Name: human ipsc-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings
Uploaded: 2019-07-15T14:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings at JoVE.com

1. voorbereiding van oplossingen en materialen (zie tabel van de materialen)
<ol><li>
6-goed weefsel-cultuur plaat substraat-coating
	<ol>
<li>Het coating substraat op ijs of bij 4 °C ontdooien.</li>
		<li>Bereid een 1:100 coating substraat verdunning in koude DMEM/F12 medium. Meng de oplossing door langzame pipetteren.</li>
		<li>Breng 2 mL van de coating substraat oplossing (stap 1.1.2) per put van een 6-goed weefselcultuur plaat.</li>
		<li>Plaats de gecoate weefselkweek plaat onmiddellijk in de celkweek incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende ten minste 7 uur en gebruik deze binnen 7 dagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
hiPSC-CM kweekmedium
	<ol>
<li>Voeg 10 mL CM Media supplement ontdooid bij 4 °C tot 500 mL basismedium. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.</li>
		<li>Aliquot vereiste hoeveelheid media voor de dag en op kamertemperatuur brengen voor gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>de hipsc-cm ontdooien medium: bereid het verse door het kweken van hipsc-cm kweekmedium (stap 1,2) met 10% foetaal runderserum (FBS). Breng de media op kamertemperatuur voordat u CMs ontdooit voor suspensie.</li>
	<li>Fibronectin 1 mg/mL stamoplossing: aliquot 200 μL in 1,5 mL steriele microfugebuis buizen en opgeslagen bij 4 °C voor later gebruik. Bereid werkoplossing van 50 μg/mL concentratie vers op ijs.</li>
	<li>Multi well Cleaning Solution: Combineer 0,5 g enzymatische reinigingsmiddel met 50 mL steriel dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Vortex om de inhoud te mengen. Filter en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal een week.</li>
</ol>2. voorbeplating van cryopreserved hiPSC-CM voor rijping (figuur 1)
Opmerking: deze sectie is bedoeld voor het ontdooien en kweken van hipsc-CMs dat gedifferentieerd is met de feeder-Free monolaag methode3,16 en cryopreserved in vloeibare stikstof 10 dagen na differentiatie bij 1-2 miljoen cellen/injectieflacon. Cellen uit één injectieflacon worden in twee putten met substraat coating van een 6-Wells weefselkweek plaat geplateerd. Cardiomyocyten hebben de neiging om zich te vestigen op de bodem van de buis, zodat Zacht mengen op het moment van pre-plating is belangrijk voor het bereiken van gelijkmatige celdichtheid over putten.
<ol><li>Aliquot 2 mL FBS per injectieflacon hiPSC-CMs ontdooid in een conische buis van 15 mL en op kamertemperatuur brengen.</li>
	<li>Ontdooien injectieflacons met cryopreserved hiPSC-CMs door ze in een waterbad van 37 °C te plaatsen en zachtjes te zwenken voor zelfs ontdooien gedurende niet meer dan 3 minuten.</li>
	<li>Breng de inhoud van de injectieflacon onmiddellijk over naar de buis met FBS (zie stap 2,1), Meng door wervelend en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Aspireren de supernatant en rediëren van de celpellet in 1 mL hiPSC-CM ontdooien medium (zie stap 1,3) per injectieflacon ontdooid. Gebruik een pipet om de pellet door zachte trituratie te hervatten. Evalueer de levensvatbaarheid van de cel.</li>
	<li>Voeg extra 3 mL ontdooien per injectieflacon hiPSC-CM ontdooid in stap 2,4 en onderbreek zachtjes met behulp van een transferpipet om celklonters verder te ontkoppelen.</li>
	<li>Doseer 2 mL celsuspensie zachtjes in elke put van 6-well platen met substraat coating (zie stap 1,1). Plaats in de celkweek incubator bij 37 °C en 5% CO2.</li>
	<li>Vervang met verse hiPSC-CM kweekmedium na 24 h en 3 keer per week gedurende 20 dagen. Opmerking: cellen moeten 24 uur per dag aan de substraat coating voldoen en spontaan op 48 h na het plating kloppen (Zie Video 1 en video 2).</li>
</ol>3. multi well MEA plaat sterilisatie en coating (figuur 2 en figuur 3)
Opmerking: het hier beschreven protocol is voor het bereiden van 24-Well MEA platen met 12 micro Gold PEDOT gecoate elektroden op glas voor het beplating van hiPSC-CM. Vermijd het aanraken van de bodem van de plaat, omdat dit de elektroden kan beschadigen.
<ol><li>Voeg twee dagen vóór het beplating van de cel 0,5 mL hiPSC-CM kweekmedium (zie stap 1,2) toe aan elk goed en voer een basislijn opname uit om de signaal-ruis verhouding voor de kwaliteitscontrole van de Mea's te controleren.</li>
	<li>Aspireren van de media, spoelen met steriele ddH2O en steriliseren onder UV-licht in een laminaire flow kap 's nachts.</li>
	<li>De dag voorafgaand aan celplating, toevoegen 0,1 mL FBS aan elk goed voor hydrofiele behandeling van MEA oppervlakken. Inincuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Deze stap is nodig voor de celbijlage.</li>
	<li>Zuig de FBS op en spoel af met 0,5 mL steriele ddH2O per put. Herhaal nog een keer.</li>
	<li>Laat de plaat 's nachts drogen in de laminaire flow Hood.</li>
	<li>Bereid een werkverdunning van 50 μg/mL fibronectin in koud DMEM/F12 medium uit de voorraad (zie stap 1,4). Houd de oplossing op ijs.</li>
	<li>Pipetteer 5 μL van de werkende fibronectine verdunning (zie 3,6) en verdeel de druppel voorzichtig naar het midden van elk goed om alle 12 elektroden te bedekken. Het is belangrijk om snel over de 24 putjes te werken om te voorkomen dat de druppel uitdroogt.</li>
	<li>Plaats de met fibronectin gecoate multi well MEA plaat onmiddellijk op een verhoogd oppervlak in een bevochtigend kamer met steriele ddH2O om het gehele vaat oppervlak te bedekken. Plaats de kamer met de multi well MEA Plate voor 3 uur in de celkweek incubator. Opmerking: het plaatsen van de 24 Well MEA plaat in een bevochtigende kamer is van cruciaal belang om te voorkomen dat fibronectin druppeltjes uitdrogen tijdens de incubatieperiode.</li>
</ol>4. hiPSC-CM dissociatie en beplating op multi well MEA plaat (figuur 3)
Opmerking: start deze stap ongeveer 1 uur vóór de incubatie van MEA fibronectin is voltooid. Zorg ervoor dat de oplossing voor celdissociatie bij 37 °C ligt en dat het ontdooien van het iPSC-CM-medium op kamertemperatuur is. Dissociatie methoden zijn geoptimaliseerd voor 30 dagen na gedifferentieerd hiPSC-CMs gekweekt op substraat-gecoate 6-well platen (zie stap 2) om ongeveer 90% levensvatbare CMs voor MEA plating te verkrijgen. Er moet voor worden gezorgd dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd tijdens de trituratie om celdood te voorkomen.
