Name: visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

نود أن ننوه بالمشورة والتوجيه من الدكتور فيتاس بيندوكاس في جامعة شيكاغو. نشكر المرفق الأساسي للمجهر الضوئي المتكامل في جامعة شيكاغو لدعمه والحفاظ على مجهر ورقة الضوء الشبكية. تم دعم هذا العمل من قبل جائزة المعاهد القومية للصحة الجديدة للمبتكر1DP2AI144245 وجائزة NSF المهنية 1653782 (إلى J.H.). يتم دعم J.R. من قبل برنامج زمالات أبحاث الدراسات العليا NSF.

5C. C7 TCR المعدلة وراثيا RAG2 بالضربة القاضية الفئران في B10. تم استخدام خلفية في هذه الدراسة وفقًا لبروتوكول وافقت عليه لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في جامعة شيكاغو.
1. حصاد وتنشيط الخلايا التائية
ملاحظة: يستند هذا الجزء من البروتوكول إلى بروتوكولات ساب...

<ol>
	<li>Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physical+Basis+of+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+(TIRF)+Microscopy+and+Its+Cellular+Applications.">The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).</li><li>Shroff, H., White, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+Localization+Microscopy+(PALM)+of+Adhesion+Complexes.">Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes.</a> Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).</li><li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level.">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li><li>Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+speed+and+resolution+of+light+microscopy.">Advances in the speed and resolution of light microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).</li><li>. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: <a target="_blank" href="https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr">https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr</a> (2019)</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. , (2014).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+natural+killer+cells+maintain+long-term+antitumor+activity+by+epigenetic+imprinting+and+CD4++T+cell+help.">Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help.</a> Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).</li><li>Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Binds+to+B7-1+Only+In+Cis+on+the+Same+Cell+Surface.">PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).</li><li>Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly49C-dependent+control+of+MCMV+Infection+by+NK+cells+is+cis-regulated+by+MHC+Class+I+molecules.">Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules.</a> PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).</li><li>Sch&#246;neberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+cell+biology:+big+data+image+analytics+and+lattice+light-sheet+imaging+reveal+dynamics+of+clathrin-mediated+endocytosis+in+stem+cell-derived+intestinal+organoids.">4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids.</a> Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), 8302 (2019).</li><li>Cai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dynamic+microvillar+search+and+stabilization+during+ligand+detection+by+T+cells.">Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells.</a> Science. 356 (6338), 3118 (2017).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+Depletion+Initiates+Events+Leading+to+Granule+Secretion+at+the+Immunological+Synapse.">Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse.</a> Immunity. , (2015).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes.">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Peptide-Major+Histocompatibility+Complex+Ligand+Triggers+Digital+Cytokine+Secretion+in+CD4++T+Cells.">A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells.</a> Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).</li><li>Jansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+framework+for+analyzing+T+cell+receptor+scanning+of+peptides.">A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides.</a> Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).</li><li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart.">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li></ol>

تم تحسين البروتوكول المقدم لاستخدام خلايا CD4+ T المعزولة من 5C. C7 الفئران المعدلة وراثيا على أداة LLSM المستخدمة، وبالتالي أنظمة الخلايا الأخرى وLLSMs قد تحتاج إلى تحسين بشكل مختلف. ومع ذلك ، يظهر هذا البروتوكول قوة التصوير 4D ، حيث يمكن استخدامه لقياس ديناميات مستقبلات السطح على خلية كاملة...

