Name: live-cell fluorescence microscopy to investigate subcellular protein localization and cell morphology changes in bacteria
Uploaded: 2019-11-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria at JoVE.com

Agradecemos aos nossos membros do laboratório por seus comentários sobre este artigo. Este trabalho foi financiado por uma concessão start-up da Universidade do Sul da Flórida (PE).

1. Condições gerais de crescimento
<ol><li>Inocular 2 mL de médio de crescimento adequado complementado com antibióticos (quando necessário) com uma única colônia da cepa (s) para ser imagem. Incubar essas culturas de sementes durante a noite a 22 °C em uma incubadora tremendo. NOTA: As condições específicas de crescimento bacteriano utilizadas neste artigo são fornecidas na seção de resultados representativos.</li>
	<li>Diluir culturas durante a noite 1:20 em novos meios de comunicação em um frasco ...

<ol>
	<li>Coltharp, C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+microscopy+for+microbiology.">Superresolution microscopy for microbiology.</a> Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).</li><li>Holden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanistic+principles+of+bacterial+cell+division+with+super-resolution+microscopy.">Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).</li><li>Hsu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+color+palette+of+fluorescent+d-amino+acids+for+in+situ+labeling+of+bacterial+cell+walls.">Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls.</a> Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).</li><li>Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cytological+profiling+rapidly+identifies+the+cellular+pathways+targeted+by+antibacterial+molecules.">Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+poly(L-lysine)+substrates+on+attached+Escherichia+coli+bacteria.">Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria.</a> Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).</li><li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy.">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19 (3), 373-385 (1999).</li><li>Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+workingperson's+guide+to+deconvolution+in+light+microscopy.">A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy.</a> Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).</li><li>Eswara, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+Staphylococcus+aureus+cell+division+protein+directly+regulates+FtsZ+dynamics.">An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Haeusser, D. P., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splitsville:+structural+and+functional+insights+into+the+dynamic+bacterial+Z+ring.">Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).</li><li>Du, S., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Heart+of+Bacterial+Cytokinesis:+The+Z+Ring.">At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring.</a> Trends in microbiology. , (2019).</li><li>Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+discovery+and+development+of+antibacterial+agents+targeting+the+cell-division+protein+FtsZ.">Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).</li><li>Brzozowski, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+Role+of+a+SLOG+Superfamily+Protein+YpsA+in+Gram-Positive+Bacteria.">Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).</li><li>Elsen, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+action+of+the+cell-division+inhibitor+PC190723:+modulation+of+FtsZ+assembly+cooperativity.">Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).</li><li>Haydon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inhibitor+of+FtsZ+with+potent+and+selective+anti-staphylococcal+activity.">An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity.</a> Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).</li><li>Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+TEM:+new+insights+from+cryo-microscopy.">Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).</li><li>Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+cell+signaling+using+genetically+encoded+fluorescent+reporters.">Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).</li><li>Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Microscopy+Reveals+That+Levels+of+Cyclic+di-GMP+Vary+among+Bacillus+subtilis+Subpopulations.">Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations.</a> Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).</li><li>Schneider, J. P., Basler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+biology+of+bacterial+cells.">Shedding light on biology of bacterial cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).</li><li>Yao, Z., Carballido-Lopez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+for+bacterial+cell+biology:+from+localization+to+dynamics,+from+ensembles+to+single+molecules.">Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules.</a> Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+for+quantification+of+filamentous+bacteria.">Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria.</a> BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).</li><li>Ursell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=precise+quantification+of+bacterial+cellular+dimensions+across+a+genomic-scale+knockout+library.">precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library.</a> BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).</li></ol>

A microscopia permaneceu um pilar nos estudos relativos a organismos microbianos. Dado o tamanho das células em escala de mícron, estudos de nível unicelular têm tradicionalmente invocado microscopia eletrônica (EM). Embora em tornou-se uma técnica bastante poderosa nos últimos anos, ele tem suas próprias limitações intrínsecas, além de acesso limitado ao usuário16. Melhorias nas técnicas de microscopia de fluorescência e desenvolvimento de diferentes sondas fluorescentes, como a FD...

