Name: live-cell fluorescence microscopy to investigate subcellular protein localization and cell morphology changes in bacteria
Uploaded: 2019-11-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria at JoVE.com

この記事に関するコメントをラボメンバーに感謝します。この作品は、サウスフロリダ大学(PE)からのスタートアップ助成金によって資金提供されました。

1. 一般的な成長条件
<ol><li>画像化する株の単一コロニーを用いた抗生物質(必要な場合)を補充した適切な成長培地の2mLを接種する。これらの種子培養物を振とうインキュベーターで22°Cで一晩インキュベートする。 注: この記事で使用する特定の細菌増殖条件は、代表的な結果セクションに記載されています。</li>
	<li>125 mLフラスコで新鮮なメディアで一晩培養1:20を希釈し、抗生物質を補?...

<ol>
	<li>Coltharp, C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+microscopy+for+microbiology.">Superresolution microscopy for microbiology.</a> Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).</li><li>Holden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanistic+principles+of+bacterial+cell+division+with+super-resolution+microscopy.">Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).</li><li>Hsu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+color+palette+of+fluorescent+d-amino+acids+for+in+situ+labeling+of+bacterial+cell+walls.">Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls.</a> Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).</li><li>Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cytological+profiling+rapidly+identifies+the+cellular+pathways+targeted+by+antibacterial+molecules.">Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+poly(L-lysine)+substrates+on+attached+Escherichia+coli+bacteria.">Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria.</a> Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).</li><li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy.">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19 (3), 373-385 (1999).</li><li>Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+workingperson's+guide+to+deconvolution+in+light+microscopy.">A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy.</a> Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).</li><li>Eswara, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+Staphylococcus+aureus+cell+division+protein+directly+regulates+FtsZ+dynamics.">An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Haeusser, D. P., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splitsville:+structural+and+functional+insights+into+the+dynamic+bacterial+Z+ring.">Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).</li><li>Du, S., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Heart+of+Bacterial+Cytokinesis:+The+Z+Ring.">At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring.</a> Trends in microbiology. , (2019).</li><li>Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+discovery+and+development+of+antibacterial+agents+targeting+the+cell-division+protein+FtsZ.">Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).</li><li>Brzozowski, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+Role+of+a+SLOG+Superfamily+Protein+YpsA+in+Gram-Positive+Bacteria.">Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).</li><li>Elsen, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+action+of+the+cell-division+inhibitor+PC190723:+modulation+of+FtsZ+assembly+cooperativity.">Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).</li><li>Haydon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inhibitor+of+FtsZ+with+potent+and+selective+anti-staphylococcal+activity.">An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity.</a> Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).</li><li>Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+TEM:+new+insights+from+cryo-microscopy.">Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).</li><li>Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+cell+signaling+using+genetically+encoded+fluorescent+reporters.">Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).</li><li>Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Microscopy+Reveals+That+Levels+of+Cyclic+di-GMP+Vary+among+Bacillus+subtilis+Subpopulations.">Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations.</a> Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).</li><li>Schneider, J. P., Basler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+biology+of+bacterial+cells.">Shedding light on biology of bacterial cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).</li><li>Yao, Z., Carballido-Lopez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+for+bacterial+cell+biology:+from+localization+to+dynamics,+from+ensembles+to+single+molecules.">Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules.</a> Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+for+quantification+of+filamentous+bacteria.">Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria.</a> BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).</li><li>Ursell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=precise+quantification+of+bacterial+cellular+dimensions+across+a+genomic-scale+knockout+library.">precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library.</a> BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).</li></ol>

顕微鏡検査は、微生物に関する研究において主力であり続けています。ミクロンスケールの細胞サイズを考えると、単細胞レベルの研究は従来、電子顕微鏡(EM)に依存してきました。EMは近年非常に強力な技術となっていますが、限られたユーザーアクセス16に加えて、独自の本質的な制限があります。蛍光顕微鏡技術の改良とFDAA3のような異なる蛍光プロー...

