Name: human ipsc-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings
Uploaded: 2019-07-15T14:00:00
Duration: 8 min 53 s
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कोई नहीं

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

इन वर्षों में एमईए का प्रयोग उनके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों का अध्ययन करनेके लिए उत्तेजक कोशिकाओं के एफपी मापन को करने तक सीमित रहा है 36,37,38,39. केवल कुछ समूहों ने कस्टम एमईए आधारित प्रौद्योगिकी18,29,30का उपयोग करके इलेक्ट्रोजेनिक कोशिकाओं से एपी निशानों की सूचना दी है . तथापि, इन्हीं तैयारियों से बार-बार रिकॉर्डिंग करने के लिए इन तरीकों की जांच नहीं की गई है। हम एक साथ कई HIPSC-CM नेटवर्क में दिन में एक ही सेल साइट से एपीएस का अध्ययन करने के लिए एक अभिनव और सटीक पद्धति विकसितकी 3. हमारे प्रकाशित अध्ययन में, एक multiwell सूक्ष्म सोने विदेश गया मंच उच्च परिशुद्धता के साथ hiPSC-सीएम संस्कृतियों के कई बैचों से एपी तरंग पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया गया था और 1 के एक अस्थायी संकल्प के साथ. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल उच्च throughput एपी रिकॉर्डिंग के लिए syncytial मुख्यमंत्री नेटवर्क के कुशल विकास के लिए सरणी पर hiPSC-सीएम के बीज की व्याख्या करता है. प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) क्रायोप्रेक्षण बैंकिंग के लिए गुणवत्ता नियंत्रित मुख्यमंत्री के कई उच्च शुद्धता बैचों का उत्पादन, 2) पूर्व चढ़ाना और परिपक्वता के लिए अत्यधिक व्यवहार्य पोस्ट-थॉव सीएम, 3) मुख्यमंत्री के लिए multiwell MEA प्लेट के उपचार सीडिंग, 4) HIPSC-सीएम संस्कृति विभाजन 30 दिनों के बाद MEA चढ़ाना के लिए भेदभाव, और 5) कई पुन: उपयोग के लिए MEAs की बहाली.
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि HIPSC भेदभाव में बैच-टू-बैच भिन्नता प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकती है। विभेद की मोनोलेयर विधि को उच्च प्रतिशत कार्डियोमायोसाइट उत्पादन3,40के लिए घर में अनुकूलित किया गया था . हमारी संस्कृतियों के MLC2v और TNNT2 मार्करों के FACS विश्लेषण एक $90% वेंट्रिकुलर की तरह phenotype3प्रदर्शित करता है. इन गुणवत्ता नियंत्रित संस्कृतियों प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए cryopreserved हैं. वर्तमान विभेदन दृष्टिकोण नोडल के एक विषम मिश्रण उपज- एट्रियल - और निलय की तरह कोशिकाओं3,16,17,41. इसलिए, मुख्यमंत्री उपप्रकार जनसंख्या संवर्धन के लिए नियोजित रणनीतियों आगे संस्कृतियों की विशिष्टता में सुधार कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण उनकी परिपक्वता बढ़ाने के लिए नियोजित किया जा सकता है. यहां प्रस्तावित तरीकों को अन्य मुख्यमंत्री स्रोतों के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है।
एमई का उपयोग कर दर्ज की गई एपी waveforms ऑप्टिकल मानचित्रण42,43, पूरक धातु ऑक्साइड अर्धचालक आधारित एमई 18,21, और नकली एपी द्वारा कार्डियोमायोसाइट्स के नेटवर्क से दर्ज उन लोगों के समान थे FP रिकॉर्डिंग20का उपयोग कर | MEA Hai और Spira25 के माध्यम से एपी माप के तंत्र को संबोधित करने के लिए प्रदर्शन किया है कि इलेक्ट्रोपोर-इलेक्ट्रोड इंटरफ़ेस स्थापित तेज ग्लास microelectrode तकनीक की नकल. हालांकि, हमारे अध्ययन में आराम झिल्ली क्षमता और सही आयाम मूल्यों को यह देखते हुए स्थापित नहीं किया जा सकता है कि विदेश में विद्युतमंडल-इलेक्ट्रोड इंटरफ़ेस calibrated नहीं है, और आयाम संवेदनशीलता और संकल्प का एक समारोह है तकनीक. हमारे दृष्टिकोण ऑप्टिकल मानचित्रण के लिए इसी तरह की सीमाओं के शेयरों जब यह एपी आयाम की बात आती है.
