Name: live-cell fluorescence microscopy to investigate subcellular protein localization and cell morphology changes in bacteria
Uploaded: 2019-11-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria at JoVE.com

Ringraziamo i nostri membri del laboratorio per i loro commenti su questo articolo. Questo lavoro è stato finanziato da una start-up della University of South Florida (PE).

1. Condizioni generali di crescita
<ol><li>Inoculare 2 mL di mezzo di crescita appropriato integrato con antibiotici (dove richiesto) con una singola colonia del ceppo (s) da immaginare. Incubare queste colture di semi durante la notte a 22 gradi centigradi in un incubatore agitazione. NOTA: Le condizioni specifiche di crescita batterica utilizzate in questo articolo sono fornite nella sezione dei risultati rappresentativi.</li>
	<li>Diluire le colture durante la notte 1:20 in supporti freschi in un flacone da 125 m...

<ol>
	<li>Coltharp, C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+microscopy+for+microbiology.">Superresolution microscopy for microbiology.</a> Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).</li><li>Holden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanistic+principles+of+bacterial+cell+division+with+super-resolution+microscopy.">Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).</li><li>Hsu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+color+palette+of+fluorescent+d-amino+acids+for+in+situ+labeling+of+bacterial+cell+walls.">Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls.</a> Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).</li><li>Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cytological+profiling+rapidly+identifies+the+cellular+pathways+targeted+by+antibacterial+molecules.">Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+poly(L-lysine)+substrates+on+attached+Escherichia+coli+bacteria.">Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria.</a> Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).</li><li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy.">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19 (3), 373-385 (1999).</li><li>Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+workingperson's+guide+to+deconvolution+in+light+microscopy.">A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy.</a> Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).</li><li>Eswara, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+Staphylococcus+aureus+cell+division+protein+directly+regulates+FtsZ+dynamics.">An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Haeusser, D. P., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splitsville:+structural+and+functional+insights+into+the+dynamic+bacterial+Z+ring.">Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).</li><li>Du, S., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Heart+of+Bacterial+Cytokinesis:+The+Z+Ring.">At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring.</a> Trends in microbiology. , (2019).</li><li>Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+discovery+and+development+of+antibacterial+agents+targeting+the+cell-division+protein+FtsZ.">Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).</li><li>Brzozowski, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+Role+of+a+SLOG+Superfamily+Protein+YpsA+in+Gram-Positive+Bacteria.">Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).</li><li>Elsen, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+action+of+the+cell-division+inhibitor+PC190723:+modulation+of+FtsZ+assembly+cooperativity.">Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).</li><li>Haydon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inhibitor+of+FtsZ+with+potent+and+selective+anti-staphylococcal+activity.">An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity.</a> Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).</li><li>Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+TEM:+new+insights+from+cryo-microscopy.">Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).</li><li>Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+cell+signaling+using+genetically+encoded+fluorescent+reporters.">Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).</li><li>Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Microscopy+Reveals+That+Levels+of+Cyclic+di-GMP+Vary+among+Bacillus+subtilis+Subpopulations.">Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations.</a> Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).</li><li>Schneider, J. P., Basler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+biology+of+bacterial+cells.">Shedding light on biology of bacterial cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).</li><li>Yao, Z., Carballido-Lopez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+for+bacterial+cell+biology:+from+localization+to+dynamics,+from+ensembles+to+single+molecules.">Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules.</a> Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+for+quantification+of+filamentous+bacteria.">Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria.</a> BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).</li><li>Ursell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=precise+quantification+of+bacterial+cellular+dimensions+across+a+genomic-scale+knockout+library.">precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library.</a> BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).</li></ol>

La microscopia è rimasta un pilastro negli studi relativi agli organismi microbici. Data la loro dimensione cellulare su scala micron, gli studi a livello di cellula singola si sono tradizionalmente basati sulla microscopia elettronica (EM). Sebbene EM sia diventata una tecnica piuttosto potente negli ultimi anni, ha i suoi limiti intrinseci oltre al limitato accesso degli utenti16. I miglioramenti nelle tecniche di microscopia a fluorescenza e lo sviluppo di diverse sonde fluorescenti, come FDAA...