O campo da biologia celular bacteriana tem sido significativamente reforçada pelos avanços recentes em técnicas de microscopia1,2. Entre outros instrumentos, microscópios capazes de realizar experimentos de microscopia fluorescência de lapso de tempo continuam a ser uma ferramenta valiosa. Os investigadores podem monitorar vários eventos fisiológicos em tempo real usando proteínas fluorescentes, como, fusãos transcricionais e de repórter translacional baseadas em GFP (GFP), d-aminoácidos fluorescentes (FDAA)3,ou usar outras manchas para rotular a parede celular, membrana e DNA. Portanto, não é nenhuma surpresa que a microscopia de fluorescência permaneça popular entre os biólogos de células microbianas. Além de simplesmente mostrar os fenótipos finais, fornecer informações sobre como os fenótipos observados surgem usando microscopia timelapse poderia agregar valor significativo aos resultados e, potencialmente, oferecer pistas sobre o que os processos celulares estão sendo alvo de potenciais candidatos a medicamentos4.
Os protocolos para realizar imagens de alta resolução usando um microscópio de fluorescência totalmente motorizado, invertido e de amplo campo (ver a Tabela de Materiais)são fornecidos neste artigo. Esses protocolos poderiam ser adaptados para atender às necessidades de outros microscópios de fluorescência que são capazes de realizar microscopia timelapse. Embora o software discutido aqui corresponda ao software específico fornecido pelo fabricante, conforme indicado na Tabela de Materiais, software comumente fornecido por outros fabricantes de microscópio ou o ImageJ5livremente disponível, têm ferramentas equivalentes para analisar dados de microscopia. Para condições em que o timelapse não é propício, experimentos de curso de tempo podem ser conduzidos conforme descrito neste artigo. Os protocolos descritos aqui fornecem um guia detalhado para estudar as mudanças phenotípicas em duas espécies bacterianas diferentes: B. subtilis e S. aureus. Veja a Tabela 1 para cepas usadas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td>Molecular Biology Grade - Low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3166</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1755-10</td>
			<td>Dioxane-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>GE</td>
			<td>DeltaVision Elite</td>
			<td>Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC190723</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>3445805MG</td>
			<td>FtsZ inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftWorx</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td>Manufacturer-supplied imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell fluorescence microscopy to investigate subcellular protein localization and cell morphology changes in bacteria

Investigações de fatores que influenciam a divisão celular e a forma celular em bactérias são comumente realizadas em conjunto com a microscopia de fluorescência de alta resolução, já que observações feitas em nível populacional podem não refletir verdadeiramente o que ocorre em um único nível celular. A microscopia de lapso de tempo de células vivas permite que os investigadores monitorem as mudanças na divisão celular ou na morfologia celular que fornecem insights valiosos sobre a localização subcelular de proteínas e o momento da expressão gênica, como acontece, para potencialmente ajudar a responder a importantes questões biológicas. Aqui, descrevemos nosso protocolo para monitorar mudanças phenotípicas em Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus usando um microscópio de deconvolução de alta resolução. O objetivo deste relatório é fornecer um protocolo simples e claro que possa ser adotado por outros investigadores interessados em realizar experimentos de microscopia de fluorescência para estudar diferentes processos biológicos em bactérias, bem como outros organismos.

Fenótipos gpsb Anteriormente, mostramos que o Sa-GpsB é uma proteína essencial, pois o esgotamento do GpsB usando um RNA antisenso resulta em lysiscelular 9. Aqui descrevemos como o surgimento de vários fenótipos de divisão celular e mudanças na localização de proteínas poderiam ser capturados usando o protocolo de microscopia timelapse descrito neste artigo. Para este fim, S. aureus cepas RB143 [SH1000 abrigando pEPSA5 (vetor vazio)] e GGS8 [SH1000 abrigando...

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Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Este artigo fornece um guia passo a passo para investigar a dinâmica de localização subcelular de proteínas e monitorar mudanças morfológicas usando microscopia de fluorescência de alta resolução em Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.

Microscopia de Fluorescência de células vivas para investigar a localização de proteínas subcelulares e alterações da morfologia celular nas bactérias

