Name: human ipsc-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings
Uploaded: 2019-07-15T14:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings at JoVE.com

Ни один

Авторам нечего раскрывать.

На протяжении многих лет применение МСП ограничивалось проведением измерений FP возбудимых клеток для изучения их электрофизиологических свойств36,37,38,39. Лишь несколько групп сообщили AP следы от электрогенных клеток с использованием пользовательских MEA на основе технологии18,29,30. Однако эти подходы не были исследованы на предмет повторных записей из одних и тех же препаратов. Мы разработали инновационную и точную методологию для изучения APs с одного и того же сайта ячейки в течение нескольких дней в нескольких сетях hiPSC-CM одновременно3. В нашем опубликованном исследовании, многовелл микро-золото MEA платформа была использована для создания AP волновой библиотеки из нескольких партий hiPSC-CM культур с высокой точностью и с временным разрешением 1 х. Описанный здесь протокол объясняет посев hiPSC-CMs на массиве для эффективного развития синцитиальных сетей CM для высокопроизводительных записей AP. Несколько критических шагов в протоколе: 1) производство нескольких высокой чистоты партий качества контролируемых CMs для криоконсервации банковской, 2) весьма жизнеспособным после оттепели CMs для предварительного покрытия и созревания, 3) лечение многоскважины MEA пластины для CM посева, 4) hiPSC-CM культуры диссоциации на 30 дней после дифференциации для MEA покрытие, и 5) восстановление MEAs для многократного повторного использования.
Важно отметить, что разновидность пакетных партий в дифференциации hiPSC может повлиять на экспериментальные результаты. Монослойный метод дифференциации был оптимизирован в доме длявысокопроцентного производства кардиомиоцитов 3,40. Анализ FACS маркеров MLC2v и TNNT2 наших культур демонстрирует 90% желудочково-подобный фенотип3. Эти контролируемые качеством культуры криоконсервированы для экспериментальных исследований. Нынешние подходы дифференциации дают неоднородную смесь узловых, предсердий и желудочков, как клетки3,16,17,41. Таким образом, стратегии, используемые для обогащения популяции подтипа СМ, могут еще больше улучшить специфику культур. Кроме того, для повышения их созревания могут быть использованы подходы к тканевой инженерии. Предложенные здесь методы могут быть легко реализованы для других источников CM.
Волны AP, записанные с помощью MEA, были аналогичны тем, которые были записаны в сетях кардиомиоцитов оптическим картированием42,43, дополнительными оксидами металла полупроводниковой основе MEA18,21, и смоделированные AP с помощью записей FP20. Для решения механизма измерений AP через MEA Hai и Spira25 продемонстрировали, что электропор-электродный интерфейс имитирует установленную острое стекло микроэлектродной техники. Тем не менее, потенциал мембраны покоя и истинные значения амплитуды в нашем исследовании не могут быть установлены, учитывая, что электропор-электродный интерфейс в системах МЦа не откалиброван, и что амплитуда является функцией чувствительности и разрешения Техника. Наш подход разделяет аналогичные ограничения оптического картирования, когда дело доходит до амплитуды AP.
Многофункциональные MEA основе FP / AP чтения сообщили здесь открыть новые возможности для оценки безопасности лекарственных средств. Хотя спонтанно, эти hiPSC-CM монослой бить с постоянной скоростью. Анализ параметров APD в нескольких сетях дает представление об электрической неоднородности(рисунок 13). Тем не менее, всеобъемлющий анализ реституции APD должен включать предыдущие диастолические интервалы. Кроме того, высококачественные волны AP, зарегистрированные с того же места клеток более 96 ч(рисунок 11B) является первым докладом для отслеживания мембранной электродинамики с течением времени, которые будут значения в развитии и в болезни.
Протокол, описанный здесь для количественной оценки параметров AP, может быть использован для генерации кривых реакции дозы для тестирования соединений. Как недавно сообщили Эдвардс и др.3, доза ответ норадреналина, изопротеренола и E 4031 построены для APD на различных фазах реполяризации. Опубликованное исследование продемонстрировал точность и надежность подхода к выявлению зависящих доза тонких изменений в волнах AP в режиме реального времени. Этот метод может быть легко расширен для других соединений или небольших библиотек молекул для понимания различных электрофизиологических реакций.
MeA основанный подход для измерений AP, представленный в этом исследовании, будет интересен не только электрофизиологам, но и клеточным биологам и модельерам в силико. Кроме того, записи FP/AP с одного и того же сайта клеток на hiPSC-CMs позволят исследователям в течение короткого периода времени создавать биоэлектрические библиотеки данных широкого спектра возбудимых сотовых сетей. Наличие этих ресурсов будет иметь важное значение для обнаружения наркотиков и моделирования заболеваний.