Il campo della biologia cellulare batterica è stato notevolmente migliorato dai recenti progressi nelle tecniche di microscopia1,2. Tra gli altri strumenti, i microscopi in grado di condurre esperimenti di microscopia a fluorescenza timelapse rimangono uno strumento prezioso. I ricercatori possono monitorare vari eventi fisiologici in tempo reale utilizzando proteine fluorescenti come le proteine fluorescenti verdi (GFP) e le fusioni di reporter traslazionali, gli amminoacidi D-aminoacidi fluorescenti (FDAA)3o utilizzare altre macchie per etichettare la parete cellulare, la membrana e il DNA. Non sorprende quindi che la microscopia a fluorescenza rimanga popolare tra i biologi delle cellule microbiche. Oltre a mostrare semplicemente i fenotipi finali, fornire informazioni su come i fenotipi osservati nascono utilizzando la microscopia timelapse potrebbe aggiungere un valore significativo ai risultati e potenzialmente offrire indizi su quali processi cellulari sono presi di mira da potenziali candidati alla droga4.
I protocolli per condurre l'imaging ad alta risoluzione utilizzando un microscopio a fluorescenza a campo largo completamente motorizzato, invertito e a campo largo (vedi tabella dei materiali)sono forniti in questo articolo. Questi protocolli potrebbero essere adattati alle esigenze di altri microscopi a fluorescenza in grado di condurre la microscopia timelapse. Anche se il software qui discusso corrisponde allo specifico software fornito dal produttore come indicato nella Tabella dei Materiali, il software comunemente fornito da altri produttori di microscopi o il ModelloImmagineJ 5liberamente disponibile, dispone di strumenti equivalenti per l'analisi dei dati di microscopia. Per le condizioni in cui il timelapse non è favorevole, gli esperimenti di ciclo temporale potrebbero essere condotti come descritto in questo articolo. I protocolli qui descritti forniscono una guida dettagliata per studiare i cambiamenti fenotipici in due diverse specie batteriche: B. subtilis e S. aureus. Vedere la Tabella 1 per i ceppi utilizzati.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td>Molecular Biology Grade - Low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3166</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1755-10</td>
			<td>Dioxane-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>GE</td>
			<td>DeltaVision Elite</td>
			<td>Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC190723</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>3445805MG</td>
			<td>FtsZ inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftWorx</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td>Manufacturer-supplied imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell fluorescence microscopy to investigate subcellular protein localization and cell morphology changes in bacteria

Le indagini sui fattori che influenzano la divisione cellulare e la forma cellulare nei batteri sono comunemente eseguite in combinazione con la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione, poiché le osservazioni fatte a livello di popolazione potrebbero non riflettere realmente ciò che si verifica a livello di singola cellula. La microscopia a tempo variabile a cellule vive consente agli sperimentatori di monitorare i cambiamenti nella divisione cellulare o nella morfologia cellulare che forniscono preziose informazioni sulla localizzazione subcellulare delle proteine e sulla tempistica dell'espressione genica, come accade, per aiutare potenzialmente a rispondere a importanti domande biologiche. Qui, descriviamo il nostro protocollo per monitorare i cambiamenti fenotipici in Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus utilizzando un microscopio di deconvoluzione ad alta risoluzione. L'obiettivo di questa relazione è quello di fornire un protocollo semplice e chiaro che può essere adottato da altri ricercatori interessati a condurre esperimenti di microscopia a fluorescenza per studiare diversi processi biologici nei batteri e in altri organismi.

Fenotipi GpsB In precedenza abbiamo dimostrato che Sa-GpsB è una proteina essenziale come esaurimento di GpsB utilizzando un RNA antisenso risultati in lisi cellulare9. Qui descriviamo come l'emergere di vari fenotipi della divisione cellulare e i cambiamenti nella localizzazione delle proteine potrebbero essere catturati utilizzando il protocollo di microscopia timelapse descritto in questo articolo. A questo scopo, S. aureus sforza RB143 [SH1000 che ospita pEPSA5 (v...

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Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Questo articolo fornisce una guida passo-passo per studiare le dinamiche di localizzazione subcellulare delle proteine e per monitorare i cambiamenti morfologici utilizzando la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione in Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.

Microscopia a fluorescenza a cellule vive per studiare la localizzazione delle proteine subcellulari e i cambiamenti della morfologia cellulare nei batteri