細菌細胞生物学の分野は、顕微鏡技術1、2の最近の進歩によって有意に増強された。他の器械の間で、タイムラプス蛍光顕微鏡実験を行うことができる顕微鏡は貴重な用具のままである。研究者は、緑色蛍光タンパク質(GFP)ベースの転写および翻訳レポーター融合、蛍光D-アミノ酸(FDAA)3、または細胞壁、膜およびDNAを標識するための他の染色を使用して、蛍光タンパク質を使用してリアルタイムで様々な生理学的事象を監視することができます。したがって、微生物細胞生物学者の間で蛍光顕微鏡が依然として普及しているのは驚くべきことではない。単に末端表現型を示すことに加えて、タイムラプス顕微鏡を用いて観察された表現型がどのように生じるかについての情報を提供することは、所見に大きな価値を加え、潜在的な薬物候補によって標的とされている細胞プロセスに関する手がかりを提供する可能性がある4.
この記事では、完全に電動、反転、広視野蛍光顕微鏡(材料表参照)を用いて高解像度イメージングを行うプロトコルを提供します。これらのプロトコルは、タイムラプス顕微鏡を行うことができる他の蛍光顕微鏡のニーズに合わせて適合させることができる。ここで説明するソフトウェアは、材料の表に示されている特定の製造元が提供するソフトウェアに対応していますが、他の顕微鏡メーカーまたは自由に入手可能な ImageJ5によって一般的に提供されるソフトウェアには、顕微鏡データを分析するための同等のツールがあります。タイムラプスが役に立たない場合は、この記事の説明に従って、タイムコース実験を行うことができる。ここで説明するプロトコルは、2つの異なる細菌種の表現型変化を研究するための詳細なガイドを提供する:B.サチリスとS.アウレウス。使用するひずみについては、表 1 を参照してください。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td>Molecular Biology Grade - Low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3166</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1755-10</td>
			<td>Dioxane-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>GE</td>
			<td>DeltaVision Elite</td>
			<td>Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC190723</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>3445805MG</td>
			<td>FtsZ inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftWorx</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td>Manufacturer-supplied imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell fluorescence microscopy to investigate subcellular protein localization and cell morphology changes in bacteria

細菌の細胞分裂および細胞形状に影響を与える因子の調査は、集団レベルで行われた観察が単一細胞レベルで起こることを本当に反映していない可能性があるため、一般的に高分解能蛍光顕微鏡と組み合わせて行われる。生細胞タイムラプス顕微鏡検査により、研究者は細胞分裂または細胞形態の変化を監視することができ、タンパク質の細胞内局在化や遺伝子発現のタイミングに関する貴重な洞察を提供し、重要な生物学的質問に答えるのに役立つ可能性があります。ここでは、高分解能デコンボリューション顕微鏡を用いて、バチルス・サチリスと黄色ブドウ球菌の表現型変化をモニタリングするプロトコルについて説明する。本報告書の目的は、細菌や他の生物の異なる生物学的過程を研究するために蛍光顕微鏡実験を行うことに興味を持つ他の研究者が採用できる、シンプルで明確なプロトコルを提供することである。

GpsB表現型 以前は、Sa-GpsBはアンチセンスRNAを使用したGpsBの枯渇として必須タンパク質であり、細胞溶解9をもたらすことが示されています。ここでは、この記事で説明するタイムラプス顕微鏡プロトコルを用いて、様々な細胞分裂表現型の出現とタンパク質の局在化の変化をどのように捉えることができるかについて説明する。この目的のために、S.アウレ...

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Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

この記事では、タンパク質の細胞内局在ダイナミクスを調査し、バチルス・サチリスおよび黄色ブドウ球菌における高分解能蛍光顕微鏡を用いて形態学的変化を監視するためのステップバイステップガイドを提供します。

