Name: human ipsc-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings
Uploaded: 2019-07-15T14:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings at JoVE.com

1. çözeltiler ve malzemelerin hazırlanması (bkz. malzeme tablosu)
<ol><li>
6-Iyi doku-kültür plaka substrat-kaplama
	<ol>
<li>Kaplama substrat buzun veya 4 °C ' de çözüyor.</li>
		<li>Soğuk DMEM/F12 orta bir 1:100 kaplama substrat seyreltme hazırlayın. Çözümü yavaş pipetleme ile karıştırın.</li>
		<li>Taşıma 2 mL kaplama substrat çözeltisi (adım 1.1.2) başına bir 6-kuyu doku kültürü plaka.</li>
		<li>Kaplı doku kültürü plakasını hemen 37 °C ve% 5 CO2 ' ye en az 7 saat ve 7 gün içinde kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
hiPSC-CM kültür orta
	<ol>
<li>4 °C ' de 500 mL CM taban ortamına kadar çözülmüş 10 mL CM 'lik medya takviyesi ekleyin. 2 haftaya kadar 4 °C ' de saklayın.</li>
		<li>Aliquot gün için medya miktarı gerekli ve kullanmadan önce oda sıcaklığına getirmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>hiPSC-CM çözme ortamı: hiPSC-CM kültür ortamını (adım 1,2)% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile karıştırarak taze hazırlayın. Süspansiyon için CMs Çözüleme öncesi oda sıcaklığına medya getirin.</li>
	<li>Fibronectin 1 mg/mL stok çözeltisi: aliquot 200 μL 1,5 mL steril mikrofuge tüpleri içine ve daha sonra kullanılmak üzere 4 °C ' de saklanır. 50 μg/mL konsantrasyonunun çalışma çözümünü buzda taze hazırlayın.</li>
	<li>Multiwell Temizleme çözümü: 50 mL steril çift distile su (ddH2O) ile enzimatik deterjan 0,5 g 'yi birleştirin. İçeriği karıştırmak için Vortex. Bir haftaya kadar 4 °C ' de filtreleyin ve saklayın.</li>
</ol>2. olgunlaşma için ağoplanmış hiPSC-CM ön kaplama (Şekil 1)
Not: Bu bölüm, 1-2 milyon hücreli/şişede sıvı nitrojen 10 gün sonrası farklılaşması ile besleyici içermeyen tek tabakalı yöntemi3,16 ve kriokonservirovannogo kullanılarak ayırt edilen hipsc-CMS ' i çözme ve kültürleme için tasarlanmıştır. Bir şişedeki hücreler, 6-well doku kültürü plakasının iki substrat kaplı kuyusuna kaplamadır. Kardiyomiyositler tüpün altına yerleşmek eğilimindedir, böylece ön kaplama sırasında nazik karıştırma, kuyular arasında bile hücre yoğunluğunu elde etmek için önemlidir.
<ol><li>15 mL konik tüp içine çözülür ve oda sıcaklığına getirmek hiPSC-CMs şişe başına FBS 2 mL aliquot.</li>
	<li>37 °C ' lik su banyosuna yerleştirerek ve 3 dakikadan fazla olmayan bir şekilde bile çözülüyor şekilde yavaşça kıvrılma</li>
	<li>Hemen FBS içeren tüp için şişe içeriğini aktarmak (bkz. Adım 2,1), karıştırmak ve Santrifüjden 200 x g 5 dk.</li>
	<li>Süpernatant aspirate ve 1 ml hipsc-cm çözme Orta hücre Pelet pelletini (bkz adım 1,3) her şişe çözülmüş. Yumuşak triturasyon ile Pelet yeniden pelletini için bir transfer pipet kullanın. Hücre viability değerlendirmek.</li>
	<li>Adım 2,4 yılında çözülmüş hiPSC-CM şişe başına ek 3 mL çözme orta ekleyin ve hücre kümeleri daha fazla ayırmak için bir transfer pipet kullanarak yavaşça askıya.</li>
	<li>2 mL hücre süspansiyonunu, substrat kaplı 6-kuyu plakalarının her bir kuyunda yavaşça dağıtın (bkz. Adım 1,1). 37 °C ve% 5 CO2' de hücre kültürü kuluçvörü yerleştirin.</li>
	<li>24 saat sonra taze hiPSC-CM kültür ortamı ve 20 gün sonra haftalık 3 kez değiştirin. Not: hücreler, 24 saat substrat kaplamasına uymalı ve 48 h Post-kaplama olarak kendiliğinden yendi (bkz. video 1 ve video 2).</li>
</ol>3. multiwell MEA plaka sterilizasyon ve kaplama (Şekil 2 ve şekil 3)
Not: burada açıklanan protokol, hiPSC-CM kaplama için cam üzerinde 12 mikro altın PEDOT kaplı elektrotlar ile 24-Well MEA plakaları hazırlamak için. Bu elektrotlara zarar verebilir gibi plakanın alt dokunmadan kaçının.
<ol><li>Hücre kaplamasını iki gün önce, 0,5 mL hiPSC-CM kültür orta ekleyin (bkz: adım 1,2) her iyi ve MEAs kalite kontrol için sinyal-gürültü oranı doğrulamak için bir temel kayıt gerçekleştirin.</li>
	<li>Medyayı aspirate, steril ddH2O ile durulayın ve bir gecede bir laminar akış kaput içinde UV ışığı altında sterilize.</li>
	<li>Hücre kaplamasını önceki gün, MEA yüzeylerinin hidrofilik tedavisi için her iyi FBS 0,1 mL ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye yapın. Bu adım, hücre eki için gereklidir.</li>
	<li>FBS aspirate ve steril ddH2o iyi başına 0,5 ml ile durulayın. Bir kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Bir gecede laminar akış kaput kuru plaka bırakın.</li>
	<li>50 μg/mL fibronektin ile stoktan soğuk DMEM/F12 ortamında çalışma seyreltmesi hazırlayın (bkz. Adım 1,4). Çözümü buzda tut.</li>
	<li>Çalışma fibronektin seyreltme 5 μL pipet (bkz. 3,6) ve tüm 12 elektrotları kapsayacak şekilde her bir kuyu ortasına damlacık dikkatle dağıtın. Damlacık kurumasını önlemek için 24 kuyu boyunca hızlı bir şekilde çalışmak önemlidir.</li>
	<li>Hemen tüm çanak yüzeyi kapsayacak şekilde steril ddH2O içeren bir nemlendirme odası içinde yükseltilmiş bir yüzey üzerinde fibronektin kaplı MULTIWELL MEA plaka yerleştirin. Hücre kültürü kuluçk 3 h için multiwell MEA plaka ile Oda yerleştirin. Not: 24 iyi MEA plakasını nemlendirme odasına yerleştirmek, fibronektin damlacıkları kuluçak döneminde kurumasını önlemek için önemlidir.</li>
</ol>4. hipsc-cm ayrışma ve multiwell MEA plaka kaplama (Şekil 3)
Not: Bu adımı, MEA fibronektin inkübasyon öncesinde 1 saat önce başlatın. Hücre dağılma çözeltisi 37 °C ' de olduğundan ve IPSC-CM çözme ortamının oda sıcaklığında olduğundan emin olun. Dissociation yöntemleri 30 gün sonrası farklılaşmış hiPSC-CMs için optimize edilmiştir substrat kaplı 6-kuyu plakaları üzerinde kültürlü (bkz adım 2) MEA kaplama için% 90 uygun CMs hakkında elde etmek. Bakım hücre ölümü önlemek için toz iken hava kabarcıkları tanıtmak için değil alınmalıdır.