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Este protocolo facilita a observação direta de várias alterações fenotípicas a um nível unicelular e permite o monitoramento contínuo da localização de proteínas e do tempo de expressão genética. A principal vantagem da microscopia de fluorescência é que é um método simples para monitorar vários processos biológicos, como a divisão celular e mudanças de morfologia celular em células vivas. Certifique-se de prestar especial atenção ao protocolo de preparação da amostra e explorar o software de microscópio para poder localizar as configurações e opções listadas neste protocolo.Uma representação visual deste protocolo é fundamental porque permite que os usuários observem e aprendam os passos significativos da técnica à medida que configuram seus próprios experimentos. Comece rotulando uma alíquota de cinco a 50 microliteres da cultura celular de interesse com um corante de coloração de membrana apropriada e adicionando cinco microliters das células bacterianas vitrais em um deslizamento de tampa na parte inferior de um prato de cultura de fundo de vidro de 35 mililitros. Coloque uma laje de 11 milímetros de diâmetro sobre a amostra e toque suavemente para certificar-se de que a laje está plana contra o deslizamento da tampa.Em seguida, adicione aproximadamente cinco microlitros de água ao redor da tampa para evitar que a almofada de agarose seque e permita que o prato de cultura se equilibre à temperatura dentro da câmara de incubação de um microscópio de desconvolução de alta resolução por 15 a 20 minutos. Para visualizar a amostra, use o botão de foco de ajuste grosseiro para certificar-se de que o objetivo está totalmente reduzido antes de inicializar o microscópio dentro do software de microscópio. Coloque uma gota de 1.517 óleo de índice refrativo no objetivo de imersão de óleo de 100x e transfira o prato de fundo de vidro contendo a amostra para o caixão de carcaça metálica.Deslize suavemente o prato para dentro do grampo de palco, e use o botão de ajuste grosseiro para elevar o objetivo até que o óleo faça contato com o fundo de vidro do prato. Use a ocular e o botão de ajuste fino para colocar a amostra em foco e mude para o modo câmera. No software de imagem na janela Resolver 3D, selecione o ícone Design/Executar Experimento.Uma nova caixa de diálogo aparecerá intitulada Design/Executar Experimento. Abra as guias Design e Secção na caixa de diálogo para definir o número de pilhas Z e a espessura da amostra. Para medir a espessura das células da amostra, ajuste gradualmente o plano Z usando as setas para cima e para baixo na caixa de diálogo Resolver 3D, fazendo com que as células saiam de foco como os limites superiores e inferiores para a Aquisição de Imagem.Depois de ajustar a Transmissão percentual da intensidade da luz e a duração da Exposição para os canais selecionados individuais na caixa de diálogo Resolver 3D, clique em Lista de pontos para abrir a Lista de Pontos. Nas guias Design e Time Lapse, selecione a caixa de seleção Time Lapse e digite os parâmetros de lapso de tempo. Selecione a opção Lista Do Ponto de Visita e digite os pontos a serem imagens na caixa de texto, separando os pontos por írgulas ou hífens para sequências completas.Em seguida, edite nomes de arquivos e locais de arquivo na guia Executar e selecione Reproduzir na caixa de diálogo Iniciar experimento para iniciar o experimento. Ao final da análise, abra os arquivos de imagem RAW de interesse em um programa de desconvolução apropriado e selecione a guia Processo e Deconvolve. Execute qualquer subtração manual de ruído de fundo e ajuste de contraste de brilho em qualquer ou todos os canais de comprimento de onda, conforme necessário, antes de salvar a imagem como um arquivo TIFF.Para quantificação do comprimento do celular, abra os arquivos de imagem desconvolucidos no software fornecido pelo fabricante ou em software de imagem livre, como ImageJ, e abra a guia Ferramenta. Em seguida, selecione Medir distâncias e clique à esquerda nos pontos de partida e extremidade do arquivo de imagem desejado para medir o comprimento da célula. Para quantificação de sinal fluorescente, selecione Data Inspector.Desenhe uma caixa com a opção Coluna/Linha definida para a dimensão específica de interesse e selecione a área com o sinal a ser quantificada. A adição de xilose para induzir uma cepa GGS 8 resulta em um fenótipo de seis células. Enquanto os controles vetoriais vazios parecem semelhantes às células de controle cultivadas na ausência de indutor.A superprodução do estafilococos aureus gpsB interrompe a divisão celular em B.subtilis medida pela microscopia de lapso de tempo e quantificação do comprimento da célula. Além disso, os padrões de localização de FtsZ ou uma das proteínas associadas a essa proteína podem ser usados por um repórter para estudar e/ou identificar novos compostos antimicrobianos através da imagem de lapso de tempo e quantificação do comprimento celular. Certifique-se de usar um óleo com o índice de refração adequado, pois o índice de refração pode mudar dependendo da temperatura utilizada para a imagem.A desconvolução pode ser realizada se o usuário quiser remover ruídos fora do foco, e a análise de dados envolvendo quantificação de sinal fluorescente e medidas de comprimento e largura da célula também podem ser realizadas.

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Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

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