<ol><li>Aspirate het cultuurmedium van elke put van de 6-well weefselcultuur schotel met 30 dag post-gedifferentieerde hiPSC-CM cultuur (zie stap 2,7) en was met 2 mL steriele D-PBS per put.</li>
	<li>Voeg 1 mL voorverwarmde celdissociatie oplossing (Zie tabel met materialen) per put toe en inbroed gedurende 4 minuten bij 37 °c. Gebruik een pipet om voorzichtig te tritureren om de cellen los te maken voor dissociatie. Als de meeste cellen nog steeds aanhandig zijn, inbroed dan nog eens 3 min bij 37 °c en weer wrijf. Deze extra incubatie moet helpen bij het maximale celherstel. Niet inbrokkelen gedurende meer dan 7 minuten, omdat dit kan resulteren in een lage levensvatbaarheid van de cel.</li>
	<li>Gebruik een pipet voor het overbrengen van alle gezien cellen in een conische buis die hipsc-cm ontdooien medium bevat (zie stap 1,3). Het wordt aanbevolen om de cellen in ten minste tweemaal het volume van de media (2 mL per goed worden geoogst) op te schorten om de activiteit van de cel dissociatie oplossing te blokkeren.</li>
	<li>Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Zuig de oplossing zorgvuldig op omdat de pellet losjes aan het oppervlak is bevestigd en respendeert in 0,1 ml van hipsc-cm ontdooien medium. Gebruik een pipet om de pellet een paar keer te hervatten door zachtjes te trituratie.</li>
	<li>2 μl gezien cellen en Verdun met 18 μl media in een 1,5 ml microfugebuis buis. Voeg 20 μL Trypaan blauw toe en meng voor het aantal cellen en de beoordeling van de levensvatbaarheid.</li>
	<li>Stel de celdichtheid in op 6.000 cellen/μL door het juiste volume van het hiPSC-CM ontdooien medium toe te voegen. Onderbreek de pellet door een paar keer zachtjes te flikken. Het hiPSC-CMs is gemakkelijk los te koppelen van glazen oppervlakken, vooral wanneer het wordt geplateerd bij hoge dichtheden. We hebben de zaaien dichtheid en plating voorwaarden om te bereiken 15 dagen van elektrische opnames geoptimaliseerd.</li>
	<li>Wanneer u klaar bent, breng de multi well MEA plaat in de laminaire flow kap voor het zaaien van cellen. Het is van cruciaal belang om de volgende twee stappen een goed op een tijdstip uit te voeren om te voorkomen dat de fibronectin wordt gedroogd.<ol>
<li>Verwijder voorzichtig de fibronectin druppel met een P10 pipet zonder de elektroden aan te raken.</li>
		<li>Verdeel onmiddellijk een 5 μL celdruppel (30.000 cellen) in het midden van de put van de MEA plaat die alle 12 elektroden beslaat. Herhaal de stap tot alle 24 putten zijn verguld. Intermitterende menging van celsuspensie door al vegend wordt aanbevolen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats de multi well MEA plaat terug in de losjes bedekte bevochtigend kamer en keer terug naar de celkweek incubator bij 37 °C en 5% CO2 voor 3 uur voor celbevestiging.</li>
	<li>Voeg voorzichtig 200 μL hipsc-cm ontdooien medium toe aan elk goed zonder de cellen te storen met een P200 pipet. Voeg de media druppelsgewijs toe aan de zijkant van de put.</li>
	<li>Plaats de multi well MEA plaat terug in de celkweek incubator.</li>
	<li>Vervang met een verse hiPSC-CM kweekmedium op 24 uur na het beplating. Op dit moment kan het spontaan verslaan van cardiomyocyten worden waargenomen (Zie Video 3).</li>
	<li>Verander de media elke 2 dagen tot het einde van de experimenten.</li>
</ol>5. hiPSC-CM elektroporation en signaal verwerving (figuren 4 – 6)
Opmerking: dit protocol is voor gelijktijdige opname van high-throughput elektrode signalen (12 locaties voor elk van de 24 Wells). Het 24-Well multi well MEA systeem wordt gebruikt met de acquisitie software (Zie tabel met materialen). Alle MEA opnames worden uitgevoerd bij 37 °C.