Человеческие индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты стволовой клетки (hiPSC-CMs)являются золотым стандартом для все большего числа лабораторий 1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Избиение эмбриональных тел11,12,13 и монослой3,7,10,11,12, 13,14,15,16,17 дифференциации являются предпочтительными методами для производства кардиомиоцитов и мультиэлектродный массив (MEA) стал общим модальностью для мониторинга электродинамики этих сетей18,19,20. В то время как параметры, которые могут быть извлечены из полевых потенциалов (FPs), таких как скорость избиения, амплитуда, продолжительность и интервалы RR являются базовыми электрофизиологическими реакциями спонтанно избиение монослой18,21, 22,23, действия потенциал (AP) компонентов, лежащих в основе этих внеклеточных сигналов FP трудно экстраполировать24. Наша недавняя публикация об открытии применения MEAs для прямых периодических измерений AP является доказательством методологии для образцовых внутриклеточных AP с помощью обширного анализа волн на различных фазах реполяризации по нескольким партии hiPSC полученных кардиомиоцитов сетей3. В исследовании мы показали, что доставка электропоравливых импульсов в сети кардиомиоцитов, полученных из hiPSC, обеспечивает внутриклеточный доступ к записям AP. Эти переходные записи AP зависят от трансмембранных потенциальных восстановления наблюдается через травмы сайте3,25,26. Waveforms, записанные через MEA и патч-зажим в нашем исследовании показали аналогичные морфологии AP, таким образом, проверки надежности подхода3.
Несколько лабораторий сообщили измерения APs из различных электрогенных клеток с использованием пользовательских MEAs18,21,26,27,28,29, 30, но надежность использования MEA для последовательных и периодических измерений AP не была оценена. В настоящее время, золотой стандарт патч-зажим техника ограничивается терминалзаписи7,31 в то время как, MEA основе AP измерения являются переходными и, следовательно, может быть проведена несколько раз на той же ячейке. Мы также показываем, что можно легко записывать высококачественные сигналы AP в диапазоне милливольт, требующих минимальной фильтрации. Поэтому исследователи могут проводить не только острые, но и хронические исследования наркотиков в тех же препаратах с использованием MEAs. Кроме того, эта технология позволяет одновременное измерение FP /AP генерации электро-биом библиотек в короткий период времени. Учитывая растущий акцент на прогнозирование аритмии и связанных с наркотиками кардиотоксичности24,32,33,34,35, интеграция AP измерения подходы повысят безопасность лекарственных средств и оценку эффективности.
Здесь мы представляем протоколы для 1) предварительное покрытие криоконсервированных hiPSC-CMs для созревания, 2) диссоциации и покрытия hiPSC-CMs на multiwell MEAs, 3) запись FPs и APs от сетей hiPSC-CM, 4) сегментации и извлечения данных для анализа, и 5) восстановление массивов для многократного повторного использования. Каждый шаг был оптимизирован, подчеркивая критические шаги, где бы это ни было уместно. Обсуждаются требования к клеточной привязанности для обеспечения избиения синцитиального монослойного и процедуры многофункционального восстановления МЕА для повторяющихся электрофизиологических исследований. Наконец, пользовательский графический интерфейс, разработанный в лаборатории, представлен для извлечения сигналов AP, обеспечения качества и обработки рабочего процесса для количественной оценки и анализа параметров AP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>Multiwell-Screen v 1.9.2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>CM media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Converter software</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MultiChannel DataManager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007103HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1413202</td>
			<td>coating substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface board</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell MEA Plate</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>24W300/30G-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>CM base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terg-a-zyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z273287-1EA</td>
			<td>enzymatic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes, individually wrapped</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1371148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure sterile water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue-culture treated plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human ipsc-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings

Скрининг сердечной безопасности имеет первостепенное значение для открытия лекарственных средств и терапии. Таким образом, разработка новых высокопроизводительных электрофизиологических подходов для хиПС-производных кардиомиоцитов (hiPSC-CM) препараты очень необходимы для эффективного тестирования на наркотики. Хотя мультиэлектродные массивы (МЭА) часто используются для полевых потенциальных измерений возбудимых ячеек, недавняя публикация Джоши-Мукерджи и его коллег описала и подтвердила его применение для периодических записей потенциала действий (AP) от той же подготовки hiPSC-CM в течение нескольких дней. Цель здесь заключается в предоставлении подробных пошаговых методов для посева CMs и для измерения волн AP с помощью электропорации с высокой точностью и временным разрешением 1 кв. Этот подход направлен на решение проблемы отсутствия простой в использовании методологии для получения внутриклеточного доступа к измерениям ВЫСОКОй пропускной способности AP для надежных электрофизиологических исследований. Подробное рабочее течение и методы покрытия hiPSC-CMs на многовеллированных пластинах MEA обсуждаются, подчеркивая критические шаги, где это уместно. Кроме того, специально созданный сценарий MATLAB для быстрой обработки данных, извлечения и анализа сообщается для всестороннего исследования анализа формы волны для количественной оценки тонких различий в морфологии для различных параметров продолжительности AP, вовлеченных в аритмии и кардиотоксичности.

