-amino (FDAA)3, ou utiliser d'autres taches pour étiqueter la paroi cellulaire, la membrane et l'ADN. Il n'est donc pas surprenant que la microscopie par fluorescence demeure populaire chez les biologistes des cellules microbiennes. En plus de simplement montrer les phénotypes finaux, fournir des informations sur la façon dont les phénotypes observés surgissent à l'aide de la microscopie timelapse pourrait ajouter une valeur significative aux résultats et potentiellement offrir des indices quant à ce que les processus cellulaires sont ciblés par les candidats médicaments potentiels4.
Les protocoles d'imagerie à haute résolution à l'aide d'un microscope à fluorescence entièrement motorisé, inversé et à large champ (voir le Tableau des matériaux)sont fournis dans cet article. Ces protocoles pourraient être adaptés aux besoins d'autres microscopes à fluorescence capables de procéder à une microscopie en timelapse. Bien que le logiciel discuté ici corresponde au logiciel fourni par le fabricant spécifique comme indiqué dans le tableau des matériaux, logiciel couramment fourni par d'autres fabricants de microscope ou le libre disponible ImageJ5, ont des outils équivalents pour analyser les données de microscopie. Pour les conditions où le timelapse n'est pas propice, des expériences de cours dans le temps pourraient être menées comme décrit dans cet article. Les protocoles décrits ici fournissent un guide détaillé pour étudier les changements phénotypiques chez deux espèces bactériennes différentes : B. subtilis et S. aureus. Voir tableau 1 pour les souches utilisées.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td>Molecular Biology Grade - Low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3166</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1755-10</td>
			<td>Dioxane-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>GE</td>
			<td>DeltaVision Elite</td>
			<td>Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC190723</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>3445805MG</td>
			<td>FtsZ inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftWorx</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td>Manufacturer-supplied imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell fluorescence microscopy to investigate subcellular protein localization and cell morphology changes in bacteria

Les études des facteurs influençant la division cellulaire et la forme cellulaire chez les bactéries sont couramment effectuées en conjonction avec la microscopie à haute résolution de fluorescence, car les observations faites au niveau de la population peuvent ne pas vraiment refléter ce qui se produit à un seul niveau cellulaire. La microscopie en accéléré en cellule vive permet aux chercheurs de surveiller les changements dans la division cellulaire ou la morphologie cellulaire qui fournissent des informations précieuses sur la localisation subcellulaire des protéines et le moment de l'expression des gènes, comme il arrive, pour potentiellement aider à répondre à d'importantes questions biologiques. Ici, nous décrivons notre protocole pour surveiller les changements phénotypiques dans Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus utilisant un microscope de deconvolution à haute résolution. L'objectif de ce rapport est de fournir un protocole simple et clair qui peut être adopté par d'autres chercheurs intéressés à mener des expériences de microscopie à fluorescence pour étudier différents processus biologiques chez les bactéries ainsi que d'autres organismes.

Phénotypes GpsB Précédemment nous avons montré que Sa-GpsB est une protéine essentielle comme épuisement du GpsB utilisant un ARN antisens a comme conséquence la lyse cellulaire9. Ici nous décrivons comment l'émergence de divers phénotypes de division cellulaire et des changements dans la localisation de protéine pourraient être capturés utilisant le protocole de microscopie de timelapse décrit dans cet article. À cette fin, S. aureus souches RB143 [SH10...

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Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Cet article fournit un guide étape par étape pour étudier la dynamique de localisation sous-cellulaire des protéines et pour surveiller les changements morphologiques à l'aide de la microscopie à haute résolution de fluorescence dans Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus.

Microscopie de fluorescence à cellules vivantes pour étudier la localisation des protéines subcellulaires et les changements de morphologie cellulaire chez les bactéries