<ol><li>30 gün sonrası farklılaşan hiPSC-CM kültürü ile 6-well doku kültürü çanak her kuyudan kültür ortamı aspirate (bkz: adım 2,7) ve 2 mL steril D-PBS için iyi başına yıkayın.</li>
	<li>1 mL önceden ısıtılmış hücre dağılma çözeltisi ekleyin ( malzeme tablosunabakın) ve 37 °c ' de 4 dakika boyunca inküye yapın. Dağılma için hücreleri gevşetmek için hafifçe triturate bir transfer pipet kullanın. Hücrelerin çoğu hala bağlı ise, başka bir 3 dakika 37 °C ve triturate tekrar için inkübe. Bu ek inkübasyon maksimal hücre kurtarma için yardımcı olmalıdır. Bu düşük hücreli viability neden olabilir gibi 7 dakikadan fazla inkük etmeyin.</li>
	<li>Bir transfer pipet kullanarak, tüm bölünmüştür hücreleri hiPSC-CM çözme orta içeren bir konik tüp içine havuz (bkz. Adım 1,3). Hücre dağılma çözeltisi etkinliğini engellemek için en az iki kez medya hacmi (2 mL her iyi hasat) içinde hücreleri askıya alınması önerilir.</li>
	<li>200 x g 'de 5 dakika Santrifüjü</li>
	<li>Pelet gevşek yüzeye bağlı ve 0,1 ml hipsc-cm çözme orta pelletini olarak çözümü dikkatle aspirate. Hafif trituration ile Pelet birkaç kez yeniden pelletini için bir transfer pipet kullanın.</li>
	<li>Aliquot 2 μL ayrılmış hücreler ve 1,5 mL mikrofuge tüpünde 18 μL medya ile seyreltilmiş. 20 μl tripan mavi ekleyin ve hücre sayısı ve canlılığı değerlendirme için karıştırın.</li>
	<li>Hücre yoğunluğunu 6.000, hiPSC-CM çözme ortamının uygun hacmini ekleyerek Cells/μL 'ye ayarlayın. Birkaç kez yumuşak Flicking tarafından Pelet askıya. HiPSC-CMs, özellikle yüksek yoğunluklarda kaplama yapılırken cam yüzeylerden kolayca ayırabilirsiniz. 15 gün elektrik kaydı elde etmek için tohumlama yoğunluğu ve kaplama koşullarını optimize ettik.</li>
	<li>Hazır olduğunda, hücre tohumlama için multiwell MEA plakasını laminar akış kaputu içine getirin. Fibronektin kurutulması önlemek için bir kerede aşağıdaki iki adım bir iyi gerçekleştirmek için önemlidir.<ol>
<li>Elektrotlara dokunmadan bir P10 pipet kullanarak fibronektin damlacık dikkatle çıkarın.</li>
		<li>Tüm 12 elektrotları kapsayan MEA plakasının kuyu merkezine hemen 5 μL hücreli damlacık (30.000 hücre) dağıtın. Tüm 24 kuyular kaplamana kadar adımı tekrarlayın. Aralıklı hücre süspansiyonunun Flicking ile karıştırma önerilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Multiwell MEA plakasını geri gevşek kapsanan nemlendirme odasına yerleştirin ve 37 °C ' de hücre kültürü inkükokosu ve hücre eki için 3 saat için% 5 CO2 ' ye dönün.</li>
	<li>P200 pipet kullanarak hücreleri rahatsız etmeden her bir kuyu için 200 μL hiPSC-CM çözme ortamını dikkatlice ekleyin. Kuyu tarafına medya dropwise ekleyin.</li>
	<li>Multiwell MEA plakasını geri hücre kültürü kuluçevine yerleştirin.</li>
	<li>24 saat sonrası kaplama taze hiPSC-CM kültür ortamı ile değiştirin. Kardiyomiyositlerin spontan dayak bu noktada gözlemlenebilir (bkz. video 3).</li>
	<li>Deneylerin sonuna kadar her 2 günde bir medyayı değiştirin.</li>
</ol>5. hipsc-cm Elektroporasyon ve sinyal alımı (rakamlar 4 – 6)
Not: Bu protokol, yüksek verimlilik elektrot sinyallerinin eşzamanlı kaydı içindir (24 kuyuların her biri için 12 site). 24-iyi multiwell MEA sistemi satın alma yazılımı ile kullanılır (bkz. malzeme tablosu). Tüm MEA kayıtları 37 °C ' de gerçekleştirilir.
<ol><li>Arayüz kartını açın ve edinme yazılımını başlatın. Multiwell MEA baş aşamasının 37 °C sıcaklığa ulaşması için yeterli zaman verin ( Şekil 4' teki ok No. 1 ' e bakın).</li>
	<li>4. adımda multiwell MEA plakasını, kayıt platformunun kapağına yerleştirerek çok iyi MEA kafa aşamasına yerleştirin ve Ekle düğmesine tıklayın ( Şekil 4' te ok No. 2 ' ye bakın). Kayıtları başlatmadan önce sıcaklığın stabilizasyonu için izin verin.</li>
	<li>
Edinme ve Elektroporasyon ayarlarını ayarlama
	<ol>
<li>Deneysel akış tanımla simgesine tıklayın ( Şekil 4' te ok No. 3 ' e bakın) ve kayıt süresini 2 dakika veya istediğiniz gibi ayarlayın.</li>
		<li>Veri edinme kurulumu simgesine tıklayın ( Şekil 4' te ok No. 4 ' e bakın) ve örnekleme hızını 20 kHz 'ye ayarlayın, 0,1 Hz 'ye yüksek geçiş filtresi ve 3500 Hz 'ye düşük geçişli filtre.</li>
		<li>Stimulator ayarlar simgesine tıklayın (bkz. Şekil 5). Stimulus Definition sekmesi altında, 1 mV, 1 MS ve 1 Hz 'nin biphasik simetrik voltaj darbeleri olarak stimülasyon tanımlayın. Stimülasyon elektrotları sekmesinin altında, ilgili tüm elektrotlar vurgulanarak Elektroporasyon sitelerini seçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüm kuyularda sinyalleri görselleştirmek için keşfet düğmesini tıklayın. Sinyal kalitesini ve istikrarlı durum koşullarını doğrulayın. MV aralığında FP sinyalleri ile elektrotlar hakkında not alın. Keşfi durdurmak için aynı düğmeyi tıklatın. Bu noktaya kadar veri kaydedilmedi.</li>
	<li>Go! düğmesine tıklayarak kaydetmeye başlayın. Her bir kuyu elektrotları ham veri penceresinde FP sinyalleri gösterecektir (Şekil 6). 30 s kayıt sonra, teşvik düğmesine tıklayın ve Elektroporasyon 30 s için seçilen sitelerde yer almak için izin; sonra, uyarmayı durdurmak ve kalan 60 s için kaydetmeye devam etmek için aynı düğmeye tıklayın. Not: kaydedilmiş dosya ' uygulama ' açılır menüsünde ' Replayer modu ' geçiş yaparak geri çalınabilir.</li>
</ol>6. yeniden kullanım için multiwell MEA plaka temizliği
<ol><li>Son deneylerden sonra, her iyi ve dikkatle elektrot yüzeyine dokunmadan kaçınarak tüm medya içeriğini duman çekiş multiwell plaka tüm kuyuları temizleyin.</li>
	<li>1 mL steril ddH2o iyi başına ekleyin. Aspirate ve bir kez tekrarlayın.</li>
	<li>Eklemek 0,3 mL multiwell temizleme çözeltisi (bkz adım 1,5) başına iyi. Hücre ve enkaz yerinden etmek için oda sıcaklığında bir gecede inkübe.</li>
	<li>Ertesi sabah, solüsyonu Aspire ve 1 ml steril DDH2O ile durulayın. 5-7 dk ve Aspire için inküye. 5 kez tekrarlayın.</li>