Watch this Scientific Journal Video about Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings at JoVE.com

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Эта статья содержит набор протоколов для развития человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток полученных кардиомиоцитов (hiPSC-CM) сетей культивируется на многовеллированных meA пластин для обратимого электропората клеточной мембраны для действия потенциальных измерений. Записи с высокой пропускной прикладом получаются с одних и тех же клеточных сайтов неоднократно в течение нескольких дней.

Человеческие iPSC-производные кардиомиоцитные сети на multiwell микро-электродные массивы для периодических действий Потенциальные записи

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Следующий протокол описывает развитие человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов сетей на многоуэлльных пластин MEA обратить вспять электропорат клеточных мембран для действий потенциальных измерений. Потенциальные параметры действия могут быть использованы для генерации этих кривых реакции для тестирования соединений для электрофизиологии. Multiwell MEA кодирования и сотового покрытия являются наиболее сложными шагами, которые нуждаются в особом внимании.Необходимо выполнять эти шаги старательно и быстро, чтобы предотвратить распространение и высыхание капель. С практикой, это может быть легко преодолеть. Мы разработали пользовательский графический пользовательский интерфейс для одной сегментации, обеспечения качества и извлечения параметров.Наш надежный рабочий процесс MATLAB был реализован для быстрого сокращения больших объемов необработанных экспериментальных данных в объективную группировку потенциальных волновых форм действия. Начните с оттаивания человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток полученных кардиомиоцитов в соответствии с рукописными направлениями. Аккуратно приостанавливайте работу клеток с помощью переносной пипетки для разобщения клеточных комков.Затем тщательно обойтись два миллилитров клеточной подвески в каждый колодец субстрат покрытием шесть хорошо пластины и поместить пластину в инкубатор культуры клеток на 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Клетки должны придерживаться гелевых путей в течение 24 часов и бить спонтанно в 48 часов после покрытия. За два дня до покрытия добавить 0,5 миллилитра человека iPSC кардиомиоцитов культуры среды к каждому хорошо 24-хорошо мульти-электрод массива, или MEA пластины, и выполнить базовую запись для проверки соотношения сигнала к шуму в качестве проверки качества MEAs.Затем, аспирировать средства массовой информации, промыть колодцы стерильной водой, и стерилизовать под ультрафиолетовым светом в ламинарном капюшоне потока на ночь. На следующий день добавьте 0,1 миллилитров FBS к каждой пластине для гидрофильной обработки поверхностей МЭА и инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем аспирировать FBS, и промыть каждый хорошо дважды с 0,5 миллилитров стерильной воды.Оставьте тарелку высохнуть в ламинарный капюшон потока на ночь. На следующий день пипетка пять микролитров рабочего фибронектина разбавления и тщательно обойтись капли в центре каждой хорошо, чтобы покрыть все 12 электродов. Немедленно поместите тарелку на поднятую поверхность внутри увлажняющей камеры, содержащей достаточно стерильной воды, чтобы покрыть всю поверхность блюда.Поместите камеру с пластиной в инкубатор культуры клеток в течение трех часов, а затем приступить к ячейке покрытие. Когда вы будете готовы к пластине кардиомиоцитов, настроить плотность клеток до 6000 клеток на микролитер, разбавляя их в организме человека iPSC кардиомиоцитов оттаивания среды. Используйте нежный стряхивая держать клетки от осадков.Принесите пластину MEA в капот ламинарного потока и тщательно удалите фибронектин капли с P10 пипетки, не касаясь электродов. Немедленно обойтись пятимикролитровой клеточной капли в центр хорошо убедившись, чтобы покрыть все 12 электродов. Сделайте это один хорошо в то время, чтобы предотвратить фибронектин от высыхания.Когда закончите покрытие, поместите пластину MEA обратно в свободно покрытой увлажняющей камере и вернуть его в инкубатор культуры клеток в течение трех часов. После инкубации используйте пипетку P200, чтобы тщательно добавить 200 микролитров сердечно-солнечных среду iPSC-микромиоцитов к каждому хорошо, не нарушая клетки. Поместите пластину MEA обратно в инкубатор культуры клеток и замените культурную среду через 24 часа после покрытия.Когда вы будете готовы получить сигнал от кардиомиоцитов, инициировать приобретение программного обеспечения и вставить пластину MEA в соответствии с рукописными указаниями. Нажмите кнопку Explore, чтобы визуализировать сигнал во всех скважинах и проверить качество сигнала в стабильных условиях состояния. Заметим об электродах с полевым потенциалом, или FP, сигналах в диапазоне милливольт.Затем нажмите ту же кнопку, чтобы остановить разведку. До настоящего времени данные не были зарегистрированы. Нажмите кнопку Перейти, чтобы начать запись.