كانت الديناميكيات الدقيقة لتهريب الجزيئات ونشرها على سطح الخلية ثلاثية الأبعاد في الوقت الحقيقي لغزًا يجب حله. كان المجهر دائما ً توازناً بين السرعة والحساسية والدقة. إذا تم تكبير أي واحد أو اثنين، يتم تصغير الثالث. ولذلك، ونظرا لصغر الحجم والسرعة الهائلة التي تتحرك بها مستقبلات السطح، ظل تتبع دينامياتها يشكل تحديا تكنولوجيا رئيسيا في مجال بيولوجيا الخلايا. على سبيل المثال ، تم إجراء العديد من الدراسات باستخدام الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) المجهر1،2،3، الذي له دقة زمنية عالية ، ولكن يمكن أن صورة فقط شريحة رقيقة جدا من غشاء الخلية التائية (~ 100 نانومتر) ، وبالتالي يخطئ الأحداث التي تحدث بعيدا في الخلية. هذه الصور TIRF أيضا عرض فقط قسم ثنائي الأبعاد من الخلية. وعلى النقيض من ذلك، فإن تقنيات الدقة الفائقة، مثل المجهر المجهري لإعادة الإعمار البصري العشوائي (STORM)4،والمجهر المجهري للتعريب المُفعَّل ضوئيًا (PALM)5،والمجهر المنفّز لاستنفاد الانبعاثات (STED)6،يمكنها التغلب على حد حيود Abbe للضوء. هذه التقنيات لديها دقة مكانية عالية (~ 20 نانومتر القرار)4،5،6،7، لكنها غالبا ما تستغرق عدة دقائق للحصول على كامل ثنائي الأبعاد (2D) أو ثلاثي الأبعاد (3D) صورة ، وبالتالي يتم فقدان القرار الزمني. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون تقنيات مثل STORM و PALM التي تعتمد على إشارات وامضة غير دقيقة في عد8،9. المجهر الإلكتروني لديه حتى الآن أعلى دقة (تصل إلى 50 مساء القرار)10; حتى أنه يمكن إجراء ثلاثي الأبعاد مع شعاع أيون مركزة المسح المجهري الإلكترون (FIB-SEM)، مما أدى إلى ما يصل إلى 3 نانومتر XY و 500 نانومتر Z القرار11. ومع ذلك ، فإن أي شكل من أشكال المجهر الإلكتروني يتطلب إعداد عينة قاسية ولا يمكن إجراؤه إلا مع خلايا أو أنسجة ثابتة ، مما يلغي إمكانية تصوير العينات الحية بمرور الوقت.
تقنيات للحصول على دقة الزهوية الزمنية العالية المطلوبة لتحديد ديناميات الجزيئات السطحية وداخل الخلايا في الخلايا الحية في طبيعتها الفسيولوجية الحقيقية 3D يجري تطويرها مؤخرا. واحدة من هذه التقنيات هي Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12، والتي تستخدم ورقة ضوء منظمة لخفض التبييض الضوئي بشكل كبير. وضعت في عام 2014 من قبل الحائز على جائزة نوبل اريك Betzig، ودقة محورية عالية، انخفاض photobleaching والضوضاء الخلفية، والقدرة على صورة في وقت واحد مئات من الطائرات لكل مجال من مجالات الرؤية جعل المجاهر LLS متفوقة على widefield، TIRF والمجاهر كونكترسي12،13،14،15،16،17،19. هذه التقنية التصوير رباعية الأبعاد (س، ذ، ض والوقت)، في حين لا يزال الحيود محدودة (~ 200 نانومتر XYZ القرار)، لديه قرار زمني لا يصدق (حققنا معدل الإطار من حوالي 100 إطارا في الثانية، مما أدى إلى صورة خلية 3D أعيد بناؤها مع 0.85 ثانية لكل إطار) للحصول على المكانية 3D.
يمكن استخدام LLSM بشكل عام لتتبع ديناميكيات الوقت الحقيقي لأي جزيئات داخل أي خلية على مستوى الجزيء الواحد والخلية الواحدة ، خاصة تلك الموجودة في الخلايا عالية التفحص مثل الخلايا المناعية. على سبيل المثال، نعرض هنا كيفية استخدام LLSM لتصور ديناميات مستقبلات الخلايا التائية (TCR). الخلايا التائية هي الخلايا الفعالة في الجهاز المناعي التكيفي. TCRs هي المسؤولة عن الاعتراف ligands الببتيد-MHC (pMHC) المعروضة على سطح الخلايا المضادة (APC)، الذي يحدد اختيار، والتنمية، والتمايز، ومصير، وظيفة خلية T. يحدث هذا الاعتراف في الواجهة بين الخلايا التائية وAPCs ، مما يؤدي إلى تجميع مستقبلات موضعية لتشكيل ما يسمى المشبك المناعي. في حين أنه من المعروف أن TCRs في المشبك المناعي ضرورية لوظيفة المؤثرات الخلايا التائية، لا تزال غير معروفة هي الآليات الأساسية للاتجار TCR في الوقت الحقيقي إلى المشبك. وقد سمحت لنا LLSM لتصور في الوقت الحقيقي ديناميات TCRs قبل وبعد الاتجار إلى المشبك مع التفاعل pMHC-TCR الناتجة(الشكل 1). ولذلك يمكن استخدام LLSM لحل الأسئلة الحالية للديناميات التكوينية لـ TCRs وتوفير رؤى لفهم كيفية تميز الخلية بين المستضدات الذاتية والأجنبية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm round coverslips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>502040</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70um Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7201431</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR &#946; chain Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109215</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>X&#38;Y Cell Culture</td>
			<td>FBS-500</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Denisty gradient reagent for T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lattice Light-Sheet Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope Used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLSpy</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK</td>
			<td>Elimbio</td>
			<td>Custom Synthesis</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penacillin/Streptamycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122_3683884612</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse IL-2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0523</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slidebook</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSM imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Dissection Tools</td>
			<td>Nova-Tech International</td>
			<td>DSET10</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231710126</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44685</td>
			<td>For preparing Fab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy

يتم إملاء الإشارات ووظيفة الخلية من خلال الهياكل الديناميكية والتفاعلات لمستقبلات سطحها. لفهم العلاقة بين الهيكل والوظيفة لهذه المستقبلات في الموقع ، نحتاج إلى تصوروتتبعها على سطح الخلية الحية بدقة زمنية مكانية كافية. هنا نعرض كيفية استخدام التي تم تطويرها مؤخرا Lattice ضوء ورقة المجهر (LLSM) لصورة مستقبلات الخلايا التائية (TCRs) رباعية الأبعاد (4D، والمكان والزمان) في غشاء الخلية الحية. الخلايا التائية هي واحدة من الخلايا الفعالة الرئيسية في الجهاز المناعي التكيفي ، وهنا استخدمنا الخلايا التائية كمثال لإظهار أن إشارات ووظيفة هذه الخلايا مدفوعة بديناميكيات وتفاعلاتTCRs. LLSM يسمح للتصوير 4D مع قرار الزمانية المكانية لم يسبق لها مثيل. وبالتالي يمكن تطبيق هذه التقنية المجهرية عموما على مجموعة واسعة من الجزيئات السطحية أو داخل الخلايا من خلايا مختلفة في علم الأحياء.

هنا ، ونحن نصف العزلة ، وإعداد ، والتصوير من الماوس الأساسي 5C. C7 الخلايا T باستخدام مجهر ورقة الضوء شعرية. خلال القسم 3 ، لا بد من محاذاة المجهر بشكل صحيح ، وجمع PSF يوميًا يتم معه تخفيض البيانات بعد جمعها. في الشكل 2، نعرض صور المحاذاة الصحيحة التي سيتم رؤيتها عند محاذاة المجهر....

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار كيفية استخدام المجهر ورقة الضوء شعرية لأربعة الأبعاد تصور ديناميات مستقبلات السطح في الخلايا الحية. هنا يتم عرض مستقبلات الخلايا التائية على CD4+ الخلايا التائية الأولية.

تصور سطح T-خلية مستقبلات ديناميات رباعية الأبعاد باستخدام شعرية الضوء ورقة المجهر