मल्टीवेल एमईए-आधारित एफपी/एपी readouts यहाँ दवा सुरक्षा आकलन के लिए नई संभावनाएं खुली सूचना दी. हालांकि सहज, इन HIPSC-CM monolayers लगातार दरों पर हराया. एकाधिक नेटवर्कों में APD पैरामीटरों का विश्लेषण विद्युत विषमता पर अंतर्दृष्टि प्रदान करता है (चित्र 13)। तथापि, व्यापक एपीडी पुनरास्थापन विश्लेषणों में पूर्ववर्ती डायस्टोलिक अंतरालों को शामिल किया जाना चाहिए। इसके अलावा, 96 एच से अधिक एक ही सेल साइट से दर्ज उच्च गुणवत्ता वाले एपी तरंग रूपों (चित्र 11ख) समय के साथ झिल्ली इलेक्ट्रोडायनामिक्स को ट्रैक करने के लिए पहली रिपोर्ट है जो विकास और रोग में मूल्य की होगी।
एपी पैरामीटर की मात्रा निर्धारित करने के लिए यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल यौगिकों का परीक्षण करने के लिए खुराक प्रतिक्रिया घटता उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. के रूप में हालही में एडवर्ड्स एट अल 3 द्वारा रिपोर्ट, norepinephrine की खुराक प्रतिक्रिया, आइसोप्रोटेरेनॉल और ई 4031 विभिन्न पुनर्करण चरणों में APD के लिए साजिश रची हैं. प्रकाशित अध्ययन सटीकता और वास्तविक समय में एपी waveforms में खुराक पर निर्भर सूक्ष्म परिवर्तन की पहचान के लिए दृष्टिकोण की विश्वसनीयता का प्रदर्शन किया. इस तकनीक को आसानी से विभिन्न electrophysiological प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए अन्य यौगिकों या छोटे अणु पुस्तकालयों के लिए बढ़ाया जा सकता है.
इस अध्ययन में प्रस्तुत एपी माप के लिए विदेश राज्य अमेरिका आधारित दृष्टिकोण न केवल इलेक्ट्रोफिजियोलोजिस्ट के लिए बल्कि सेल जीवविज्ञानियों और इन-सिलिको मॉडलर्स के लिए भी ब्याज की होगी। इसके अलावा, HIPSC-सीएम पर एक ही सेल साइट से FP/AP रिकॉर्डिंग शोधकर्ताओं को समय की एक छोटी अवधि के भीतर उत्तेजक सेलुलर नेटवर्क की विस्तृत सरणी की bioelectric डेटा पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए सक्षम हो जाएगा. इन संसाधनों की उपलब्धता दवा खोजों और रोग मॉडलिंग के लिए मूल्यवान होगी।

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (HIPSC-सीएम) प्रयोगशालाओं की बढ़ती संख्या के लिए सोने के मानक हैं1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. भ्रूणीय शरीर11,12,13 और एकपरत3,7,10,11,12, 13,14,15,16,17 विभेदन कार्डियोमायोसाइट उत्पादन के लिए पसंदीदा तरीके हैं और बहुइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) एक आम मोडलिटी बन गई है इन