細菌における細胞内タンパク質の局在化と細胞形態の変化を調べる生細胞蛍光顕微鏡

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

このプロトコルは、単一細胞レベルでのさまざまな表現型変化を直接観察し、タンパク質の局在化および遺伝子発現タイミングの継続的なモニタリングを可能にする。蛍光顕微鏡の主な利点は、生細胞における細胞分裂や細胞形態変化などの様々な生物学的プロセスを監視するための簡単な方法であるということです。サンプル調製プロトコルに特に注意を払い、このプロトコルに記載されている設定とオプションを見つけることができるように顕微鏡ソフトウェアを探索してください。このプロトコルの視覚的な表現は、ユーザーが自分の実験を設定する技術の重要なステップを見て学ぶことを可能にするので、重要です。適切な膜染色染料で対象となる細胞培養液の5〜50マイクロリットルのアリコートを標識し、染色された細菌細胞の5マイクロリットルを35ミリリットルガラス底培養皿の底のカバースリップに追加します。直径11ミリメートルのアガローススラブをサンプルの上に置き、そらがカバースリップに対して平らであることを確認するためにそっとタップします。その後、カバースリップの周りに約5マイクロリットルの水を加えて、アガロースパッドの乾燥を防ぎ、培養皿が高解像度のデコンボリューション顕微鏡のインキュベーションチャンバー内の温度に15〜20分間平衡化できるようにします。サンプルを画像化するには、粗い調整フォーカスノブを使用して、顕微鏡ソフトウェア内で顕微鏡を初期化する前に、目的が完全に低下していることを確認します。100x油浸し目的に1.517屈折率油を入れ、サンプルを含むガラス底皿を金属製の筐体の棺に移します。皿をステージクランプにそっとスライドさせ、粗い調整ノブを使用して、油が皿のガラス底に接触するまで目的を上げます。接眼レンズと微調整ノブを使用してサンプルをフォーカスし、カメラモードに切り替えます。[3D を解決]ウィンドウのイメージング ソフトウェアで、[設計/実行実験]アイコンを選択します。新しいダイアログ ボックスが表示されますデザイン/実行実験。ダイアログボックスの「設計」タブと「断面」タブを開き、Z スタックの数とサンプルの厚さを設定します。サンプル内のセルの厚さを測定するには、[3D を解決]ダイアログ ボックスの上下矢印を使用して Z 面を段階的に調整し、セルがイメージ取得の上限と下限としてフォーカスを外れる位置を調整します。[3D を解決]ダイアログ ボックスで選択した個々のチャネルの光強度のパーセント透過率と露出の持続時間を調整した後、[ポイント リスト]をクリックして[ポイント リスト]を開きます。[デザイン]タブと[タイムラプス]タブで、[タイムラプス]チェックボックスを選択し、タイムラプスパラメータを入力します。[訪問先リスト]オプションを選択し、テキストボックスに、完全なシーケンスの場合はカンマまたはハイフンで区切って、画像化するポイントを入力します。次に、[実行] タブでファイル名とファイルの場所を編集し、[実験の開始] ダイアログ ボックスで [再生] を選択して実験を開始します。解析の最後に、適切なデコンボリューション プログラムで目的の RAW イメージ ファイルを開き、[プロセス]タブと[デコンボルブ]を選択します。画像を TIFF ファイルとして保存する前に、必要に応じて、任意の波長チャネルまたはすべての波長チャネルで手動バックグラウンドノイズ減算と明るさコントラスト調整を行います。セル長の定量を行う場合は、製造元が提供するソフトウェアまたは ImageJ などの無料のイメージング ソフトウェアでデコンボリューションされたイメージ ファイルを開き、[ツール] タブを開きます。次に、[距離を計測]を選択し、目的のイメージ ファイルの始点と終点を左クリックして、セルの長さを計測します。蛍光シグナルの定量化の場合は、データ検査を選択します。[列/行]オプションを特定の寸法に設定したボックスを描画し、定量化する信号のある領域を選択します。GGS 8株を誘導するキシロースの添加は、6細胞表現型をもたらす。空のベクターコントロールは、誘導体の不在で増殖したコントロール細胞に似ているように見えますが。ステープルアウレウスgpsBの過剰産生は、時間経過顕微鏡と細胞長定量法によって測定されるようにB.subtilisの細胞分裂を破壊する。さらに、FtsZまたはこのタンパク質に関連するタンパク質の1つの局在パターンを、時間経過イメージングおよび細胞長定量を通じて新規の抗菌化合物を研究および/または同定するためにレポーターを使用することができる。画像化に使用する温度によって屈折率が変化する可能性があるため、適切な屈折率を持つ油脂を使用してください。デコンボリューションは、ユーザーが焦点外のノイズを除去したい場合に行うことができるし、蛍光信号の定量と細胞の長さと幅の測定を含むデータ解析も行うことができます。

Research

JoVE Journal

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の単一細胞解析枯草菌</em蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて>バイオフィルム

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Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

ライブセル蛍光顕微鏡を用いた細菌毒素誘導される応答の可視化

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

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真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

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