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

المجهر ورقة ضوء شعرية هي تقنية التصوير قوية، ولكن مختبرات قليلة في العالم قادرة على استخدامه. هذا البروتوكول يعطي لمحة مفصلة عن كيفية استخدام المجهر ورقة ضوء شعرية المتاحة تجاريا. إنه نظام قوي للغاية قادر على التصوير رباعي الأبعاد للخلايا الفردية أو الأجنة التي تسمح بتتبع الجزيئات في الوقت الحقيقي.الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يمكن صورة ثلاثية الأبعاد خلايا حية واحدة أو أجهزة مع دقة ابصق واضاءة اضياء الصورة الحد الأدنى. نمط شعرية من ورقة الضوء يسمح لنا عينات صورة عالية السرعة والحصول على أشرطة الفيديو في الوقت الحقيقي من الخلايا الحية ثلاثية الأبعاد والأعضاء مع التفاصيل الجزيئية التي التقنيات الأخرى لا يمكن تحقيق. هذا البروتوكول الفيديو الأول تبين كيف لنا شعرية ضوء ورقة المجهرية لصورة خلية واحدة أربعة الأبعاد.هذا هو أسلوب معقد للغاية بسبب المحاذاة وإعداد العينة. ونحن نعتقد أن العرض المرئي سوف يحسن إمكانية الوصول من خلال السماح لمزيد من العلماء لتصوير العديد من الجزيئات والخلايا والأعضاء المختلفة في علم الأحياء. لبدء هذا الإجراء، احتضان خمسة ملليمتر يغطي جولة مع 0.1٪ بولي-L-ليسين في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.التعرق قبالة السائل والسماح لأغطية الهواء الجافة بشكل طبيعي. بعد ذلك، إضافة ثلاثة ملليلتر من التدرج كثافة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. إضافة بعناية الخلايا قطرة الحكمة إلى حافة الأنبوب.أجهزة الطرد المركزي في 930 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة الطبقة الوسطى الرقيقة من الخلايا بين الوسائط الكاملة ومُكشف التدرج في الكثافة مع التأكد من وضع كل نوع خلية في أنبوب مخروطي منفصل. جهاز طرد مركزي في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق لغسل الخلايا.تجاهل افراط وإضافة خمسة ملليلتر من RPMI إلى أنابيب الخلايا التائية وخلايا CH27. كرر الغسيل مع RPMI الطازجة حتى يتم إجراء ثلاثة يغسل مجموع. ثم، resuspend الخلايا في كل أنبوب مع ملليلتر واحد من دورة في الدقيقة كاملة وعد الخلايا مع قياس الهيموسيت.Resuspend مليون الخلايا المستضد في 500 microliters من دورة في الدقيقة كاملة وإضافة 10 MICROMOLAR MCC. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات. بعد ذلك، resuspend مليون الخلايا التائية في 500 ميكرولترات من دورة في الدقيقة كاملة.إضافة اثنين من ميكروغرام من المضادة TCR بيتا اليكسا 488 المسمى FAB واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، الطرد المركزي كلا الخلايا في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق والتخلص من الفائق. إضافة 500 ميكرولترات من دورة في الدقيقة كاملة وكرر الطرد المركزي لغسل الخلايا.كرر الغسيل مع RPMI الطازجة حتى تم تنفيذ ثلاثة يغسل مجموع التخلص من افرثال بعد كل غسل. بعد ذلك، إعادة إنشاء كلا النوعين الخلية في 500 ميكرولترات من وسائل الإعلام التصوير. أولا، إضافة 10 ملليلتر من الماء و 30 ميكرولترات من الفلورسين إلى حمام LLSM.اضغط على صورة الصفحة الرئيسية لنقل الكائن إلى موضع الصورة وننظر في نمط شعاع ليزر بسل واحد. محاذاة شعاع الليزر باستخدام دليل والمنطقة مسبقا من الفائدة لجعل شعاع نمط رقيقة متوازنة في جميع الاتجاهات. يجب أن تظهر الشعاع أيضا مركزة في الكاميرا مكتشف.استخدام اثنين من ضبط الميل المرآة، والميمتر التركيز العلوي، واللون الهدف لضبط شعاع. بعد ذلك، قم بغسل الحمام والأهداف مع ما لا يقل عن 200 ملليلتر من الماء لإزالة أي فلوريسين تماما. لصورة حبات الفلورسنت القياسية، قم بتشغيل ثبات التردد عن طريق الإعداد إلى ثلاثة في مربع نطاق Xgalvo واضغط Live لعرض الحقل الحالي.ضبط مرآة الإمالة، واللون الموضوعي، ومقياس التركيز يدوياً للحصول على أعلى القيم الرمادية. ثم، ضبط حسب الضرورة للحصول على أنماط مناسبة لمسح الهدف، Z galvo، Z زائد الهدف، ووضع العينة التقاط المسح الضوئي. بعد ذلك، اضغط على تنفيذ في وضع المسح الضوئي العينة لجمع وظيفة انتشار نقطة العينة ل de-skewing و de-convolution.تغيير الليزر إلى وضع الألوان الثلاثة واضغط على تنفيذ مرة أخرى. للبدء، إضافة 100،000 الخلايا المضادة لتقديم إلى أغطية دائرية معدة قطرها خمسة ملليمتر والسماح لهم لتسوية لمدة 10 دقائق. الشحوم حامل العينة وإضافة غطاء إلى أنها الجانب الخلية لأعلى.