नेटवर्कों की विद्युत गतिकी की निगरानी के लिए18,19,20. जबकि पैरामीटर है कि क्षेत्र क्षमता से निकाला जा सकता है (FPs) इस तरह की धड़कन दर के रूप में, आयाम, अवधि और आरआर अंतराल स्वतः पिटाई monolayers18,21की आधारभूत electrophysiological प्रतिक्रियाओं रहे हैं 22,23, इन extracellular FP संकेतों के अंतर्निहित कार्रवाई क्षमता (एपी) घटकों24extrapolate करने के लिए मुश्किल है . प्रत्यक्ष आवर्तक एपी माप के लिए MEAs के एक आवेदन की खोज पर हमारे हाल ही में प्रकाशन कई भर में विभिन्न repolarization चरणों में एक व्यापक तरंग विश्लेषण के साथ अनुकरणीय intracellular एपी readouts के लिए पद्धति का सबूत प्रदान करता है HIPSC व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट नेटवर्क3के बैचों | अध्ययन में हमने दिखा दिया कि HIPSC व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के नेटवर्क के लिए इलेक्ट्रोपोरेटिंग दालों की डिलीवरी एपी रिकॉर्डिंग के लिए इंट्रासेल्यूलर एक्सेस सक्षम बनाता है। येक्षणिक एपी रिकॉर्डिंग चोट स्थल3,25,26के माध्यम से देखी गई ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता वसूलियों पर निर्भर हैं . हमारे अध्ययन में विदेश भेजने और पैच-क्लैम्प के माध्यम से दर्ज वेवफॉर्म्स ने इसी प्रकार के एपी मॉर्फोलोजी को दिखाया जिससे दृष्टिकोण3की विश्वसनीयता मान्य होती है।
कुछ प्रयोगशालाओं ने कस्टम निर्मित एमईएएस18,21,26,27,28,29का उपयोग करके विभिन्न विद्युतजनित कोशिकाओं से ए पी को मापने की सूचना दी है, 30, लेकिन लगातार और आवर्तक एपी माप के लिए MEAs का उपयोग करने की विश्वसनीयता का मूल्यांकन नहीं किया गया था. वर्तमान में, सोने के मानक पैच-क्लैम्प तकनीक टर्मिनल रिकॉर्डिंग करने के लिए सीमित है7,31 जबकि, एमईए आधारित एपी माप क्षणिक हैं और इसलिए एक ही सेल पर कई बार आयोजित किया जा सकता है. हम यह भी बताते हैं कि एक आसानी से कम से कम फ़िल्टरिंग की आवश्यकता होती है millivolt रेंज में उच्च गुणवत्ता वाले एपी संकेतों को रिकॉर्ड कर सकते हैं. इसलिए शोधकर्ता एमईएएस का उपयोग करते हुए एक ही तैयारी में न केवल तीव्र बल्कि पुरानी दवा अध्ययन भी कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, यह तकनीक कम समय में एक साथ एफपी/एपी माप उत्पन्न करने की अनुमति देती है। अतालता भविष्यवाणी और दवा संबद्ध कार्डियोटॉक्सिसिटी पर बढ़ते जोर को देखते हुए24,32,33,34,35, एपी माप के एकीकरण दृष्टिकोण दवा सुरक्षा और प्रभावकारिता आकलन में वृद्धि होगी.