<ol><li>Schakel het interface bord in en start de acquisitie software. Geef voldoende tijd voor de hoofdfase van de multi well MEA om de temperatuur van 37 °C te bereiken (zie pijl nummer 1 in Figuur 4).</li>
	<li>Plaats multi well MEA Plate van stap 4 in de hoofdfase van de multi well MEA door deze over het opname platform te plaatsen en klik op de knop bijvoegsel (zie pijl nummer 2 in Figuur 4). Laat de temperatuur stabiliseren voordat de opnames worden gestart.</li>
	<li>
Instellingen voor acquisitie en elektroporation aanpassen
	<ol>
<li>Klik op het pictogram experimentele stroom definiëren (zie pijl nr. 3 in Figuur 4) en stel de opnametijd in op 2 min of naar wens.</li>
		<li>Klik op het pictogram voor het instellen van gegevensverwerving (zie pijl nr. 4 in Figuur 4) en stel samplefrequentie in op 20 kHz, hoogdoorlaatfilter tot 0,1 Hz en low-pass filter tot 3500 Hz.</li>
		<li>Klik op het pictogram stimulator-instellingen (Zie afbeelding 5). Definieer onder het tabblad stimulus-definitie stimulatie als bifasische symmetrische Spanningspulsen van 1 mV, 1 MS en 1 Hz. Onder de stimulatie elektroden tab, selecteer electroporatie sites door het markeren van alle relevante elektroden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klik op de knop verkennen om signalen in alle putjes te visualiseren. Controleer de signaalkwaliteit en de steady state condities. Maak aantekeningen op elektroden met FP-signalen in het mV-bereik. Klik op dezelfde knop om de verkenning te stoppen. Tot op dit moment zijn er geen gegevens geregistreerd.</li>
	<li>Start de opname door op de Go! -knop te klikken. De elektroden in elke put zullen FP-signalen tonen in het venster onbewerkte gegevens (Figuur 6). Na 30 s van de opname, klik op de knop stimuleren en laat elektroporation plaatsvinden op de geselecteerde sites voor 30 s; Klik vervolgens op dezelfde knop om stimulatie te stoppen en door te gaan met opnemen voor de resterende 60 s. Opmerking: het opgenomen bestand kan worden afgespeeld door over te schakelen naar ' Replayer mode ' in het vervolgkeuzemenu ' toepassing '.</li>
</ol>6. multi well MEA plaat reiniging voor hergebruik
<ol><li>Reinig na de laatste experimenten alle putjes in de multi well plate door alle media-inhoud van elk putje te zuigen en het elektrode oppervlak voorzichtig te vermijden.</li>
	<li>Voeg 1 mL steriele ddH2O per put toe. Aspirate en herhaal één keer.</li>
	<li>Voeg toe 0,3 mL multi well reinigingsoplossing (zie stap 1,5) per put. Incuberen 's nachts op kamertemperatuur om cellen en puin te verdrijven.</li>
	<li>Zuig de volgende ochtend de oplossing op en spoel met 1 ml steriele DDH2O. inincuberen gedurende 5-7 min en aspiraat. Herhaal dit 5 keer.</li>
	<li>Voeg 0,5 mL steriele ddH2O per put toe. Noteer de basislijn van de gereinigde multi well-plaat voor de kwaliteitscontrole van de gereinigde Mea's (Figuur 7).</li>
	<li>Bewaren bij 4 °C tot het klaar is voor gebruik.</li>
</ol>7. conversie en export van gegevensbestanden
Opmerking: er worden vier gegevensbestanden gegenereerd voor elke opname: MWR-, MWC-, MWD-en MWS-bestanden. Met behulp van de conversie software kan het MWD-bestand worden geconverteerd naar het H5-bestand voor daaropvolgende analyse met behulp van een op maat gemaakt script (Zie aanvullend bestand 1).
<ol><li>Start de conversie software (Zie tabel met materialen).</li>
	<li>Selecteer invoerpad instellen in het menu bestand . Selecteer map met gegevensbestanden van belang.</li>
	<li>Selecteer uitvoerpad instellen in het menu bestand . Selecteer de map waarin geconverteerde bestanden moeten worden opgeslagen.</li>
	<li>Markeer het MWD-bestand met interesse.</li>
	<li>Klik op de knop exporteren naar hdf5 .</li>
</ol>8. segmentatie en analyse van gegevens (cijfers 8-10)
Opmerking: op MATLAB gebaseerde aangepaste software wordt gebruikt om verschillende FP-en AP-gegevens parameters te segmenteren en te extraheren. Software is beschikbaar op aanvraag.
<ol><li>Voer de Waveform-analyse code uit met MATLAB (Zie afbeelding 8 voor een weergave van het hoofdvenster van de GUI).</li>
	<li>Klik op bestand en selecteer process. H5.</li>
	<li>Zoek en selecteer het bestand mwd. H5 dat is gemaakt volgens stap 7 hierboven.</li>
	<li>Klik op de knop Save Directory om de opslaglocatie van de uitvoerbestanden te wijzigen.</li>
	<li>Maak een signaalverwerking wachtrij door te selecteren elektrode/well combinaties van belang en klik vervolgens op de wachtrij knop. Herhaal deze stap om meer elektrode/well-combinaties toe te voegen die naar de wachtrij worden verwerkt.</li>
	<li>Bewerk de wachtrij door direct op med-naam/med-concentratie te klikken als cellen werden behandeld met drugs (Figuur 8).</li>
	<li>Zodra de wachtrij definitief is, klikt u op de knop waveforms initialiseren . Hiermee start u de voorbereidende verwerking waarin signalen worden geïdentificeerd en geëxtraheerd voor segmentatie.</li>
	<li>Klik op de knop Inzoomen en selecteer het actiepotentiaal gebied met de cursor (afbeelding 9).</li>
	<li>Klik op de knop Keep en Bekijk de deelvensters. Pieken (rode ' x ') en troggen (gele cirkels) worden gedetecteerd voor elke golfvorm en de genormaliseerde actie potentialen worden bovenop. Klik op de knop Keep en ga verder met de volgende tracering in de wachtrij (afbeelding 10).</li>
	<li>Herhaal stap 8.8-8.9 voor de rest van de elektrode/well-combinatie signalen in de wachtrij. Opmerking: er wordt een . CSV -bestand gegenereerd met apd-parameters die worden gemeten voor elke golfvorm. Een . mat -bestand voor elk . H5 -bestand wordt ook opgeslagen om extra verwerking van gesegmenteerde gegevens toe te staan.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In de loop der jaren is de toepassing van meas beperkt tot het uitvoeren van FP-metingen van prikkelbaar cellen om hun elektrofysiologische eigenschappen te bestuderen36,37,38,39. Slechts een paar groepen hebben gerapporteerd AP sporen van elektrogene cellen met behulp van aangepaste mea gebaseerde technologie18,29,30. Deze benaderingen zijn echter niet onderzocht op herhaalde opnames van dezelfde preparaten. We ontwikkelden een innovatieve en accurate methodologie voor het bestuderen van APs van dezelfde cellocatie gedurende dagen in meerdere hiPSC-CM-netwerken tegelijk3. In onze gepubliceerde studie werd een multi well micro-Gold MEA-platform gebruikt om AP Waveform-bibliotheken te genereren uit meerdere batches hiPSC-CM-culturen met hoge precisie en met een temporele resolutie van 1 μs. Het hier beschreven protocol verklaart de zaaien van hipsc-CMs op de array voor een efficiënte ontwikkeling van syncytiële cm-netwerken voor AP-opnames met een hoge doorvoer. Verschillende kritieke stappen in het protocol zijn: 1) productie van meerdere hoge zuiverheids batches van kwaliteitscontrole CMS voor cryopreservatie Banking, 2) zeer levensvatbare post-Thaw CMS voor pre-plating en rijping, 3) behandeling van de multi well mea plaat voor cm Seeding, 4) hiPSC-CM cultuur dissociatie op 30 dagen na differentiatie voor MEA plating, en 5) restauratie van de Mea's voor meervoudig hergebruik.