Электроды в каждой колодец будут показывать сигналы FP в окне необработанных данных. После 30 секунд записи нажмите на кнопку Стимулирование и позвольте электропорации иметь место на выбранных участках в течение 30 секунд. Затем нажмите на ту же кнопку, чтобы остановить моделирование и продолжить запись в течение 60 секунд.Используйте пользовательское программное обеспечение на основе MATLAB для сегментации и извлечения различных параметров потенциальных и потенциальных данных на местах. Во-первых, запустите код анализа волновой формы и нажмите на файл и выберите Process.h5. Найти и выбрать ранее созданный mwd.h5 файл. Нажмите на кнопку «Сохранить каталог», чтобы изменить расположение хранилища выходных файлов. Затем создайте очередь обработки сигнала, выбрав электрод и хорошо комбинации интересов, а затем нажав кнопку Очереди.Повторите этот шаг, чтобы добавить больше электродов и комбинаций хорошо в очереди. Если клетки лечились с помощью лекарств, очередь может быть отредактирована, нажав непосредственно на Med Name, Med Concentration. Как только очередь будет завершена, нажмите кнопку Initialize Waveforms, которая запустит предварительную обработку, где сигналы идентифицируются и извлекаются для сегментации.Когда обработка закончена, нажмите на кнопку Увеличить в, и выбрать потенциал действий, или AP, область интереса. Нажмите кнопку Keep и просмотрите панели. Пики и желоба обнаруживаются для каждой формы волны, а нормализованные АП накладываются.После завершения, нажмите кнопку Хранить, чтобы перейти к следующему следу в очереди, и повторить процесс для остальной части электрода и хорошо комбинированных сигналов. Жизнеспособность и плотность покрытия посттаятых кардиомиоцитов имеет решающее значение для мультиуэлл-культуры MEA. Правильное покрытие приводит к здоровой культуре монослой с спонтанным избиением в 48 часов, в то время как плохая жизнеспособность клеток приводит к культурам с высоким процентом немиоцитов населения.Дисперсия капель клеток влияет на плотность культуры и может даже привести к гибели клеток, поэтому точное размещение клеток имеет важное значение. Клетки, обувядющиеся на МЕА, подвергаются проверке качества электрической активности через 48 часов после покрытия. Если 50% электродов в сети и 70% от общего числа сетей не производят сигналы FP, то культура является неоптимальной.Электропорация опосредовано AP записи могут быть получены несколько раз 48 часов после MEA покрытие. Множественные электропорации одного и того же участка ячейки на нуле, 24, 48, 72 и 96 часов не имеют существенного влияния на форму AP с течением времени. Кроме того, не наблюдалось никакой корреляции между FP и амплитудой AP после электропорации с одного и того же места ячейки.Существенным преимуществом этого метода является то, что многоявленная пластина MEA может быть повторно использована несколько раз. Чтобы продемонстрировать надежность этого массива, 3, 815 AP волновые формы вытащил из трех пакетов восстановления, и AP продолжительность данных извлекается для изучения повторяемости результатов. При интересе, можно выполнить дополнительные анализы, такие как экспрессия генов, кальций переходных измерений и патч зажим для исследования поведения конкретных ионных течений.Этот метод прокладывает путь для исследователей для повышения электрофизиологического созревания, а также для проверки хронического воздействия дозы на кардиомиоциты.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Плазменные литографии поверхности паттернов для создания сотовых сетей

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Массовые цитометрии: Протокол для ежедневного настройка и запуск образцы клеток на Цитометр массовой CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Анализ трубчатой ​​мембраны сетей в кардиомиоциты от предсердий и желудочков

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Пломбируемая Femtoliter палата массивы для сотового без биологии

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Производственные, характеристики и потенциальные возможности использования в 3D тканевой инженерии человека пищевода слизистой модели

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Легкая и точная механотерапии профилирование на Micropost массивов

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Стандартизированные и масштабируемые анализ для изучения Перфированный 3D ангиогенной прорастания iPSC полученных эндотелиальных клеток в Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Изготовление многокомпонентных липидных нанотрубочных сетей с использованием скользящего кинезинового анализа подвижности

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Изготовление 3D-матриц микротизвестков сердца с использованием кардиомиоцитов человека, фибробластов сердца и эндотелиальных клеток

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Измерение потенциала оптического действия одной клетки в кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...