यहाँ, हम 1) परिपक्वता के लिए cryopreserved HIPSC-सीएम के पूर्व चढ़ाना, 2) multiwell MEAs पर HIPSC-सीएम के विघटन और चढ़ाना, 3) HIPSC-CM नेटवर्क से FPs और APs की रिकॉर्डिंग, 4) विभाजन और विश्लेषण के लिए डेटा निकालने, और 5) एकाधिक पुन: उपयोग के लिए सरणियों को पुनर्स्थापित करना. हर कदम जहाँ भी प्रासंगिक महत्वपूर्ण कदम पर बल देने अनुकूलित किया गया है. सेल लगाव के लिए आवश्यकताओं को सुनिश्चित करने के लिए एक पिटाई syncytial monolayer चर्चा कर रहे हैं और दोहराव electrophysiological अध्ययन के लिए multiwell MEA बहाली के लिए प्रक्रियाओं की व्याख्या कर रहे हैं. अंत में, प्रयोगशाला में विकसित एक कस्टम जीयूआई एपी संकेत निष्कर्षण, गुणवत्ता आश्वासन, और विभाजन कार्यप्रवाह के लिए प्रस्तुत किया है परिमाण और एपी मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>Multiwell-Screen v 1.9.2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>CM media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Converter software</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MultiChannel DataManager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007103HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1413202</td>
			<td>coating substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface board</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell MEA Plate</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>24W300/30G-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>CM base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terg-a-zyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z273287-1EA</td>
			<td>enzymatic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes, individually wrapped</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1371148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure sterile water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue-culture treated plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human ipsc-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings

कार्डिएक सुरक्षा स्क्रीनिंग दवा की खोज और चिकित्सकीय के लिए सर्वोपरि महत्व का है। इसलिए, HIPSC व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट (HIPSC-सीएम) की तैयारी के लिए उपन्यास उच्च-थ्रूपुट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण का विकास कुशल दवा परीक्षण के लिए बहुत आवश्यक है। हालांकि multielectrode सरणियां (MEAs) अक्सर उत्तेजक कोशिकाओं के क्षेत्र संभावित माप के लिए कार्यरत हैं, जोशी-मुखर्जी और उनके सहयोगियों द्वारा हाल ही में एक प्रकाशन वर्णित है और आवर्तक कार्रवाई क्षमता (एपी) रिकॉर्डिंग के लिए अपने आवेदन मान्य एक ही hiPSC-सीएम की तैयारी से दिन में. यहाँ उद्देश्य के लिए मुख्य चिकित्सा बीज बोने के लिए विस्तृत कदम दर कदम तरीकों प्रदान करने के लिए और उच्च परिशुद्धता और 1 डिग्री के एक अस्थायी संकल्प के साथ इलेक्ट्रोपोट्रेशन के माध्यम से एपी waveforms को मापने के लिए है. यह दृष्टिकोण विश्वसनीय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल जांच के लिए उच्च-थ्रूपुट एपी माप के लिए इंट्रासेल्यूलर पहुँच प्राप्त करने के लिए उपयोग में आसान पद्धति की कमी को संबोधित करता है। मल्टीवेल एमईए प्लेटों पर HIPSC-सीएम के चढ़ाना के लिए एक विस्तृत कार्य प्रवाह और तरीकों पर चर्चा की जाती है जहां भी प्रासंगिक महत्वपूर्ण कदमों पर बल दिया जाता है। इसके अलावा, तेजी से डेटा हैंडलिंग, निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए एक कस्टम निर्मित MATLAB स्क्रिप्ट में फंसा विभिन्न एपी अवधि मानकों के लिए आकृति विज्ञान में सूक्ष्म अंतर की मात्रा निर्धारित करने के लिए तरंग विश्लेषण की व्यापक जांच के लिए रिपोर्ट की है अतालता और कार्डियोटॉक्सिसिटी।