	<li>Eklemek 0,5 mL steril ddH2O başına iyi. Temizlenmekte olan MEAs 'ın kalite kontrolü için temizlenmiş multiwell plakanın taban çizgisini kaydedin (Şekil 7).</li>
	<li>Kullanıma hazır olana kadar 4 °C ' de saklayın.</li>
</ol>7. veri dosyası dönüştürme ve ihracat
Not: her kayıt için dört veri dosyası oluşturulacaktır: MWR, MWC, MWD ve MWS dosyaları. Dönüştürücü yazılımını kullanarak, MWD dosyası, özel olarak oluşturulmuş komut dosyası kullanarak sonraki analiz için H5 dosyasına dönüştürülebilir (bkz. ek dosya 1).
<ol><li>Dönüştürücü yazılımını başlatın (bkz. malzeme tablosu).</li>
	<li>Dosya menüsünden giriş yolunu ayarla 'yı seçin. İlgi veri dosyalarını içeren klasörü seçin.</li>
	<li>Dosya menüsünden Çıkış yolunu ayarla 'yı seçin. Dönüştürülen dosyaların kaydedileceği klasörü seçin.</li>
	<li>İlgi MWD dosyasını vurgulayın.</li>
	<li>HDF5 Için dışa aktar düğmesine tıklayın.</li>
</ol>8. veri segmentasyon ve analiz (rakamlar 8-10)
Not: MATLAB tabanlı özel yazılım, çeşitli FP ve AP veri parametrelerini segmentlere ayırmak ve ayıklamak için kullanılır. Yazılım talep üzerine mevcuttur.
<ol><li>MATLAB kullanarak Waveform çözümleme kodunu ÇALıŞTıRıN (GUI 'nin ana penceresinin görünümü için bkz. Şekil 8 ).</li>
	<li>Dosyayı tıklatın ve Process. H5seçin.</li>
	<li>Yukarıdaki adım 7 ' ye göre oluşturulan MWD. H5 dosyasını bulup seçin.</li>
	<li>Çıkış dosyalarının depolama konumunu değiştirmek için dizini kaydet düğmesini tıklatın.</li>
	<li>İlgili elektrot/iyi kombinasyonları seçip Queue düğmesine tıklayarak bir sinyal işleme kuyruğu oluşturun. Kuyruğa işlenmek üzere daha fazla elektrot/iyi kombinasyonlar eklemek için bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Hücrelerin ilaç ile tedavi edilmediği takdirde doğrudan Med adı/Med konsantrasyon üzerine tıklayarak sırayı düzenleyin (Şekil 8).</li>
	<li>Sıra son olduğunda, Başlat dalga formları düğmesini tıklatın. Bu, sinyallerin belirlendiği ve segmentasyon için ayıklandığı ön işleme başlayacaktır.</li>
	<li>Zoom ın düğmesine tıklayın ve imleç ile ilgilendiğiniz eylem potansiyel alanını seçin (Şekil 9).</li>
	<li>Keep düğmesine tıklayın ve panelleri gözden geçirin. Dorukların (kırmızı ' x ') ve dallar (sarı daireler) her dalga için algılanır ve normalleştirilmiş eylem potansiyelleri üst üste. Koru düğmesini tıklatın ve sıradaki sonraki izlemede hareket edin (Şekil 10).</li>
	<li>Kuyruktaki elektrot/kuyu kombinasyonu sinyallerinin geri kalanı için 8.8-8.9 arasındaki adımları yineleyin. Not: bir . csv dosyası, her dalga formu için ölçülen APD parametreleriyle oluşturulur. Her . H5 dosyası için A . mat dosyası da bölümlenmiş verilerin ek işleme izin vermek için kaydedilir.</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Yıllar içinde, Meas uygulaması onların elektrofizyolojik özellikleri36,37,38,39çalışmak için heyecanlı hücrelerin FP ölçümleri yürütmek için sınırlı olmuştur. Sadece birkaç grup özel MEA tabanlı teknoloji18,29,30kullanarak elektrojenik hücrelerden AP izleri bildirdi. Ancak, bu yaklaşımlar aynı preparatlardan tekrarlanan kayıtlar için araştırılmamıştır. Birden fazla hiPSC-CM ağlarında aynı hücre sitesinden gün içinde aynı anda3APS okumak için yenilikçi ve doğru bir metodoloji geliştirdik. Yayınlanan çalışmamızda, yüksek hassasiyetle ve 1 μs temporal çözünürlüğe sahip birden fazla hiPSC-CM kültüründen AP dalga formu kitaplıkları oluşturmak için çok iyi bir mikro altın MEA platformu kullanıldı. Burada açıklanan protokol, yüksek verim AP kayıtları için sinsityal cm ağlarının verimli gelişimi için dizi üzerinde hipsc-CMS ' i kekilde açıklar. Protokolde çeşitli kritik adımlar şunlardır: 1) çoklu yüksek saflıkta toplu üretim için kalite kontrollü CMS için kriyoprezervasyonu bankacılık, 2) son derece uygun Post-çözülebilir CMS Pre-Kaplama ve olgunlaşma, 3) cm için multiwell MEA plaka tedavisi tohumlama, 4) hiPSC-CM kültür dağılma 30 gün MEA kaplama için farklılaşma sonrası, ve 5) çoklu yeniden kullanım için MEAs restorasyonu.
HiPSC farklılaşması toplu-toplu varyasyon deneysel sonuçları etkileyebilir dikkat etmek önemlidir. Farklılaşma Tek tabakalı yöntemi yüksek yüzde kardiyomiyosit üretimi için-evde optimize edildi3,40. Kültürlerimizin MLC2v ve TNNT2 belirteçleri FACS Analizi bir ≥ 90% ventrikül benzeri fenotip3göstermektedir. Bu kalite kontrollü kültürlerin deneysel çalışmalar için kriokonservirovannogo vardır. Mevcut farklılaşma yaklaşımlar nodal-, atriyal-ve ventrikül benzeri hücrelerin heterojen bir karışımı verim3,16,17,41. Bu nedenle, CM alt nüfus zenginleştirme için kullanılan stratejiler daha da kültürlerin özgüllüğü artırabilir. Ayrıca, doku mühendisliği yaklaşımlar olgunlaşma geliştirmek için istihdam edilebilir. Burada önerilen yöntemler, diğer CM kaynakları için kolayca uygulanabilir.
Mea kullanılarak kaydedilen AP dalga formları, optik haritalama42,43, tamamlayıcı metal oksit yarıiletken bazlı MEA18,21ve simüle AP ile kardiyomiyositlerin ağlarından kaydedilmiş olanlara benzer FP kayıtlarını kullanarak20. MEA Hai ve Spira25 ile AP ölçümlerinin mekanizmasını ele almak için electropore-elektrot arayüzünün kurulan keskin cam mikroelektrot tekniğini taklit ettiğini göstermiştir. Ancak, MEA sistemlerindeki electropore-elektrot arayüzünün kalibre edilmediğini ve amplitüün hassasiyet ve çözünürlüğün bir fonksiyonu olduğunu göz önüne alındığında, çalışmamızda istirahat membranı potansiyeli ve gerçek genlik değerleri kurulamaz. Tekniği. Yaklaşım, AP genliği söz konusu olduğunda optik eşlemede benzer sınırlamaları paylaşır.