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Ce protocole facilite l’observation directe de divers changements phénotypiques à un niveau unicellique et permet la surveillance continue de la localisation des protéines et du moment de l’expression des gènes. Le principal avantage de la microscopie par fluorescence est qu’il s’agit d’une méthode simple pour surveiller divers processus biologiques, tels que la division cellulaire et les changements de morphologie cellulaire dans les cellules vivantes. Assurez-vous d’accorder une attention particulière au protocole de préparation de l’échantillon et d’explorer le logiciel microscope pour être en mesure de localiser les paramètres et les options énumérés dans ce protocole.Une représentation visuelle de ce protocole est essentielle car il permet aux utilisateurs de regarder et d’apprendre les étapes significatives de la technique comme ils ont mis en place leurs propres expériences. Commencez par étiqueter un aliquot de cinq à 50 microlitres de la culture cellulaire d’intérêt avec un colorant de colorant à coloration membranaire approprié et en ajoutant cinq microlitres des cellules bactériennes tachées sur un glissement de couverture sur le fond d’un plat de culture de fond de verre de 35 millilitres. Placez une dalle d’agarose de 11 millimètres de diamètre sur l’échantillon et appuyez doucement pour vous assurer que la dalle est plate contre le glissement du couvercle.Ajouter ensuite environ cinq microlitres d’eau autour du glissement du couvercle pour empêcher le tampon agarose de sécher et permettre au plat de culture d’équilibrer à la température à l’intérieur de la chambre d’incubation d’un microscope à déconvolution haute résolution pendant 15 à 20 minutes. Pour l’image de l’échantillon, utilisez le bouton de mise au point d’ajustement grossier pour vous assurer que l’objectif est complètement abaissé avant d’initialiser le microscope dans le logiciel de microscope. Placez une goutte d’huile d’index réfractive de 1.517 dans l’objectif d’immersion d’huile 100x, et transférez le plat de fond en verre contenant l’échantillon dans le cercueil de logement en métal.Faites glisser doucement le plat dans la pince de scène, et utilisez le bouton de réglage grossier pour augmenter l’objectif jusqu’à ce que l’huile entre en contact avec le fond de verre du plat. Utilisez l’oculaire et le bouton de réglage fin pour mettre l’échantillon au point, et passer en mode caméra. Dans le logiciel d’imagerie de la fenêtre Resolve 3D, sélectionnez l’icône Design/Run Experiment.Une nouvelle boîte de dialogue s’intitulera Design/Run Experiment. Ouvrez les onglets Conception et Sectioning dans la boîte de dialogue pour définir le nombre de piles Z et l’épaisseur de l’échantillon. Pour mesurer l’épaisseur des cellules de l’échantillon, ajustez progressivement le plan Z à l’aide des flèches de haut en bas de la boîte de dialogue Resolve 3D, ce qui rend l’endroit où les cellules sont hors de discussion comme limites supérieures et inférieures pour l’acquisition d’image.Après avoir ajusté la transmission en pourcentage de l’intensité lumineuse et la durée de l’exposition pour les différents canaux sélectionnés dans la boîte de dialogue Resolve 3D, cliquez sur Liste de points pour ouvrir la liste des points. Dans les onglets Conception et Time Lapse, sélectionnez la case à cocher Time Lapse et entrez les paramètres de laps de temps. Sélectionnez l’option liste point de visite et entrez les points à imager dans la boîte de texte, en séparant les points par virgules ou traits d’union pour des séquences complètes.Modifiez ensuite les noms de fichiers et les emplacements de fichiers dans l’onglet Exécuter et sélectionnez Jouer dans la boîte de dialogue Begin Experiment pour démarrer l’expérience. À la fin de l’analyse, ouvrez les fichiers d’images RAW d’intérêt dans un programme de déconvolution approprié, et sélectionnez l’onglet Processus et Deconvolve. Effectuez n’importe quelle soustraction manuelle de bruit de fond et réglage de contraste de luminosité dans n’importe quel ou tous les canaux de longueur d’onde si nécessaire avant d’enregistrer l’image comme un fichier TIFF.Pour la quantification de la longueur cellulaire, ouvrez les fichiers d’images décontvolutés du fabricant fourni par logiciel ou dans des logiciels d’imagerie libres, tels que ImageJ, et ouvrez l’onglet Outil. Sélectionnez ensuite mesurer les distances et cliquez à gauche sur les points de départ et de fin du fichier d’image désiré pour mesurer la longueur de la cellule. Pour la quantification des signaux fluorescents, sélectionnez Inspecteur des données.Dessinez une case avec l’option Colonne/Ligne définie à la dimension spécifique d’intérêt, et sélectionnez la zone avec le signal à quantifier. L’ajout de xylose pour induire une souche GGS 8 entraîne un phénotype à six cellules. Alors que les commandes vectorielles vides semblent similaires aux cellules témoins cultivées en l’absence d’inducteur.La surproduction de staphylocoque aureus GPSB perturbe la division cellulaire en B.subtilis telle que mesurée par la microscopie time lapse et la quantification de la longueur cellulaire. En outre, les modèles de localisation de FtsZ ou l’une des protéines associées à cette protéine peuvent être utilisés par un journaliste pour étudier et/ou identifier de nouveaux composés antimicrobiens grâce à l’imagerie par manque de temps et à la quantification de la longueur cellulaire. Assurez-vous d’utiliser une huile avec l’index réfractif approprié car l’indice réfractif peut changer en fonction de la température utilisée pour l’imagerie.La déconvolution peut être effectuée si l’utilisateur souhaite supprimer le bruit hors foyer, et l’analyse des données impliquant la quantification du signal fluorescent et les mesures de longueur et de largeur des cellules peut également être effectuée.

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