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Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

इस लेख में मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomycyte (HIPSC-CM) नेटवर्क के विकास के लिए प्रोटोकॉल का एक सेट शामिल है बहुवेल MEA प्लेटों पर सुसंस्कृत कार्रवाई संभावित माप के लिए सेल झिल्ली reversibly electroporate करने के लिए. उच्च-थ्रूपुट रिकॉर्डिंग्स एक ही सेल साइटों से दिनों-बार प्राप्त की जाती हैं।

बार-बार कार्रवाई की क्षमता वाली रिकॉर्डिंग के लिए मल्टीवेल माइक्रो-इलेक्ट्रोड ऐरे पर मानव iPSC-Derived Cardiomycye नेटवर्क

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

निम्नलिखित प्रोटोकॉल मल्टीवेल एमईए प्लेटों पर मानव-प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट नेटवर्क के विकास का वर्णन करता है ताकि कार्रवाई संभावित मापों के लिए सेल झिल्ली को फिर से इलेक्ट्रोपोरेट किया जा सके। विद्युतभौतिकी के लिए यौगिकों का परीक्षण करने के लिए उन प्रतिक्रिया घटता उत्पन्न करने के लिए कार्रवाई संभावित मापदंडों का उपयोग किया जा सकता है। मल्टीवेल विदेश मंत्रालय कोडिंग और सेल चढ़ाना सबसे चुनौतीपूर्ण कदम है कि विशेष ध्यान देने की जरूरत है ।बूंदों को फैलने और सूखने से रोकने के लिए इन कदमों को लगन और तेजी से करना चाहिए । अभ्यास के साथ, यह आसानी से दूर किया जा सकता है। हमने एकल विभाजन, गुणवत्ता आश्वासन और पैरामीटर निष्कर्षण के लिए एक कस्टम ग्राफिकल यूजर इंटरफेस विकसित किया है।हमारे मजबूत MATLAB कार्यप्रवाह तेजी से कार्रवाई संभावित तरंग रूपों के एक निष्पक्ष समूह में कच्चे प्रयोगात्मक डेटा की बड़ी मात्रा को कम करने के लिए लागू किया गया था । पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार मानव-प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स विगलन द्वारा शुरू करें। सेल झुरमुट को अलग करने के लिए स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को धीरे-धीरे निलंबित करें।फिर ध्यान से एक सब्सट्रेट-लेपित छह-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के दो मिलीलीटर वितरित करें और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें। कोशिकाओं को 24 घंटे तक जेल ट्रैक्ट का पालन करना चाहिए और चढ़ाना के बाद 48 घंटे में अनायास हरा देना चाहिए। चढ़ाना करने से दो दिन पहले मानव आईपीएससी कार्डियोमायोसाइट संस्कृति माध्यम के 0.5 मिलीलीटर को 24-अच्छी तरह से बहु-इलेक्ट्रोड सरणी, या विदेश मंत्रालय प्लेट के प्रत्येक कुएं में जोड़ें, और एमईए की गुणवत्ता जांच के रूप में सिग्नल-टू-शोर अनुपात को सत्यापित करने के लिए एक बेसलाइन रिकॉर्डिंग करें।फिर, मीडिया को आकांक्षी करें, बाँझ पानी से कुओं को कुल्ला करें, और रात भर एक लैमिनार प्रवाह हुड में एक यूवी प्रकाश के नीचे बंध्याकरण करें। अगले दिन, विदेश मंत्रालय की सतहों के हाइड्रोफिलिक उपचार के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से एफबीएस के 0.1 मिलीलीटर जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट को इनक्यूबेट करें। फिर एफबीएस को एस्पिरेट करें, और प्रत्येक अच्छी तरह से दो बार बाँझ पानी के 0.5 मिलीलीटर के साथ कुल्ला करें।