Het is belangrijk op te merken dat Batch-to-batch variatie in hiPSC differentiatie invloed kan hebben op experimentele uitkomsten. De monolaag-methode van differentiatie werd in-House geoptimaliseerd voor hoog percentage hartspier productie3,40. De FACS analyse van MLC2v en TNNT2 markers van onze culturen tonen een ≥ 90% ventriculaire-achtige fenotype3. Deze culturen met kwaliteitscontrole zijn cryopgereserveerd voor experimentele studies. De huidige differentiatie benaderingen opleveren een heterogene mix van nodal-, atriale-en ventrikel-achtige cellen3,16,17,41. Daarom kunnen strategieën voor CM-subtype populatie verrijking de specificiteit van de culturen verder verbeteren. Bovendien, weefsel engineering benaderingen kunnen worden gebruikt om hun rijping te verbeteren. De hier voorgestelde methoden kunnen gemakkelijk worden geïmplementeerd voor andere CM-bronnen.
De AP-golfvormen die met mea werden geregistreerd, waren vergelijkbaar met die opgenomen in netwerken van cardiomyocyten door optische toewijzing42,43, aanvullende metaaloxide halfgeleider-gebaseerde mea18,21en gesimuleerde AP met behulp van FP Recordings20. Om het mechanisme van AP-metingen via MEA Hai en Spira25 aan te pakken, is aangetoond dat de elektropore-elektrode-interface de gevestigde Sharp Glass micro elektrode-techniek nabootsen. Het rust membraanpotentiaal en de ware amplitude waarden in ons onderzoek kunnen echter niet worden vastgesteld gezien het feit dat de elektropore-elektrode-interface in MEA Systems niet is gekalibreerd en dat de amplitude een functie is van de gevoeligheid en resolutie van de Techniek. Onze aanpak deelt vergelijkbare beperkingen als optische mapping als het gaat om de amplitude van de AP.
De multi well MEA-based FP/AP-uitlezingen die hier worden gerapporteerd, openen nieuwe mogelijkheden voor beoordeling van de geneesmiddelen veiligheid. Hoewel spontaan, verslaan deze hipsc-cm monolagen een constante snelheid. De analyse van APD-parameters in meerdere netwerken biedt inzicht in de elektrische heterogeniteit (Figuur 13). Uitgebreide APD-restitutie-analyses moeten echter voorafgaande diastolische intervallen omvatten. Bovendien zijn hoogwaardige AP-golfvormen die zijn opgenomen op dezelfde cellocatie boven 96 uur (figuur 11B) het eerste rapport om membraan elektrodynamica in de loop van de tijd te volgen, wat van waarde zal zijn in ontwikkeling en in ziekte.
Het protocol dat hier wordt beschreven voor het kwantificeren van AP-parameters kan worden gebruikt om dosisrespons curven te genereren voor het testen van verbindingen. Zoals onlangs gemeld door Edwards et al.3, worden de dosisrespons van noradrenaline, isoproterenol en E 4031 uitgezet voor apd bij verschillende repolarisatie fasen. De gepubliceerde studie toonde de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de aanpak voor het identificeren van de dosis-afhankelijke subtiele veranderingen in de AP golfvormen in real time. Deze techniek kan gemakkelijk worden uitgebreid voor andere verbindingen of kleine molecuul bibliotheken voor het begrijpen van verschillende elektrofysiologische reacties.
De op MEA gebaseerde benadering voor AP-metingen die in deze studie wordt gepresenteerd, zal niet alleen van belang zijn voor elektrofysiologen, maar ook voor celbiologen en in-silico modelers. Bovendien zullen FP/AP-opnames van dezelfde mobiele site op hipsc-CMs onderzoekers in staat stellen om binnen korte tijd bioelektrische data bibliotheken van een breed scala aan prikkelbaar cellulaire netwerken te genereren. Beschikbaarheid van deze middelen zal waardevol zijn voor drugs ontdekkingen en ziekte modellering.

Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hipsc-CMs) zijn de gouden standaard voor een toenemend aantal laboratoria1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Embryoïde lichamen verslaan11,12,13 en monolaag3,7,10,11,12, 13,14,15,16,17 differentiatie zijn de voorkeurs methoden voor de productie van cardiomyocyten en de multi-elektrode array (MEA) is uitgegroeid tot een gemeenschappelijke modaliteit voor het monitoren van de elektrodynamica van deze netwerken18,19,20. Terwijl parameters die kunnen worden geëxtraheerd uit het veld mogelijkheden (fps) zoals kloppen rate, amplitude, duur en RR intervallen zijn Baseline elektrofysiologische reacties van spontaan het verslaan van monolagen18,21, 22,23, de actiepotentiaal (AP) componenten die aan deze extracellulaire FP-signalen liggen, zijn moeilijk te extrapoleren24. Onze recente publicatie over de ontdekking van een toepassing van Mea's voor directe terugkerende AP-metingen biedt een bewijs van methodologie voor voorbeeldige intracellulaire AP-uitlezingen met een uitgebreide golfvorm analyse bij verschillende repolarisatie fases over meerdere partijen hipsc-afgeleide hartspier netwerken3. In de studie hebben we aangetoond dat de levering van elektroporerende pulsen naar netwerken van door hiPSC afgeleide cardio myocytes intracellulaire toegang voor AP-opnames mogelijk maakt. Deze transiënte AP-opnames zijn afhankelijk van mogelijke terugvindingen van transmembraan die worden waargenomen via de schade plaats3,25,26. Golfvormen opgenomen via MEA en patch-Clamp in onze studie toonden vergelijkbare AP-morfologieën waardoor de betrouwbaarheid van de approach3wordt valide.
Een paar laboratoria hebben gerapporteerd het meten van APS uit verschillende elektrogene cellen met behulp van op maat gemaakte meas18,21,26,27,28,29, 30, maar de betrouwbaarheid van het gebruik van Mea's voor consistente en terugkerende AP-metingen werd niet beoordeeld. Momenteel is de Gold Standard Patch-clamp techniek beperkt tot Terminal opnames7,31 terwijl, op mea gebaseerde AP-metingen van voorbijgaande aard zijn en daarom meerdere malen op dezelfde cel kunnen worden uitgevoerd. We laten ook zien dat men gemakkelijk AP-signalen van hoge kwaliteit kan opnemen in het millivolt-bereik dat minimale filtering vereist. Onderzoekers kunnen daarom niet alleen acute, maar ook chronische geneesmiddelen studies uitvoeren in dezelfde preparaten die Mea's gebruiken. Bovendien maakt deze technologie gelijktijdige FP/AP-meting het mogelijk om in korte tijd Electro-Biome-bibliotheken te genereren. Gezien de toenemende nadruk op aritmie voorspelling en drug geassocieerde cardiotoxiciteit24,32,33,34,35, integratie van AP-meting benaderingen zullen de beoordeling van de geneesmiddelen veiligheid en de werkzaamheid verbeteren.