بعد ذلك، أضف قطرة من وسائط التصوير إلى الجزء الخلفي من الغطاء. المسمار حامل عينة على بيزو واضغط على الصفحة الرئيسية الصورة. العثور على خلية مستضد تقديم للصورة والتأكد من أن برنامج التصوير والي إم تعمل بشكل صحيح.اضغط على Live لعرض الصورة الحالية. التحرك على طول Z للعثور على غطاء والخلايا. ابحث عن مركز خلية تقديم مستضد من خلال الانتقال في اتجاه Z، ثم اضغط على إيقاف لإيقاف الليزر.تحقق من 3D وإدخال الإعدادات المطلوبة. مركز الصحافة ثم اضغط على تنفيذ لجمع البيانات. خفض المرحلة إلى موقف تحميل وإضافة 50 ميكرولترات من الخلايا التائية والتصوير وسائل الإعلام قطرة الحكمة مباشرة على غطاء.فمن الأفضل للسماح نموذج قطرة على نهاية طرف ماصة ومن ثم لمس طرف إلى سائل الحمام. رفع المرحلة مرة أخرى عن طريق النقر على عودة الصورة. ابدأ التصوير.تأكد من تعيين التكديس Z المطلوب وطول فترة المهلة. على سبيل المثال، الصورة 60 Z مكدسات في حجم خطوة ميكرومتر 0.4 و 500 إدخال الأطر الزمنية. توقف عن التسجيل قبل الوصول إلى 500 إطار لتجنب تبييض الصور.استخدام الوضع المباشر للبحث عن أزواج الخلايا وعندما تم إدخال الإعدادات الجاهزة والمطلوبة، اضغط على تنفيذ لجمع البيانات. في هذه الدراسة، يتم عزل الماوس الأساسي 5CC7 الخلايا التائية وإعدادها ثم يتم تصويرها باستخدام مجهر ورقة الضوء شعرية. يظهر هنا مسار الحزمة الصحيح ومحاذاة الشعاع عند تصويرها بالفلورسين.يجب أن يظهر الفحص الهدف شكل X كبير في إسقاط XZ و YZ متماثل قدر الإمكان. كما ينبغي تعديلها لتكون صغيرة من X قدر الإمكان. يجب أن يظهر مسح Z galvo بيضاويًا في XZ و XY مع نقطة واحدة على كلا الجانبين.وأخيراً، يجب أن يظهر كل من المسح الضوئي الهدف Z بالإضافة إلى مسح العينة النقاط التي تبدو مستديرة قدر الإمكان. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن رؤية الديناميكيات رباعية الأبعاد لمستقبلات الخلايا التى على سطح الخلية التى. الميزة الرئيسية لهذا المجهر تكمن في القدرة على تتبع وحدات السطح المرئية لمستقبلات الخلية T والحصول على بيانات كمية من حجمها ، والحركة ، وكثافة الإشارة ، والإفرازات.أهم شيء يجب أن نتذكره هو جودة محاذاتك. يجب أن تكون ورقة ضوء شعرية محاذاة يوميا وعدم القيام بذلك بشكل صحيح سيؤدي إلى التصوير المشوه. وبالمثل ، فإن نوعية PSF التي تم جمعها تؤثر بشكل مباشر على جودة de-convolution الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى جودة صورتك النهائية.أحد الأسباب التي تجعل هذه الطريقة قوية للغاية لأنه يمكن استبدال كل خلية وتسمية لتصور العديد من أنواع الخلايا والجزيئات. لذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على أي سؤال يتعلق بتتبع الجزيئات رباعية الأبعاد. ونعتقد أن هذه التقنية ستمهد الطريق أمام الباحثين لاستكشاف أسئلة جديدة في مجال الاتجار الجزيئي.لم يتم استخدامه على نطاق واسع بعد بسبب النظام المعقد لذلك نحن نأمل أن يؤدي هذا الفيديو جوف تحسين إمكانية الوصول إلى هذه التقنية. الليزر المستخدمة على النظام هي الفئة الرابعة لذلك يجب توخي الحذر المطلق لضمان سلامة الليزر. يرجى أخذ التدريب اللازم لسلامة الليزر قبل استخدام هذه الطريقة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

سبر بنية وديناميات Nucleosomes استخدام Imaging مجهر القوة الذرية

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

فحص Phytoestrogens باستخدام مستقبلات الاستروجين القائم على الخلية β مراسل Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

مراقبة ديناميكيات تفاعل البروتين والحمض النووي الريبي في الجسم الحي بدقة زمنية عالية باستخدام χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

تصور ديناميات الانتشار من نانورود الذهب على غشاء الخلية باستخدام جسيمات نانوية واحدة Darkfield المجهرية

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

القياس الكمي لتوزيع الجليكوجين تحت الخلوي في ألياف العضلات الهيكلية باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

التصور المتزامن لديناميكيات الأنابيب الدقيقة المتقاطعة والمفردة في المختبر بواسطة مجهر TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

استخدام الموائع الدقيقة والمجهر الفلوري لدراسة ديناميكيات تجميع خيوط وحزم الأكتين المفردة

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...