Çok iyi MEA tabanlı FP/AP okumları burada bildirilen ilaç güvenliği değerlendirmesi için yeni olanaklar açık. Spontan olsa da, bu hiPSC-CM monolayers sürekli oranlarda yendi. Birden fazla ağda APD parametrelerinin analizi, elektrik heterojenliği hakkında bilgi sağlar (Şekil 13). Ancak, kapsamlı APD Restitüsyon analizlerinin önceki diyastolik aralıkları içermesi gerekir. Ayrıca, 96 h (Şekil 11B) üzerinden aynı hücre sitesinden kaydedilen yüksek kaliteli AP dalga formları, zaman içinde, gelişmede ve hastalıklarda değer olacak membran elektrodinamiklerini takip eden ilk rapordan biridir.
AP parametrelerini ölçmek için burada açıklanan protokol, test bileşikleri için doz-yanıt eğrileri oluşturmak için kullanılabilir. Son zamanlarda Edwards ve al.3tarafından bildirilen, norepinefrin doz tepkisi, isoproterenol ve E 4031 çeşitli repolarizasyon AŞAMALARıNDA APD için çizilir. Yayınlanmış çalışma, AP dalga formlarındaki doz bağımlı ince değişikliklerin gerçek zamanlı olarak tanımlanması için yaklaşımın doğruluğunu ve güvenilirliğini göstermiştir. Bu teknik, çeşitli elektrofizyolojik tepkiler anlamak için diğer bileşikler veya küçük molekül kütüphaneler için kolayca uzatılabilir.
Bu çalışmada sunulan AP ölçümleri için MEA merkezli yaklaşım sadece elektrofizyolog değil, aynı zamanda hücre biyologlar ve in-silico modelleyiciler için de ilgi olacaktır. Ayrıca, hipsc-CMS aynı hücre sitesinden FP/AP kayıtları araştırmacılar kısa bir süre içinde geniş bir dizi heyecanlı hücresel ağlar biyoelektrik veri kitaplıkları oluşturmak için sağlayacaktır. Bu kaynakların kullanılabilirliği ilaç keşifleri ve hastalık modelleme için değerli olacaktır.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositler (hipsc-CMS), artan sayıda laboratuar için altın standarttır1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Embriyoid organları11,12,13 ve tek tabakalı3,7,10,11,12, dayak 13,14,15,16,17 farklılaşma kardiyomiyosit üretimi için tercih edilen yöntemlerdir ve multielektrot dizisi (MEA) ortak bir modalite haline gelmiştir Bu ağların elektrodinamiklerini izlemek için18,19,20. Alan potansiyelleri (FPs) gibi dayak oranı, genlik, süre ve RR aralıkları elde edilebilir parametreleri kendiliğinden dayak monolayers temel elektrofizyolojik tepkiler vardır18,21, 22,23, bu ekstreküler FP sinyallerinin temelindeki eylem potansiyeli (AP) bileşenleri24' ü ortaya çıkarması zordur. Doğrudan tekrarlayan AP ölçümleri için MEAs uygulamasının keşfi hakkında yapılan son yayınımız, birden fazla çeşitli repolarizasyon aşamalarında geniş bir dalga formu analizi ile örnek hücre içi AP okumaları için metodoloji kanıtı sağlar hiPSC türevi kardiyomiyosit ağları3gruplar. Çalışmada, electroporating pulsların hiPSC-türev kardiyomiyositlerin ağlara teslimini AP kayıtları için hücre içi erişim sağlar göstermiştir. Bu geçici AP kayıtları, yaralanma sitesi3,25,26ile gözlenen transmembran potansiyel kurtarmalara bağlıdır. MEA ile kaydedilmiş dalga formları ve bizim çalışmamızda yama-kelepçe benzer AP morfolojileri böylece yaklaşım güvenilirliği doğrulama gösterdi3.
Birkaç laboratuar, özel yapılı Meas18,21,26,27,28,29 kullanarak çeşitli elektrojenik hücrelerden APS ölçme bildirdi 30, ancak tutarlı ve tekrarlayan AP ölçümleri Için MEAs kullanmanın güvenilirliği değerlendirilmiyor. Şu anda, altın standart yama-kelepçe tekniği Terminal kayıtları7,31 ise, MEA tabanlı AP ölçümleri geçici ve bu nedenle aynı hücrede birden çok kez yapılabilir sınırlıdır. Ayrıca en az filtreleme gerektiren milivolt aralığında yüksek kaliteli AP sinyalleri kolayca kaydedebilirsiniz gösterir. Araştırmacılar bu nedenle sadece akut değil, aynı zamanda kronik ilaç çalışmaları MEAs kullanarak aynı preparatlarda yürütebilecek. Ayrıca, bu teknoloji, kısa bir süre içinde electro-biome kitaplıkları üreten eşzamanlı FP/AP ölçümüne izin verir. Aritmi tahmin ve ilaç ilişkili kardiyotoksisite artan vurgu verilen24,32,33,34,35, AP ölçümü entegrasyonu yaklaşımlar ilaç güvenliği ve etkinlik değerlendirmelerini artıracaktır.
Burada, biz 1 için protokoller mevcut) ön-kaplama için kriokonservirovannogo hipsc-CMS olgunlaşma, 2) bunalımları ve kaplama hipsc-CMS multiwell Meas, 3) FPs ve APS kayıt hipsc-cm ağlar, 4) segment ve analiz için veri ayıklama, ve 5) birden çok yeniden kullanmak için diziler geri yükleme. Her adım, ilgili her yerde kritik adımları vurgulayarak optimize edilmiştir. Hücre eki için gereksinimler bir dayak sinsityal Tek tabakalı ele almak ve tekrarlayan elektrofizyolojik çalışmalar için multiwell MEA restorasyon prosedürleri açıklanmıştır. Son olarak, laboratuvarda geliştirilen özel bir GUI, AP parametrelerini ölçmek ve analiz etmek için AP sinyal çıkarma, kalite güvencesi ve segmentasyon iş akışı için sunulur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>Multiwell-Screen v 1.9.2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>CM media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Converter software</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MultiChannel DataManager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007103HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1413202</td>
			<td>coating substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface board</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell MEA Plate</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>24W300/30G-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>CM base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terg-a-zyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z273287-1EA</td>
			<td>enzymatic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes, individually wrapped</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1371148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure sterile water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue-culture treated plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human ipsc-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings