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Questo protocollo facilita l'osservazione diretta di vari cambiamenti fenotipiche a livello di singola cellula e consente il monitoraggio continuo della localizzazione proteica e dei tempi di espressione genica. Il principale vantaggio della microscopia a fluorescenza è che è un metodo semplice per monitorare vari processi biologici, come la divisione cellulare e i cambiamenti della morfologia cellulare nelle cellule vive. Assicurati di prestare particolare attenzione al protocollo di preparazione del campione e di esplorare il software del microscopio per essere in grado di individuare le impostazioni e le opzioni elencate in questo protocollo.Una rappresentazione visiva di questo protocollo è fondamentale perché consente agli utenti di guardare e apprendere i passaggi significativi della tecnica mentre impostano i propri esperimenti. Inizia etichettando un'aliquota da cinque a 50 microlitri della coltura cellulare di interesse con un colorante di colorazione a membrana appropriato e aggiungendo cinque microlitri delle cellule batteriche macchiate su un foglietto di copertura sul fondo di un piatto di coltura inferiore in vetro da 35 millilitri. Posizionare una lastra di agarosio di 11 millimetri di diametro sul campione e toccare delicatamente per assicurarsi che la lastra sia piatta contro lo scivolamento del coperchio.Quindi aggiungere circa cinque microlitri d'acqua intorno allo scivolo di copertura per evitare che il tampone di agarosio si asciughi e lasciare che il piatto di coltura equilibra alla temperatura all'interno della camera di incubazione di un microscopio a deconvoluzione ad alta risoluzione per 15-20 minuti. Per immaginere il campione, utilizzare la manopola di messa a fuoco di regolazione grossolana per assicurarsi che l'obiettivo sia completamente abbassato prima di inizializzare il microscopio all'interno del software del microscopio. Inserire una goccia di 1.517 olio indice di rifrazione nell'obiettivo di immersione dell'olio 100x e trasferire il piatto inferiore di vetro contenente il campione nella bara dell'alloggiamento in metallo.Far scorrere delicatamente il piatto nel morsetto del palco e utilizzare la manopola di regolazione grossolana per alzare l'obiettivo fino a quando l'olio non entra in contatto con il fondo di vetro del piatto. Utilizzare l'oculare e la manopola di regolazione fine per mettere a fuoco il campione e passare alla modalità Fotocamera. Nel software di imaging della finestra Risolvi 3D selezionare l'icona Progettazione/Esecuzione esperimento.Verrà visualizzata una nuova finestra di dialogo intitolata Esperimento progettazione/esecuzione. Aprite le schede Progettazione (Design) e Se sezione (Sectioning) nella finestra di dialogo per impostare il numero di pile Z e lo spessore del campione. Per misurare lo spessore delle celle del campione, regolate in modo incrementale il piano Z utilizzando le frecce su e giù nella finestra di dialogo Risolvi 3D, rendendo il punto in cui le celle escono dallo stato attivo come limiti superiore e inferiore per l'acquisizione di immagini.Dopo aver regolato la trasmissione percentuale dell'intensità della luce e la durata dell'esposizione per i singoli canali selezionati nella finestra di dialogo Risolvi 3D, fate clic su Elenco punti (Point List) per aprire l'elenco dei punti. Nelle schede Progettazione e Time Lapse selezionare la casella di controllo Time Lapse e immettere i parametri time lapse. Selezionare l'opzione Dell'elenco Punto di visita e immettere i punti da inserire nella casella di testo, separando i punti da virgole o trattini per sequenze complete.Quindi modificare i nomi dei file e i percorsi dei file nella scheda Esegui e selezionare Riproduci nella finestra di dialogo Inizia esperimento per avviare l'esperimento. Al termine dell'analisi, aprite i file di immagine RAW di interesse in un programma di deconvoluzione appropriato e selezionate la scheda Processo (Process) e Deconvolve (Deconvolve). Eseguire qualsiasi sottrazione manuale di rumore di fondo e regolazione del contrasto della luminosità in uno o tutti i canali di lunghezza d'onda, se necessario, prima di salvare l'immagine come file TIFF.Per la quantificazione della lunghezza delle celle, aprire i file di immagine deconvoluti nel software fornito dal produttore o nel software di imaging libero, ad esempio ImageJ, e aprire la scheda Strumento. Quindi selezionate Misura distanze (Measure Distances) e fate clic con il pulsante sinistro del mouse sui punti iniziale e finale del file di immagine desiderato per misurare la lunghezza della cella. Per la quantificazione del segnale fluorescente, selezionare Ispezione dati.Disegnare una casella con l'opzione Colonna/Riga impostata sulla dimensione specifica di interesse e selezionare l'area con il segnale da quantificare. L'aggiunta di xilosio per indurre un ceppo GGS 8 si traduce in un fenotipo a sei cellule. Mentre i controlli vettoriali vuoti appaiono simili alle celle di controllo coltivate in assenza di induttore.La sovrapproduzione di staph aureus gpsB interrompe la divisione cellulare in B.subtilis misurata dalla microscopia time lapse e dalla quantificazione della lunghezza cellulare. Inoltre, i modelli di localizzazione di FtsZ o di una delle proteine associate a questa proteina possono essere usati da un reporter per studiare e /o identificare nuovi composti antimicrobici attraverso l'imaging time lapse e la quantificazione della lunghezza cellulare. Assicurarsi di utilizzare un olio con l'indice di rifrazione appropriato in quanto l'indice di rifrazione può cambiare a seconda della temperatura utilizzata per l'imaging.La deconvoluzione può essere eseguita se l'utente desidera rimuovere il rumore fuori fuoco e può anche essere eseguita l'analisi dei dati che coinvolge la quantificazione del segnale fluorescente e le misurazioni della lunghezza e della larghezza delle celle.

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