Hier presenteren we protocollen voor 1) pre-plating van cryopreserved hiPSC-CMs voor rijping, 2) dissociatie en plating van hiPSC-CMs op multi well MEAs, 3) opname van FPs en APs van hiPSC-CM Networks, 4) segmenteren en extraheren van de gegevens voor analyse, en 5) het herstellen van de arrays voor meervoudig hergebruik. Elke stap is geoptimaliseerd met nadruk op kritieke stappen waar relevant. Eisen voor celbevestiging om te zorgen voor een kloppende syncytiële monolaag worden besproken en procedures voor multi well mea restauratie voor repetitieve elektrofysiologische studies worden uitgelegd. Ten slotte wordt een aangepaste GUI ontwikkeld in het laboratorium gepresenteerd voor AP-signaal extractie, kwaliteitsborging en segmenterings werkstroom om AP-parameters te kwantificeren en te analyseren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>Multiwell-Screen v 1.9.2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>CM media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Converter software</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MultiChannel DataManager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007103HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1413202</td>
			<td>coating substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface board</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell MEA Plate</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>24W300/30G-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>CM base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terg-a-zyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z273287-1EA</td>
			<td>enzymatic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes, individually wrapped</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1371148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure sterile water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue-culture treated plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human ipsc-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings

Cardiale veiligheids screening is van het allergrootste belang voor de opsporing van geneesmiddelen en Therapeutics. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe high-throughput elektrofysiologische benaderingen voor de hipsc-afgeleide hartspier (hipsc-cm) preparaten veel nodig voor het efficiënt testen van medicijnen. Hoewel multi-elektrode arrays (mea's) vaak worden gebruikt voor veld potentiaal metingen van prikkelbaar Cells, is een recente publicatie van Joshi-Mukherjee en collega's beschreven en gevalideerd haar aanvraag voor terugkerende actiepotentiaal (AP) opnames van dezelfde hiPSC-CM voorbereiding over dagen. Het doel hier is om gedetailleerde stapsgewijze methoden te bieden voor het zaaien van CMs en voor het meten van AP-golfvormen via elektroporation met hoge precisie en een temporele resolutie van 1 μs. Deze aanpak behandelt het gebrek aan gebruiksvriendelijke methodologie om intracellulaire toegang te krijgen voor AP-metingen met hoge doorvoer voor betrouwbare elektrofysiologische onderzoeken. Een gedetailleerde werkstroom en methoden voor het bekleden van hiPSC-CMs op multi well MEA Plates worden besproken met nadruk op kritische stappen waar relevant. Bovendien wordt een op maat gemaakt MATLAB-script voor snelle gegevensverwerking,-extractie en-analyse gerapporteerd voor uitgebreid onderzoek van de golfvorm analyse om subtiele verschillen in morfologie te kwantificeren voor verschillende AP-duur parameters die betrokken zijn bij aritmie en cardiotoxiciteit.

De levensvatbaarheid en plating dichtheid van post-ontdooide hiPSC-CMs is van cruciaal belang voor de multi well MEA cultuur. Pre-plating van 1-2 miljoen hipsc-CMs/Vial in twee putten van een 6-Wells weefselkweek plaat met 50% of meer levensvatbaarheid zal een gezonde monolaag cultuur produceren met spontaan verslaan op 48 h. slechte levensvatbaarheid van CMs zal resulteren in culturen met een hoog percentage van niet-Myocyte populaties. Deze monolagen bij gezien voor multi well mea plating produceren in het algemeen inconsistente resultaten en slechte kwaliteits signalen en moeten daarom worden weggegooid. Figuur 1 toont voorbeelden van optimale versus suboptimale hipsc-CMs culturen op 48 h post plating. Het ontdooien van het CMs op substraat gecoate weefselkweek platen in plaats van direct op multi well MEAs, zorgt voor celherstel en rijping3. Directe beplating van cryopreserved CMs op de array wordt niet aanbevolen omdat het inconsistente resultaten produceerde.
Naast de kwaliteit van het gedissocieerde CMs is de celhechting op de multi well MEA sterk afhankelijk van de celdichtheid en de fibronectin coating techniek. De grootte van de fibronectin-druppel is essentieel omdat het CMs voldoet aan de grenzen van het gebied met fibronectine-coating. Om deze reden wordt slechts 5 μL van de fibronectin-oplossing direct over het elektrode-array gebied afgeleverd. Om ervoor te zorgen dat de druppel niet dispergeren, moet het goed oppervlak volledig droog zijn op het moment van coating. Figuur 2 toont de lay-out van de multi well mea plaat met schema's van stap-voor-stap voor behandeling voor optimale voorbereiding. Om te voorkomen dat de fibronectin wordt gedroogd, moeten de multi well MEA platen in een bevochtigende kamer worden geplaatst gedurende de incubatieperiode van niet meer dan 3 uur (zie stap 3,8). Zodra de incubatieperiode is voltooid, is het belangrijk om de fibronectin druppel van elk goed te verwijderen vlak voor het beplating van de cm en pas vervolgens door te gaan naar volgende goed beplating. Snel en zorgvuldig doseren van het CMs is de sleutel tot een succesvolle celbevestiging.
hiPSC-CM culturen op 30 dagen na differentiatie worden losgekoppeld voor multi well MEA plating met behulp van de enzymatische celdissociatie methode (zie stap 4). CMs zal met 3 uur aan de op fibronectin gecoate mea-oppervlakken worden bevestigd en een monolaag die de arrays beslaat, zal zichtbaar zijn na 24 uur na het beplating (Figuur 3). Synchrone kloppen van de monolaag zal worden waargenomen bij 24-48 h. de dispersie van de celdruppel beïnvloedt de cultuur dichtheid of leidt zelfs tot drogen en celdood. Nauwkeurige plaatsing van de cel direct op de array is van het allergrootste belang en daarom moet de techniek worden beoefend voor optimale beplating. Celadhesie aan de referentie-elektrode zal de productie van elektrische signalen belemmeren. Zie afbeelding 3 voor afbeeldingen van optimale plaatsing van cm en cultuur na 24 uur.