Kalp güvenliği taraması, ilaç keşfi ve terapi için önemli öneme sahiptir. Bu nedenle, hiPSC-türev kardiyomiyosit (hiPSC-CM) preparatları için yeni yüksek verim elektrofizyolojik yaklaşımların geliştirilmesi, verimli ilaç testi için çok gereklidir. Multielektrot dizileri (Meas) sıklıkla heyecanlı hücrelerin alan potansiyel ölçümleri için istihdam edilir rağmen, Joshi-Mukherjee ve meslektaşları tarafından yeni bir yayın açıklanan ve tekrarlayan eylem potansiyeli (AP) kayıtları için uygulama doğrulandı gün içinde aynı hiPSC-CM hazırlık. Burada amaç, CMs 'yi tohumlamak ve yüksek hassasiyetle elektroporasyon yoluyla AP dalga formlarını ölçmek ve 1 μs temporal çözünürlüğü için ayrıntılı adım adım yöntemler sağlamaktır. Bu yaklaşım, güvenilir elektrofizyolojik araştırmalar için yüksek verimlilik AP ölçümleri için hücre içi erişim elde etmek için kullanımı kolay metodolojisi eksikliği giderir. Multiwell MEA plakaları üzerinde hiPSC-CMs kaplama için ayrıntılı bir iş akışı ve Yöntemler, ilgili her yerde kritik adımları vurgulayarak tartışılmaktadır. Buna ek olarak, hızlı veri işleme, ekstraksiyon ve analiz için özel olarak oluşturulmuş bir MATLAB komut dosyası, dalga formu analizinin kapsamlı bir şekilde incelenmesi için, morfolojideki çeşitli AP süresi parametreleri için ince farklılıkları ölçmek üzere raporlanır Aritmi ve kardiyotoksisite.