थाली को रात भर लैमिनार प्रवाह हुड में सूखने के लिए छोड़ दें। अगले दिन, काम करने वाले फाइब्रोनेक्टिन कमजोर पड़ने के पांच माइक्रोलीटर पिपेट करें और सभी 12 इलेक्ट्रोड को कवर करने के लिए प्रत्येक कुएं के केंद्र में बूंद को सावधानी से वितरित करें। तुरंत एक आर्द्रता कक्ष के अंदर एक उठाया सतह पर थाली जगह पर्याप्त बाँझ पानी युक्त पूरे पकवान सतह को कवर करने के लिए ।कक्ष को तीन घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में प्लेट के साथ रखें और फिर सेल प्लेटिंग के साथ आगे बढ़ें। कार्डियोमायोसाइट्स को प्लेट करने के लिए तैयार होने पर, कोशिका घनत्व को मानव आईपीएससी कार्डियोमायोसाइट विगलन माध्यम में पतला करके माइक्रोलीटर प्रति माइक्रोलीटर 6, 000 कोशिकाओं में समायोजित करें। कोशिकाओं को तलछट से रखने के लिए कोमल फ्लिकिंग का उपयोग करें।विदेश मंत्रालय की प्लेट को लैमिनार फ्लो हुड में लाएं और इलेक्ट्रोड को छुए बिना पी10 पिपेट के साथ फाइब्रोनेक्टिन ड्रॉप को सावधानी से हटा दें। तुरंत सभी 12 इलेक्ट्रोड को कवर करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से के केंद्र में एक पांच माइक्रोलिटर सेल बूंद बांटना । फाइब्रोनेक्टिन को सूखने से रोकने के लिए एक समय में इसे अच्छी तरह से करें।जब चढ़ाना समाप्त हो, विदेश मंत्रालय प्लेट शिथिल कवर humidifying कक्ष में वापस जगह है और यह तीन घंटे के लिए सेल संस्कृति इनक्यूबेटर को वापस । इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को परेशान किए बिना प्रत्येक अच्छी तरह से मानव आईपीएससी कार्डियोमायोसाइट विगलन माध्यम के 200 माइक्रोलीटर को ध्यान से जोड़ने के लिए P200 पिपेट का उपयोग करें। विदेश मंत्रालय प्लेट को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस रखें और चढ़ाना के 24 घंटे बाद कल्चर मीडियम की जगह लें ।कार्डियोमायोसाइट्स से सिग्नल प्राप्त करने के लिए तैयार होने पर, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करें और पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार विदेश मंत्रालय प्लेट डालें। सभी कुओं में सिग्नल की कल्पना करने और स्थिर राज्य की स्थिति में सिग्नल की गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए एक्सप्लोर बटन पर क्लिक करें। मिलिवोल्ट रेंज में फील्ड क्षमता, या एफपी, सिग्नल के साथ इलेक्ट्रोड पर नोट्स लें।इसके बाद एक्सप्लोरेशन को रोकने के लिए उसी बटन पर क्लिक करें। इस बिंदु तक कोई डेटा दर्ज नहीं किया गया है। रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए गो बटन पर क्लिक करें।प्रत्येक कुएं में इलेक्ट्रोड कच्चे डेटा विंडो में एफपी सिग्नल दिखाएगा। रिकॉर्डिंग के 30 सेकंड के बाद, उत्तेजित बटन पर क्लिक करें और 30 सेकंड के लिए चयनित साइटों पर इलेक्ट्रोपॉशन होने दें। फिर सिमुलेशन को रोकने के लिए उसी बटन पर क्लिक करें और 60 सेकंड तक रिकॉर्डिंग जारी रखें।विभिन्न क्षेत्र क्षमता और कार्रवाई संभावित डेटा मापदंडों को सेगमेंट और निकालने के लिए मैटलैब-आधारित कस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। सबसे पहले, वेवफॉर्म एनालिसिस कोड चलाएं और फाइल पर क्लिक करें और प्रोसेस.एच5 का चयन करें। पहले बनाए गए एमडब्ल्यूडी को ढूंढें और चुनें।