Het CMs gecultiveerde op multi well MEAs worden onderworpen aan kwaliteitscontrole voor elektrische activiteit bij 48 h na het beplating. Doorgaans neemt de amplitude van het FP-signaal toe van het μV-bereik naar mV in ongeveer 4 dagen3. Als 50% van de elektroden binnen een netwerk en 70% van de totale netwerken niet FP-signalen produceren, dan is het netwerk of de cultuur suboptimaal en moet worden weggegooid. Alleen culturen die de kwaliteitscontrole doorstaan, worden verwerkt voor FP-en AP-analyse. Figuur 6 toont voorbeelden van goede en sub-standaard FP-signalen.
Elektroporation-gemedieerde AP-opnames kunnen meerdere malen worden verkregen uit culturen 48 h na-MEA plating. Met Electroporation hebben we intracellulaire toegang tot het opnemen van High-Resolution APS van meerdere door hipsc afgeleide hartspier-netwerken opgedaan. Laagspannings pulsen (1 V, 1 MS, 1 Hz) voor 30 s werden geleverd voor voorbijgaande, omkeerbare transformatie van FP naar AP. De elektroporation zorgt voor een succesvolle intracellulaire toegang voor AP-meting in ongeveer 75% van de elektroden. Elektrische signalen worden geregistreerd voor 2 minuten met 30 s pre-elektroporation, 30 s tijdens en 1 min post-Electroporation. Een trein van 10 s AP golfvormen 10 s post-Electroporation worden geëvalueerd op alle locaties voor signaalkwaliteit en analyse. Elke tracering die niet aan het zuivere AP-signaal voldoet, wordt genegeerd. Om te onderzoeken of AP amplitudes correleren met FP signaal we elektroporated alle 288 sites om gelijktijdig te registreren golfvormen. Representatieve FP-en AP-signalen die vanuit dezelfde cellocatie van twee verschillende elektroden zijn opgenomen, worden weergegeven in figuur 11a. We waargenomen geen correlatie tussen FP amplitudes en post electroporatie AP amplitudes opgenomen van dezelfde cel site. Bovendien hadden meerdere elektroporaties van dezelfde cellocatie op 0, 24, 48, 72 en 96 h na verloop van tijd geen significant effect op de AP-vorm (figuur 11B).
Gezien de hoge doorvoersnelheid van het systeem is een handmatige techniek om parameters van belang te extraheren en te kwantificeren, zoals RR-interval, momentane frequentie en differentiële actiepotentiaal duur, inefficiënt en tijdrovend. Een op maat gemaakt MATLAB-script dat op verzoek beschikbaar is voor de onderzoeksgemeenschap, wordt gebruikt om golfvorm metingen uit te voeren met een resolutie van 1 μs. Elektroporation tijdpunten worden met het geëxtraheerde signaal overgelegd om 10 s van AP post-Electroporation te identificeren om signaal extractie, kwaliteitsborging en segmentatie workflow uit te voeren (Figuur 8, Figuur 9, figuur 10). de gebruikersinterface maakt het mogelijk om het gewenste segment te selecteren met behulp van de overlegde elektroporation indicatoren als leidraad. De gesegmenteerde golfvorm wordt verwerkt door subroutines om individuele AP-golfvormen verder te identificeren. Dit wordt voltooid door middel van piek detectie, waarbij voor elke cyclus de hoogste en laagste spanning wordt vastgesteld. Zodra dit proces is voltooid, de amplitudes zijn genormaliseerd, en de koppelen tijd vectoren worden verschoven om te definiëren tijd nul met een piekwaarde van 1. Interpolatie van snijpunten langs de individuele cycli werd gebruikt om APD-metingen te bepalen. Dus, gedeeltelijke automatisering workflow voor AP golfvorm segmentatie maakt efficiënte data-analyse voor verschillende APD parameters over meerdere batches van culturen in een korte periode van tijd. Verdere automatisering van inclusie-en uitsluitingscriteria voor FPs en APs loopt voort voor real-time data-analyse.
Een significant voordeel van de multi well MEA Plate is dat het meerdere malen hergebruikt kan worden. Deze restauratie maakt repetitieve elektrofysiologische studies mogelijk voor kosteneffectieve en consistente gegevensverzameling. Opnames van APs uit dezelfde array na 6 restauraties worden weergegeven in afbeelding 12. Signaal-ruis verhouding is vergelijkbaar bij meerdere herhalingen. Om de betrouwbaarheid van de array voor repetitieve elektrofysiologische studies aan te tonen, worden in totaal 3815 AP-golfvormen samengevoegd van drie restauratie batches en worden AP-duur gegevens geëxtraheerd om de reproduceerbaarheid van de resultaten te onderzoeken. Distributie percelen voor individuele golfvorm APD30, apd80, driehoeksmeting (apd80— apd30) en breuk verkorting (apd80— apd30)/(apd80)) worden weergegeven (Figuur 13).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig1.jpg"> Figuur 1: pre-plating van cryopreserved hiPSC-cm voor rijping. A) celverwerking voor pre-plating 1 Injectieflacon van 10 dagen na differentiatie cryopreserved hipsc-CMs. (B) fase contrast beelden van geslaagde (linker) en niet-geslaagde (rechts) hipsc-culturen. Schaal: 275 μm. Zie Video 1 en video 2 voor succesvolle 14 en 24 dagen na differentiatie cultuur voorbeelden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig2.jpg"> Figuur 2: multi well mea Plate Setup en voorbereiding. A) multi well mea plaat Schema's: de plaat bestaat uit 24 putjes (a1 tot en met D6) die elk 12 micro-elektrode arrays en 4 perifere referentie-elektroden bevatten. Elektrode diameter: 30 μm/Inter-elektrode afstand: 300 μm. opnames kunnen tegelijkertijd worden verkregen uit de 288 elektroden. B) sterilisatie-en hydrofiele behandelingsstappen die moeten worden uitgevoerd vóór het beplating van hipsc-cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig3.jpg"> Figuur 3: hiPSC-cm dissociatie en beplating op multi well mea plaat. (A) Schema's van hipsc-cm mea plating voor elke put. B) microscopisch beeld ter illustratie van de correcte plaatsing van de celdruppel die alle 12 elektroden bestrijkt zonder zich te verspreiden naar de 4 referentie-elektroden. C) fase contrast microscopische beelden van een voorbeeldig (links) en suboptimaal (rechts) hipsc-cm PLATTING op mea bij 24 uur na het beplating. Schaalbalk = 275 μm. Zie Video 3 voor het succesvolle voorbeeld van de mea plating. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig4.jpg"> Figuur 4: multi well-screen acquisitie software. Pijlen geven de locatie aan van de belangrijkste functies en functies waarnaar in de tekst wordt verwezen: temperatuurregeling (1) paneel zorgt voor real-time temperatuurbewaking tijdens het experiment. Insert/eject (2) knop Engage en laat de multi well MEA Plate los. Definieer experimentele stroom (3) functie stelt de gebruiker in staat om de duur van de opname in te stellen. Met de functie gegevensverzameling instellen (4) kan de gebruiker de instellingen voor de bemonsteringsfrequentie en het acquisitie filter instellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig5.jpg"> Figuur 5: Hipsc-cm elektroporation en signaal verwerving . Stimulus definition tabblad stelt de gebruiker in staat om de elektroporerende pulsparameters te definiëren. Met het tabblad stimulatie elektroden kan de gebruiker de elektroporerende elektroden selecteren. Elke combinatie van de 288 elektroden kan worden geselecteerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig6.jpg"> Figuur 6: kwaliteitscontrole van multi well MEAs voor elektrische activiteit. Multi well-Screen acquisitie software die onbewerkte gegevensvensters weergeeft met representatieve voorbeelden van optimale (a) en sub-standaard (B) FP-signalen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig7.jpg"> Afbeelding 7: fp-en AP-signalen van de nieuwe en herstelde array. Multi well MEA enzymatische reinigingsstappen (A). Het basislijn signaal van de nieuwe array toont een minimale signaal-ruis verhouding (B) en FP-signalen tonen de elektrische activiteit van het netwerk (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig8.jpg"> Figuur 8: gegevens segmentatie en-analyse. Weergave van het hoofdvenster van GUI voor Waveform-analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig9.jpg"> Figuur 9: gegevens segmentatie en-analyse. Initialiseer de Wave Forms -knop om AP-golfvormen voor segmentatie te identificeren en uit te pakken en om de voorbereidende verwerking te starten door in te zoomen en het actie potentieel gebied te selecteren. Rode cirkels zijn de elektroporation indicatoren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig10.jpg"> Afbeelding 10: segmentatie en analyse van gegevens. Pieken (rode ' x ') en troggen (gele cirkels) worden gedetecteerd voor elke golfvorm en de genormaliseerde APs worden bovenop een kwaliteitscontrole van de golfvormen gelegd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig11.jpg"> Afbeelding 11: AP amplitude afhankelijkheid van het FP-signaal voor meerdere opnames van dezelfde cellocatie. FP amplitude in μV bereiken (a, linksboven paneel) of MV bereiken (a, rechtsboven paneel) opgenomen van twee onafhankelijke elektroden te produceren AP amplitude in MV bereik (a, linker en rechter panelen) tonen geen correlatie tussen FP amplitudes en post-Electroporation AP amplitudes. De genormaliseerde AP-golfvormen voor elke opname worden boven elkaar gelegd, zoals voor elke opname. Meerdere elektroporaties van dezelfde cellocatie bij 0 tot 96 h produceerden hoge kwaliteit AP-golfvormen die het volgen van membraan elektrodynamica mogelijk maken (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig12.jpg"> Afbeelding 12: AP-opnames na zes restauraties. AP golfvormen gelijktijdig opgenomen 10 s post-Electroporation over 12 elektroden uit dezelfde put worden weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig12large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig13.jpg"> Afbeelding 13: APD parameter histogrammen van meerdere restauraties. Distributie percelen voor individuele golfvorm apd30 (A), apd80 (B), driehoeksmeting (apd80— apd30) (C) en fractionele verkorting (apd80— apd30)/(apd80)) (D) worden weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig13large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Aanvullende bestanden. Videos 1-3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/Suppl_Files.zip">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings at JoVE.com

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Dit artikel bevat een set van protocollen voor de ontwikkeling van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hartspier (hipsc-cm) netwerken gekweekt op multi well mea platen om reversibel elektroporate de celmembraan voor actie potentiële metingen. Opnamen met hoge doorvoer worden via dezelfde cellocaties herhaaldelijk over dagen verkregen.

Humane iPSC-afgeleide cardiomyocyte netwerken op multi well micro-elektrode arrays voor terugkerende actie potentiële opnames

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Het volgende protocol beschrijft de ontwikkeling van door de mens geïnduceerde pluripotente cardiomyocytenetwerken op multiwell MEA-platen om de celmembranen omkeerbaar te elektrocriren voor mogelijke metingen. Actie potentiële parameters kunnen vervolgens worden gebruikt om deze responscurven te genereren om verbindingen te testen voor elektrofysiologie. Multiwell MEA codering en celbeplating zijn de meest uitdagende stappen die speciale aandacht nodig hebben.Men moet deze stappen ijverig en snel uitvoeren om te voorkomen dat druppels zich verspreiden en uitdrogen. Met de praktijk, kan dit gemakkelijk worden overwonnen. We ontwikkelden een aangepaste grafische gebruikersinterface voor enkele segmentatie, kwaliteitsborging en parameterextractie.Onze robuuste MATLAB workflow werd geïmplementeerd om snel grote hoeveelheden ruwe experimentele gegevens te reduceren tot een onbevooroordeelde groepering van actiepotentieele golfvormen. Begin met het ontdooien van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten volgens manuscriptrichtingen. Schors de cellen voorzichtig met behulp van een transferpipet om celklontjes te scheiden.Dan zorgvuldig afzien van twee milliliter van cel suspensie in elke put van een substraat gecoate zes-put plaat en plaats de plaat in een cel cultuur incubator op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide. Cellen moeten zich 24 uur lang aan de gelkanaals hechten en spontaan slaan na 48 uur na het beplating. Twee dagen voorafgaand aan beplating toe te voegen 0,5 milliliter van de menselijke iPSC cardiomyocyte cultuur medium aan elke put van een 24-well multi-electrode array, of MEA plaat, en het uitvoeren van een baseline opname om signaal-ruis verhouding te verifiëren als een kwaliteitscontrole van de MEA's.Dan, aspirate de media, spoel de putten met steriel water, en steriliseren onder een UV-licht in een laminaire stroom kap 's nachts. Voeg de volgende dag 0,1 milliliter FBS toe aan elke put voor hydrofiele behandeling van MEA-oppervlakken en broed de plaat 30 minuten op kamertemperatuur. Spoel vervolgens de FBS aan en spoel elke put twee keer met 0,5 milliliter steriel water.Laat de plaat 's nachts drogen in de laminaire stroomkap. Op de volgende dag, pipet vijf microliters van werkende fibronectine verdunning en zorgvuldig afzien van