Sonrası çözülen hipsc-CMS ' i k i canlılığı ve kaplama yoğunluğu çok iyi MEA kültürü için önemlidir. Pre-Kaplama 1-2 milyon hipsc-CMS/şişenin iki kuyu içine bir 6-iyi doku kültürü plaka ile 50% veya daha fazla olabilirlik spontan dayak ile sağlıklı bir tek tabakalı kültürü üretecek 48 h. yüksek bir yüzde ile kültürler neden olacak CMS zayıf miyosit olmayan nüfus. Çok iyi MEA kaplama için Disosiye bu monolayers genellikle tutarsız sonuçlar ve kötü kalite sinyalleri üretmek ve bu nedenle atılmalıdır. Şekil 1 48 h sonrası kaplama en optimum vs alt-optimum Hipsc-CMS kültürler örnekleri gösterir. Multiwell MEAs doğrudan yerine substrat kaplı doku kültürü plakaları üzerinde CMs çözme, hücre kurtarma ve olgunlaşma için izin verir3. Tutarsız sonuçlar üretildiği için dizi üzerinde kriokonservirovannogo CMS doğrudan kaplama önerilmez.
Ayrılmış CMs 'nin kalitesine ek olarak, multiwell MEA 'daki hücre eki hücre yoğunluğuna ve fibronektin kaplama tekniğine oldukça bağımlıdır. Fibronektin damlacık büyüklüğü, CMs 'nin fibronektin kaplı alanın sınırlarına uygun olması açısından önemlidir. Bu nedenle, sadece 5 μL fibronektin çözeltisi doğrudan elektrot dizi alanı üzerinde dağıtılır. Damlacık dağılmadığından emin olmak için, kuyu yüzeyi kaplama sırasında tamamen kuru olmalıdır. Şekil 2 , optimum hazırlık için adım adım ön tedavi şemaları ile MULTIWELL MEA plakasının düzenini gösterir. Ayrıca, fibronektin çok güzel MEA plakaları kurutmak önlemek için bir nemlendirme odası içinde en fazla 3 saat süren inkübasyon döneminde yerleştirilmelidir (bkz. Adım 3,8). Kuluçka süresi tamamlandıktan sonra, her iyi sadece CM kaplama önce ve sadece o zaman sonraki iyi kaplama devam fibronektin damlacık kaldırmak için önemlidir. CMs 'nin hızla ve dikkatlice dağıtımı çalışma başarılı hücre ataşmanı için anahtardır.
hiPSC-CM kültürlerinde 30 gün sonrası farklılaşma, enzimatik hücre ayrışma yöntemini kullanarak multiwell MEA kaplama için ayrılır (bkz. Adım 4). CMS, fibronektin-kaplamalı MEA yüzeylere 3 h ve diziler kapsayan bir tek tabakalı, 24 h sonrası kaplama (Şekil 3) sonrasında görünür olacaktır. Tek tabakalı senkron dayak 24-48 saat içinde gözlemlenir. hücre damlacık dispersiyon kültür yoğunluğu etkileyecek hatta kurutma ve hücre ölümü neden olur. Doğrudan dizi üzerinde hassas hücre yerleşimi son derece önemlidir ve bu nedenle tekniği optimum kaplama için uygulanmalıdır. Referans elektrot hücre yapışma elektrik sinyali üretim engel olacaktır. Bkz. Şekil 3 en iyi cm yerleşimi ve kültür görüntüleri için 24 saat sonra.
Multiwell MEAs üzerinde kültür CMs 48 h sonrası kaplama elektrik aktivitesi için kalite kontrol tabi tutulur. Genellikle, FP sinyal genliği μV aralığından mV 'ye yaklaşık 4 gün3olarak artar. Eğer bir ağ içindeki elektrotların% 50 ve toplam ağların% 70 ' i FP sinyalleri üretemiyorsanız, ağ veya kültür yetersiz ve atılmalıdır. Sadece kalite denetimi geçiren kültürler, FP ve AP analizi için işlenir. Şekil 6 iyi ve alt standart FP sinyallerinin örneklerini gösterir.
Electroporation-mediated AP kayıtları, kültür 48 h Post-MEA kaplamandan birden çok kez alınabilir. Electroporation istihdam, biz birden fazla hiPSC türetilen kardiyomiyoksit ağları yüksek çözünürlüklü APs kaydetmek için hücre içi erişim kazanmıştır. FP 'nin AP 'ye dönüşümlü dönüşümü için 30 s 'lik düşük voltaj darbeleri (1 V, 1 MS, 1 Hz) teslim edildi. Elektroporasyon, elektrotların yaklaşık% 75 ' inde AP ölçümü için başarılı hücre içi erişime izin verir. Elektrik sinyalleri 30 s pre-Elektroporasyon, 30 s sırasında ve 1 dak sonrası Elektroporasyon içeren 2 dakika için kaydedilir. 10 s AP dalgası ile 10 ' dan fazla elektroporasyonu olan bir tren, sinyal kalitesi ve analizi için tüm sitelerde değerlendirilir. Saf AP sinyaline uygun olmayan herhangi bir iz atılır. AP genlikleri FP sinyaliyle ilişkilendirilmiş olup olmadığını araştırmak için tüm 288 siteleri aynı anda dalga formlarını kaydetmek için electroporated. İki farklı elektrotdan aynı hücre sitesinden kaydedilen temsilci FP ve AP sinyalleri Şekil 11A'da gösterilir. Aynı hücre sitesinden kaydedilen FP genlikleri ve Elektroporasyon sonrası AP amplitütler arasında hiçbir korelasyon izlenmemiştir. Ayrıca, 0, 24, 48, 72 ve 96 h 'de aynı hücre sitesinin birden çok electroporations zaman içinde AP şekli üzerinde önemli bir etkisi yoktu (Şekil 11B).
Sistemin yüksek verimlilik niteliği göz önüne alındığında, RR aralığı, anlık frekans ve diferansiyel eylem potansiyel süresi gibi ilgi parametrelerini ayıklamak ve ölçmek için manuel bir teknik verimsiz ve zaman alıcıdır. Araştırma topluluğuna talep üzerine kullanılabilen özel olarak oluşturulmuş bir MATLAB komut dosyası, 1 μs çözünürlüğe sahip dalga formu ölçümleri yapmak için kullanılmaktadır. Elektroporasyon zaman noktaları, sinyal çıkarma, kalite güvencesi ve segmentasyon iş akışını gerçekleştirmek için 10 s AP sonrası elektroporasyonu belirlemek üzere çıkarılan sinyalle kaplanmış edilir (Şekil 8, Şekil 9, Şekil 10). Kullanıcı arayüzü, bir kılavuz olarak kaplanmış Elektroporasyon göstergelerini kullanarak istenilen segmentin seçilmesi için izin verir. Segmentlere ayrılmış dalga formu, bireysel AP dalga formlarını daha fazla belirlemek için alt yordamlar tarafından işlenir. Bu, her döngü için en yüksek ve en düşük voltajın belirlendiği tepe algılama yoluyla tamamlanır. Bu işlem tamamlandıktan sonra genlikleri normalleştirilmiş ve ilişkilendirme zaman vektörler 1 en yüksek değeri sıfır zaman tanımlamak için kaydırılır. APD ölçümlerini belirlemek için bireysel döngüleri boyunca kesişme noktalarının interpolasyonu kullanılmıştır. Bu nedenle, AP dalga biçimli segmentasyon için kısmi Otomasyon iş akışı, kısa bir süre içinde birden çok kültürden çeşitli APD parametreleri için verimli veri analizine olanak sağlar. Gerçek zamanlı veri analizi için FPs ve APs için dahil etme ve dışlama kriterlerinin daha fazla Otomasyonu devam etmektedir.