h5 फ़ाइल। आउटपुट फ़ाइलों के स्टोरेज स्थान को बदलने के लिए सेव डायरेक्टरी बटन पर क्लिक करें। इसके बाद इलेक्ट्रोड और ब्याज के अच्छे संयोजन का चयन करके और फिर क्यू बटन पर क्लिक करके एक सिग्नल प्रोसेसिंग क्यू बनाएं।कतार में अधिक इलेक्ट्रोड और अच्छी तरह से संयोजन जोड़ने के लिए इस चरण को दोहराएं। यदि कोशिकाओं को दवाओं के साथ इलाज किया गया, तो क्यू को मेड नेम, मेड एकाग्रता पर सीधे क्लिक करके संपादित किया जा सकता है। एक बार कतार को अंतिम रूप दे दिए जाने के बाद, प्रारंभिक तरंग बटन पर क्लिक करें, जो प्रारंभिक प्रसंस्करण शुरू करेगा जहां संकेतों की पहचान की जाती है और विभाजन के लिए निकाला जाता है।जब प्रसंस्करण समाप्त हो जाता है, तो ज़ूम इन बटन पर क्लिक करें, और कार्रवाई क्षमता, या एपी, ब्याज के क्षेत्र का चयन करें। रखें बटन पर क्लिक करें, और पैनलों की समीक्षा करें। चोटियों और गर्त हर तरंग के लिए पता लगाया जाता है, और सामान्यीकृत एपीएस आरोपित हैं।समाप्त होने पर, कतार में अगले ट्रेस पर जाने के लिए रखें बटन पर क्लिक करें, और बाकी इलेक्ट्रोड और अच्छी तरह से संयोजन संकेतों के लिए प्रक्रिया दोहराएं। मल्टीवेल विदेश मंत्रालय संस्कृति के लिए पोस्ट-गल कार्डियोमायोसाइट्स की व्यवहार्यता और चढ़ाना घनत्व महत्वपूर्ण है। उचित चढ़ाना ४८ घंटे में सहज पिटाई के साथ एक स्वस्थ मोनोलेयर संस्कृति में परिणाम है, जबकि गरीब सेल व्यवहार्यता गैर myocyte आबादी का एक उच्च प्रतिशत के साथ संस्कृतियों में परिणाम है ।सेल ड्रॉपलेट फैलाव संस्कृति घनत्व को प्रभावित करता है और यहां तक कि सेल मौत का कारण बन सकता है, इसलिए सटीक सेल प्लेसमेंट महत्वपूर्ण है। MEAs पर सुसंस्कृत कोशिकाओं चढ़ाना के बाद ४८ घंटे बिजली की गतिविधि के लिए एक गुणवत्ता की जांच के अधीन हैं । यदि एक नेटवर्क के भीतर इलेक्ट्रोड का 50%और कुल नेटवर्क का 70% एफपी संकेतों का उत्पादन नहीं करता है, तो संस्कृति उप-ोप्टिमल है।इलेक्ट्रोपाउशन मध्यस्थता एपी रिकॉर्डिंग कई बार प्राप्त किया जा सकता है ४८ घंटे के बाद विदेश मंत्रालय चढ़ाना । शून्य, 24, 48, 72 और 96 घंटे में एक ही सेल साइट के कई इलेक्ट्रोपाउंसन का समय के साथ एपी आकार पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ता है। इसके अतिरिक्त, एक ही सेल साइट से एफपी और पोस्ट इलेक्ट्रोप्यूशन एपी आयामों के बीच कोई संबंध नहीं देखा गया है।इस विधि का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि मल्टीवेल विदेश मंत्रालय प्लेट को कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है। इस सरणी की विश्वसनीयता प्रदर्शित करने के लिए, 3, 815 एपी तरंग तीन बहाली बैचों से खींचे जाते हैं, और परिणामों की पुनरावृत्ति की जांच करने के लिए एपी अवधि डेटा निकाला जाता है। जब ब्याज की, यह इस तरह के जीन अभिव्यक्ति, कैल्शियम क्षणिक माप और पैच क्लैंप के रूप में विशिष्ट आयनिक धाराओं के व्यवहार की जांच करने के लिए अतिरिक्त परख, प्रदर्शन करने के लिए संभव है ।यह तकनीक शोधकर्ताओं के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल परिपक्वता बढ़ाने के साथ-साथ कार्डियोमायोसाइट्स पर क्रोनिक डोज इफेक्ट को स्क्रीन करने का मार्ग प्रशस्त करती है ।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

मानव iPSC-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स, कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग करके 3 डी कार्डियक माइक्रोटिश्यू सरणियों का निर्माण

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में एकल सेल ऑप्टिकल एक्शन संभावित माप

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...