de druppel in het midden van elke put om alle 12 elektroden te dekken. Plaats de plaat onmiddellijk op een verhoogd oppervlak in een bevochtigingskamer met voldoende steriel water om het gehele schaaloppervlak te bedekken.Plaats de kamer met de plaat in de celcultuur incubator voor drie uur en ga dan verder met celbeplating. Wanneer u klaar bent om de cardiomyocyten te bord, past u de celdichtheid aan op 6.000 cellen per microliter door ze te verdunnen in het menselijke iPSC cardiomyocyten ontdooiend medium. Gebruik voorzichtig flicking om de cellen te houden van sedimentering.Breng de MEA-plaat in de laminaire stroomkap en verwijder de fibronectinedruppel voorzichtig met een P10 pipet zonder de elektroden aan te raken. Onmiddellijk afzien van een vijf-microliter celdruppeltje naar het midden van de put ervoor te zorgen dat alle 12 elektroden te dekken. Doe dit een goed op een moment om fibronectin te voorkomen dat drogen.Wanneer u klaar bent met beplating, plaats de MEA-plaat terug in de losbedekte bevochtigingskamer en breng deze drie uur terug naar de couveuse van de celkweek. Gebruik na de incubatie een P200 pipet om zorgvuldig 200 microliters van menselijke iPSC cardiomyocyten ontdooiend medium toe te voegen aan elke put zonder de cellen te storen. Plaats de MEA plaat terug in de celcultuur incubator en vervang cultuur medium 24 uur na beplating.Wanneer klaar om signaal van de cardiomyocyten te verwerven, initiëren van de overname software en voeg de MEA plaat volgens manuscript aanwijzingen. Klik op de knop Verkennen om het signaal in alle putten te visualiseren en de signaalkwaliteit in steady state omstandigheden te verifiëren. Maak aantekeningen over elektroden met veldpotentieel, of FP, signalen in het millivolt bereik.Klik vervolgens op dezelfde knop om de verkenning te stoppen. Tot op dit punt zijn er geen gegevens geregistreerd. Klik op de knop Ga om te beginnen met opnemen.De elektroden in elke put tonen FP-signalen in het ruwe gegevensvenster. Na 30 seconden opnemen klikt u op de knop Stimuleren en laat u elektroporatie gedurende 30 seconden op de geselecteerde locaties plaatsvinden. Klik vervolgens op dezelfde knop om de simulatie te stoppen en 60 seconden door te gaan met opnemen.Gebruik de matlab-gebaseerde aangepaste software om verschillende veldpotentieel en actiepotentieelparameters te segmenteren en te extraheren. Voer eerst de golfanalysecode uit en klik op Bestand en selecteer Process.h5. Zoek en selecteer de eerder gemaakte mwd.h5-bestand. Klik op de knop Map opslaan om de opslaglocatie van de uitvoerbestanden te wijzigen. Maak vervolgens een wachtrij voor signaalverwerking door de elektrode en goed combinaties van interesse te selecteren en vervolgens op de knop Wachtrij te klikken.Herhaal deze stap om meer elektrode en goed combinaties toe te voegen aan de wachtrij. Als cellen zijn behandeld met drugs, kan de wachtrij worden bewerkt door direct op Med Name, Med Concentration te klikken. Zodra de wachtrij is afgerond, klikt u op de knop Waveforms initialiseren, waarmee de voorlopige verwerking wordt gestart waarbij de signalen worden geïdentificeerd en geëxtraheerd voor segmentatie.Wanneer de verwerking is voltooid, klikt u op de knop Inzoomen en selecteert u het actiepotentieel of het AP-interessegebied. Klik op de knop Houden en bekijk de deelvensters. De pieken en dalen worden gedetecteerd voor elke golfvorm, en de genormaliseerde AP's worden bovenop.Als u klaar bent, klikt u op de knop Houden om door te gaan naar het volgende spoor in de wachtrij en herhaal het proces voor de rest van de elektrode en goed combinatiesignalen. De levensvatbaarheid en beplatingsdichtheid van de post-ontdooide cardiomyocyten is van cruciaal belang voor de multiwell MEA-cultuur. Een goede beplating resulteert in een gezonde monolaagcultuur met spontane afstraffing na 48 uur, terwijl slechte celrendheid resulteert in culturen met een hoog percentage niet-myocytenpopulaties.Celdruppeldispersie beïnvloedt de cultuurdichtheid en kan zelfs leiden tot celdood, dus nauwkeurige celplaatsing is belangrijk. De cellen gekweekt op MEA's worden onderworpen aan een kwaliteitscontrole voor elektrische activiteit 48 uur na beplating. Als 50% van de elektroden binnen een netwerk en 70% van de totale netwerken geen FP-signalen produceren, dan is de cultuur suboptimaal.Elektroporatie gemedieerde AP-opnames kunnen meerdere keren 48 uur na MEA-beplating worden verkregen. Meerdere elektroporities van dezelfde cellocatie op nul, 24, 48, 72 en 96 uur hebben na verloop van tijd geen significant effect op de AP-vorm. Bovendien is er geen correlatie waargenomen tussen FP en post elektroporatie AP amplitudes van dezelfde celsite.Een belangrijk voordeel van deze methode is dat de multiwell MEA plaat meerdere keren hergebruikt kan worden. Om de betrouwbaarheid van deze array aan te tonen, worden 3, 815 AP-golfvormen uit drie herstelbatches getrokken en worden AP-duurgegevens geëxtraheerd om de herhaalbaarheid van de resultaten te onderzoeken. Wanneer van belang, is het mogelijk om extra testen uit te voeren, zoals genexpressie, calcium voorbijgaande metingen en patch klem om het gedrag van specifieke ionische stromen te onderzoeken.Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers om elektrofysiologische rijping te verbeteren en om chronische dosiseffecten op cardiomyocyten te screenen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plasma Lithografie Surface Patterning voor de schepping van Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Massa Cytometry: Protocol voor dagelijks Tuning en Running Cell Samples op een CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Analyse van buisvormig membraan Netwerken in hartspiercellen van boezems en kamers

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Afsluitbare Femtoliter Kamer Arrays voor Celvrije Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Gemakkelijk en nauwkeurig voor mechanische profilering op MicroPOST Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Gestandaardiseerde en schaalbare assay voor het bestuderen van Perfused 3D-angiogene kiemen van door iPSC afgeleide endotheliale cellen in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Multi-Component Lipid Nanotube Networks fabriceren met behulp van de Gliding Kinesin Motility Assay

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Fabricage van 3D cardiale microtissue arrays met behulp van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...