Multiwell MEA plakasının önemli bir avantajı, birden çok kez yeniden kullanılabilir olmasıdır. Bu restorasyon, maliyet-etkin ve tutarlı veri toplama için tekrarlayan elektrofizyolojik çalışmalar sağlar. 6 restorasyonlar sonra aynı dizideki APS kayıtları Şekil 12' de gösterilir. Sinyal-gürültü oranı birden fazla reuses arasında benzer. Tekrarlanan elektrofizyolojik çalışmalar için dizinin güvenilirliğini göstermek için, toplam 3815 AP dalga formları üç restorasyon toplu işleminden havuzlanır ve sonuçların tekrarlanabilirliği incelemek için AP süresi verileri ayıklanır. Bireysel dalga formu için dağıtım çizimleri APD30, APD80, Nirengi (APD80— APD30) ve kesirli kısaltma ((APD80— APD30)/(APD80)) görüntülenir (Şekil 13).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig1.jpg"> Şekil 1: olgunlaşma için kriokonservirovannogo hipsc-cm ön kaplama. (A) Pre-Kaplama için hücre işleme 1 şişe 10 gün sonrası farklılaşma üzerinden Hipsc-CMS. (B) başarılı (sol) ve başarısız (sağ) hipsc kültürlerinin faz kontrast görüntüleri. Ölçek çubuğu: 275 μm. Bkz. video 1 ve video 2 başarılı 14 ve 24 gün sonrası farklılaşma kültürü örnekleri için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig2.jpg"> Şekil 2: Multiwell MEA plaka kurulumu ve hazırlanması. (A) MULTIWELL MEA plaka şemaları: plaka, 12 mikroelektrot dizileri ve 4 periferik referans elektrotları içeren 24 kuyudan (A1-D6) oluşur. Elektrot çapı: 30 μm/elektrot mesafesi: 300 μm. kayıtlar 288 elektrotlardan aynı anda elde edilebilir. (B) hipsc-cm kaplama işleminden önce sterilizasyon ve hidrofilik tedavi adımları yapılmalıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig3.jpg"> Şekil 3: hipsc-cm ayrışma ve multiwell MEA plaka kaplama. (A) her kuyu Için hipsc-cm MEA kaplama adımlarının şematikleri. (B) 4 referans elektrotlara yayılmadan tüm 12 elektrotları kaplayan doğru hücre damlacık yerleşimi gösteren mikroskobik görüntü. (C) bir örnek (sol) ve en uygun (sağ) HIPSC-cm Platting, 24 saat sonrası kaplama ile faz kontrast mikroskobik görüntüler. Ölçek çubuğu = 275 μm. Başarılı MEA kaplama örneği için video 3 ' ü görün. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig4.jpg"> Şekil 4: Multiwell-ekran edinme yazılımı. Oklar, metinde başvurulan önemli özelliklerin ve işlevlerin konumunu gösterir: sıcaklık kontrolü (1) paneli, deney boyunca gerçek zamanlı sıcaklık izlemesi sağlar. Ekle/çıkar (2) düğmesine basın ve Multiwell MEA plaka bırakın. Deneysel akış tanımla (3) işlevi, kullanıcının kaydın süresini ayarlamasına izin verir. Veri edinme kurulumu (4) işlevi, kullanıcının örnekleme hızını ve edinme filtresi ayarlarını ayarlamanızı sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig5.jpg"> Şekil 5: Hipsc-cm Elektroporasyon ve sinyal edinme . Stimulus Definition Tab, kullanıcının electroporating Pulse parametrelerini tanımlamasına olanak tanır. Stimülasyon elektrotları sekmesi, kullanıcının electroporating elektrotlar seçmesine olanak sağlar. 288 elektrotların herhangi bir kombinasyonu seçilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig5large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig6.jpg"> Şekil 6: elektrik aktivitesi Için Multiwell MEAs kalite kontrol. Optimum (A) ve alt standart (B) FP sinyallerinin temsili örnekleriyle ham veri pencereleri gösteren multiwellekran edinme yazılımı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig6large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig7.jpg"> Şekil 7: yeni ve restore edilen DIZININ FP ve AP sinyalleri. Multiwell MEA Enzimatik temizlik adımları (A). Yeni dizinin temel sinyali, en az sinyal gürültü oranı (B) ve FP sinyallerinin şebeke (C) elektrik aktivitesini gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig7large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig8.jpg"> Şekil 8: veri segmentasyon ve analiz. Dalga formu Analiziiçin GUI 'nin ana penceresinin görünümü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig8large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig9.jpg"> Şekil 9: veri segmentasyon ve analiz. Segmentasyon IÇIN AP dalga formlarını tanımlamak ve ayıklamak ve hareket potansiyeli alan ilgi alanını seçerek yakınlaştırma ve ön işleme başlamak Için dalga formları düğmesini başlatın. Kırmızı çemberler Elektroporasyon göstergeleridir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig9large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig10.jpg"> Şekil 10: veri segmentasyon ve analiz. Zirveler (kırmızı ' x ') ve dallar (sarı daireler) her dalga için algılanır ve normalleştirilmiş APs dalga formları kalite kontrol için üst üste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig10large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig11.jpg"> Şekil 11: aynı hücre sitesinden birden çok kayıt IÇIN FP SINYALINE AP genliği bağımlılığı. İki bağımsız elektrotdan kaydedilen μV aralıklardaki (a, sol üst panel) veya mV aralıkları (a, sağ üst panel) içinde FP genliği MV aralığında AP genliği üretir (a, alt sol ve sağ paneller) FP genlikleri arasında hiçbir korelasyon gösteren ve Elektroporasyon sonrası AP genlikleri. Her kayıt için normalleştirilmiş AP dalga formları, her kayıt için gösterildiği gibi üst üste eklenir. Aynı hücre sitesinin birden fazla electroporations 0 için 96 h yüksek kaliteli AP dalga formları membran elektrodinamik (B) izleme sağlayan üretilen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig11large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig12.jpg"> Şekil 12: altı restorasyondan sonra AP kayıtları. Aynı anda 12 elektrotlar arasında aynı zamanda 10 ' dan daha fazla Elektroporasyon kaydedilen AP dalga formları görüntülenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig12large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59906/59906fig13.jpg"> Şekil 13: birden çok restorasyondan APD parametre histograları. Bireysel dalga formu için dağıtım çizimleri APD30 (A), APD80 (B), Nirengi (APD80— APD30) (C) ve kesirli kısaltma ((APD80— APD30)/(APD80)) (D) görüntülenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/59906fig13large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı dosyalar. Videolar 1-3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59906/Suppl_Files.zip">Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings at JoVE.com

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Bu makale, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyosit (hiPSC-CM) ağlarının gelişimi için bir dizi protokolün yanı sıra, hücre membranı hareket potansiyeli ölçümleri için ters şekilde electroporate etmek için multiwell MEA plakaları üzerinde kültürlü bir set içerir. Yüksek verimlilik kayıtları aynı hücre sitelerinden gün içinde tekrar tekrar elde edilir.

Tekrarlayan eylem potansiyel kayıtlar için Multiwell mikro elektrot diziler üzerinde insan iPSC-türetilen Kardiyomiyoksit ağları

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Aşağıdaki protokol, çoklu mea plakaları üzerinde insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit ağlarının geliştirilmesini açıklamaktadır. Eylem potansiyeli parametreleri daha sonra elektrofizyoloji için bileşikleri test etmek için bu tepki eğrileri oluşturmak için kullanılabilir. Multiwell MEA kodlama ve hücre kaplaması özel dikkat gerektiren en zorlu adımlardır.Damlacıkların yayılmasını ve kurumasını önlemek için bu adımları özenle ve hızlı bir şekilde yerine getirilmelidir. Uygulama ile, bu kolayca aşılabilir. Biz tek segmentasyon, kalite güvencesi ve parametre çıkarma için özel bir grafik kullanıcı arayüzü geliştirdi.Sağlam MATLAB iş akışımız, büyük hacimli ham deneysel verileri hızla etkileyerek, etki potansiyeli dalga formlarının tarafsız bir gruplandırmasına dönüştürmek için uygulanmıştır. El yazması yönlere göre insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositleri eriterek başlayın. Hücre kümelerini ayrıştırmak için transfer pipetini kullanarak hücreleri yavaşça askıya alın.Daha sonra dikkatlice bir substrat kaplı altı kuyu plaka her kuyuiçine hücre süspansiyon iki mililitre dağıtmak ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit bir hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin. Hücreler jel yollarına 24 saat yapışmalı ve kaplamadan sonra 48 saat kendiliğinden çırpılmalıdır. Kaplamadan iki gün önce, 24 kuyulu çok elektrotlu dizinin veya MEA plakasının her kuyusuna 0,5 mililitre insan iPSC kardiyomiyosit kültür ortamı ekleyin ve MEA'ların kalite kontrolü olarak sinyal-gürültü oranını doğrulamak için temel bir kayıt yapın.Daha sonra, medya aspire, steril su ile kuyuları durulayın ve bir gecede bir laminar akış kaputu bir UV ışığı altında sterilize. Ertesi gün, MEA yüzeylerin hidrofilik tedavi için her kuyuya 0,1 mililitre FBS ekleyin ve 30 dakika oda sıcaklığında plaka kuluçkaya yatırın. Sonra FBS aspire ve steril su 0,5 mililitre ile her iki kez iyi durulayın.Bir gecede laminar akış kaputunda kurumaya plaka bırakın. Ertesi gün, pipet çalışan fibronektin seyreltme beş mikrolitre ve dikkatle tüm 12 elektrotlar kapsayacak şekilde her kuyunun merkezinde damlacık dağıtmak. Plakayı hemen tüm bulaşık yüzeyini kaplayacak kadar steril su içeren nemlendirici bir haznenin içine yerleştirin.Üç saat boyunca hücre kültürü kuluçka plaka ile oda yerleştirin ve daha sonra hücre kaplama ile devam edin. Kardiyomiyositleri kaplamaya hazır olduğunuzda, insan iPSC kardiyomiyosit eritme ortamda seyrelterek mikrolitre başına hücre yoğunluğunu 6.000 hücrelere ayarlayın. Hücrelerin tortulanmasıiçin hafif hareket ler kullanın.MEA plakasını laminar akış kaputuna getirin ve elektrotlara dokunmadan p10 pipetiyle fibronektin damlasını dikkatlice çıkarın. Hemen kuyunun ortasına beş mikrolitrelik bir hücre damlacığı dağıtın ve 12 elektrotun hepsini kapsamasını sağlar. Fibronektin in kuruma sını önlemek için bir seferde iyi bir şey yapın.Kaplama bittiğinde, MEA plakasını gevşek kapalı nemlendirici haznesine geri yerleştirin ve üç saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri verin. Kuluçkadan sonra, hücreleri rahatsız etmeden her kuyuya 200 mikrolitre insan iPSC kardiyomiyosit eritme ortamı nı dikkatlice eklemek için bir P200 pipetkullanın. MEA plakasını hücre kültürü kuluçka makinesine geri yerleştirin ve kaplamadan 24 saat sonra kültür ortamını değiştirin.Kardiyomiyositlerden sinyal almaya hazır olduğunuzda, satın alma yazılımını başlatın ve MEA plakasını el yazması talimatlara göre yerleştirin. Tüm kuyularda sinyali görselleştirmek ve sabit durumda sinyal kalitesini doğrulamak için Keşfet düğmesini tıklatın. Alan potansiyeline sahip elektrotlar veya milivolt aralığındaki FP sinyalleri hakkında notlar alın.Sonra keşif durdurmak için aynı düğmeye tıklayın. Bu noktaya kadar hiçbir veri kaydedilmedi. Kayda başlamak için Git düğmesini tıklatın.Her kuyudaki elektrotlar ham veri penceresinde FP sinyallerini gösterir. 30 saniye lik kayıttan sonra Uyarı düğmesine tıklayın ve elektroporasyonun seçili sitelerde 30 saniye boyunca gerçekleşmesine izin verin. Ardından simülasyonu durdurmak ve 60 saniye boyunca kaydetmeye devam etmek için aynı düğmeye tıklayın.Çeşitli alan potansiyelini ve eylem potansiyeli veri parametrelerini segmente etmek ve ayıklamak için MATLAB tabanlı özel yazılımı kullanın. İlk olarak, dalga formu analiz kodunu çalıştırın ve Dosya'ya tıklayın ve Process.h5'i seçin. Daha önce oluşturulmuş mwd'yi bulun ve seçin.h5 dosyası. Çıktı dosyalarının depolama konumunu değiştirmek için Dizin Kaydet düğmesini tıklatın. Ardından elektrot ve iyi ilgi kombinasyonlarını seçip Sıra düğmesini tıklatarak bir sinyal işleme kuyruğu oluşturun.Kuyruğa daha fazla elektrot ve kuyu kombinasyonları eklemek için bu adımı tekrarlayın. Hücreler ilaçlarla tedavi edildiyse, sıra doğrudan Med Name, Med Concentration'a tıklayarak düzenlenebilir. Kuyruk kesinleştikten sonra, sinyallerin tanımlandığı ve segmentasyon için ayıklandığı ön işleme başlayacak olan Initialize Waveforms düğmesini tıklatın.İşlem tamamlandığında, Yakınlaştır düğmesini tıklatın ve eylem potansiyelini veya AP'yi seçin. Tut düğmesini tıklatın ve panelleri gözden geçirin. Zirveler ve çukurlar her dalga formu için algılanır ve normalleştirilmiş AP'ler üst üste bindirilir.Bittiğinde, kuyruktaki bir sonraki iz için Tut düğmesini tıklatın ve elektrot ve kuyu kombinasyon sinyallerinin geri kalanı için işlemi yineleyin. Çözülen kardiyomiyositlerin canlılığı ve kaplama yoğunluğu çok well MEA kültürü için çok önemlidir. Doğru kaplama, 48 saat spontan dayak ile sağlıklı bir monolayer kültür ile sonuçlanır, kötü hücre canlılığı olmayan miyosit popülasyonların yüksek yüzdesi ile kültürlerde sonuçlanır.Hücre damlacık dağılımı kültür yoğunluğunu etkiler ve hatta hücre ölümüne yol açabilir, bu yüzden kesin hücre yerleşimi önemlidir. MEAs üzerinde kültürhücreleri kaplama sonra elektrik aktivitesi için bir kalite kontrolü tabi tutulur 48 saat. Bir ağdaki elektrotların %50'si ve toplam ağların %70'i FP sinyalleri üretmiyorsa, kültür yetersizdir.Elektroporasyon aracılı AP kayıtları mea kaplama sonrası 48 saat sonra birden çok kez elde edilebilir. Aynı hücre bölgesinin sıfır, 24, 48, 72 ve 96 saat deki çoklu elektroporasyonlarının zaman içinde AP şekli üzerinde önemli bir etkisi yoktur. Ayrıca, aynı hücre bölgesinden FP ve post elektroporasyon AP genlikleri arasında bir korelasyon gözlenmiştir.Bu yöntemin önemli bir avantajı, çok iyi MEA plakasının birden çok kez yeniden kullanılabilmesidir. Bu dizinin güvenilirliğini göstermek için, 3, 815 AP dalga formları üç restorasyon toplu luktan çıkarılır ve sonuçların tekrarlanabilirliğini incelemek için AP süresi verileri ayıklanır. İlgilendiğinde, spesifik iyonik akımların davranışını araştırmak için gen ekspresyonu, kalsiyum geçici ölçümleri ve yama kıskacı gibi ek tahliller yapmak mümkündür.Bu teknik, araştırmacıların elektrofizyolojik olgunlaşmayı geliştirmelerinin yanı sıra kardiyomiyositler üzerindeki kronik doz etkilerini taramalarının da önünü açıyor.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plazma Litografi Yüzey Desenlendirme Hücre Ağları Oluşturma

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Kulakçık ve karıncığa gelen kardiyak miyozitlerde Boru Membran Ağlarının Analizi

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Hücre-serbest Biyoloji yapışmalı femtoliter Odası Diziler

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

3D Doku mühendisliği İnsan Özofagus Mukozal Modeli Üretimi, Karakterizasyonu ve Potansiyel Kullanımları

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Micropost Diziler Kolay ve Doğru Mekanik-profil

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

IPSC türetilmiş Endotel Hücrelerinin Perfüzyonlu 3D Anjiyojenik Filizlenmesini İn Vitro Olarak İncelemek Için Standart ve Ölçeklenebilir Tsay

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Kayan Kinesin Motilite Testi Kullanılarak Çok Bileşenli Lipid Nanotüp Ağlarının Üretilmesi

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

İnsan iPSC Türevli Kardiyomiyositler, Kardiyak Fibroblastlar ve Endotel Hücreleri Kullanılarak 3D Kardiyak Mikrotissue Dizilerinin İmalatı

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...