Name: visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00
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我们要感谢芝加哥大学的维塔斯·宾多卡博士的建议和指导。我们感谢芝加哥大学综合光显微镜核心设施支持和维护晶格光片显微镜。这项工作得到了NIH新创新者奖1DP2AI144245和NSF职业奖1653782（至J.H.）的支持。J.R.由NSF研究生研究奖学金计划支持。

5C.C7 TCR-转基因RAG2敲除小鼠在B10。根据芝加哥大学机构动物护理和使用委员会批准的协议，在这项研究中使用了背景。
1. 收获和激活T细胞
注： 协议的这一部分基于以前的协议。有关更多详情20，21， 请参阅引文。
<ol><li>安乐死一个10-12周老的5C。C7 转基因小鼠的两个性别 （+20-25 g） 根据批准的 IACUC 协议 （即 ...

<ol>
	<li>Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physical+Basis+of+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+(TIRF)+Microscopy+and+Its+Cellular+Applications.">The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Binds+to+B7-1+Only+In+Cis+on+the+Same+Cell+Surface.">PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).</li><li>Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+Depletion+Initiates+Events+Leading+to+Granule+Secretion+at+the+Immunological+Synapse.">Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse.</a> Immunity. , (2015).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes.">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Peptide-Major+Histocompatibility+Complex+Ligand+Triggers+Digital+Cytokine+Secretion+in+CD4++T+Cells.">A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells.</a> Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).</li><li>Jansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+framework+for+analyzing+T+cell+receptor+scanning+of+peptides.">A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides.</a> Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).</li><li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart.">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li></ol>

针对从5C分离的CD4+ T细胞的使用，对所呈现的协议进行了优化。C7转基因小鼠在LLSM仪器上使用，因此其他细胞系统和LLSM可能需要以不同的方式优化。然而，该协议显示了4D成像的力量，因为它可以用来量化整个细胞表面受体的动态，在生理条件中失真最小。因此，这种技术有许多可能的未来应用。
关键步骤是允许细胞以适当的浓度沉降。如果太多的 APC 在盖玻上安顿?...

分子在三维细胞表面实时贩运和扩散的精确动力学是一个需要解决的难题。显微镜一直是速度、灵敏度和分辨率的平衡;如果任何一个或两个最大化，第三个最小化。因此，由于表面受体移动的体积小、速度极快，跟踪其动力学仍然是细胞生物学领域的一项重大技术挑战。例如，许多研究都是使用总内部反射荧光（TIRF）显微镜1，2，3，具有高时间分辨率，但只能成像T细胞膜（+100nm）的非常薄的切片，因此错过了在细胞更远发生的事件。这些 TIRF 图像也只显示细胞的二维部分。相比之下，超分辨率技术，如随机光学重建显微镜（STORM）4、光活化定位显微镜（PALM）5和刺激发射损耗显微镜（STED）6，可以克服Abbe衍射光极限。这些技术具有高空间分辨率（+20 nm分辨率）4，5，6，7，但它们通常需要几分钟才能获得完整的二维（2D）或三维（3D）图像，因此时间分辨率会丢失。此外，像STORM和PALM这样的依赖闪烁信号的技术在计数8、9中可能有不准确之处。电子显微镜具有迄今为止最高的分辨率（高达50pm分辨率）10;它甚至可以进行三维与聚焦的电束扫描电子显微镜（FIB-SEM），导致高达3纳米XY和500纳米Z分辨率11。然而，任何形式的电子显微镜都需要严酷的样品制备，只能用固定细胞或组织进行，从而消除了随时间而成像活样本的可能性。
获得识别活细胞中表面和细胞内分子动力学所需的高时空分辨率的技术，在真正的生理三维性质中，最近才得到开发。其中一种技术是莱迪思光片显微镜（LLSM）12，它利用结构化的光片来大大降低光漂白。由诺贝尔奖获得者Eric Betzig于2014年开发，高轴向分辨率，低光漂白和背景噪声，并能同时成像数百平面每个视场，使LLS显微镜优于宽场，TIRF和共聚焦显微镜12，13，14，15，16，17，18，19。这种四维（x、y、z 和时间）成像技术虽然仍然衍射受限（±200 nm XYZ 分辨率），但具有令人难以置信的时间分辨率（我们实现了约 100 fps 的帧速率，从而为 3D 空间采集构建了 0.85 秒的 3D 重建单元图像）。
LLSM通常用于跟踪单分子和单细胞水平下任何细胞内任何分子的实时动态，尤其是高活动细胞（如免疫细胞）中的分子。例如，我们在这里演示如何使用 LLSM 来可视化 T 细胞受体 （TCR） 动力学。T细胞是适应性免疫系统的效应细胞。TDR 负责识别抗原呈现细胞 （APC） 表面显示的肽-MHC （pMHC） 配体，它确定 T 细胞的选择、发育、分化、命运和功能。这种识别发生在T细胞和APC之间的接口，导致局部受体聚类形成所谓的免疫突触。虽然众所周知，免疫突触中的 TCR 对于 T 细胞效应器功能至关重要，但仍然未知实时 TCR 贩运到突触的基本机制。LLSM 使我们能够通过产生的 pMHC-TCR 交互作用实时可视化 TDR 在贩运到突触之前和之后的动态（图 1）。因此，LLSM可用于解决TDR形成动力学的当前问题，并提供见解，以了解细胞如何区分自身和外来抗原。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm round coverslips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>502040</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70um Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7201431</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR &#946; chain Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109215</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>X&#38;Y Cell Culture</td>
			<td>FBS-500</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Denisty gradient reagent for T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lattice Light-Sheet Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope Used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLSpy</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK</td>
			<td>Elimbio</td>
			<td>Custom Synthesis</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penacillin/Streptamycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122_3683884612</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse IL-2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0523</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slidebook</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSM imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Dissection Tools</td>
			<td>Nova-Tech International</td>
			<td>DSET10</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231710126</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44685</td>
			<td>For preparing Fab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy

细胞的信号和功能由其表面受体的动态结构和相互作用决定。为了真正了解这些受体在原位的结构-功能关系，我们需要在具有足够时空分辨率的活细胞表面可视化和跟踪它们。在这里，我们展示如何使用最近开发的莱迪思光片显微镜（LLSM）在活细胞膜上以四维（4D、空间和时间）成像T细胞受体（TDR）。T细胞是自适应免疫系统的主要效应细胞之一，在这里，我们以T细胞为例，表明这些细胞的信号和功能是由TDR的动态和相互作用驱动的。LLSM 允许以前所未有的时空分辨率进行 4D 成像。因此，这种显微镜技术通常可以应用于生物学中不同细胞的多种表面或细胞内分子。

在这里，我们描述了主鼠标5C的隔离、制备和成像。C7 T细胞使用晶格光片显微镜。在第 3 节中，必须正确对齐显微镜，并每天收集 PSF，以便收集后对数据进行分批。在图2中，我们显示了校准显微镜时将看到的正确对齐图像。图 2A和图 2B显示了在荧光中成像时分别正确的光束路径和光束对齐。目标扫描应?...

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Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

该协议的目的是演示如何使用莱迪思光片显微镜对活细胞中的四维可视化表面受体动力学进行可视化。这里显示了CD4+初级T细胞上的T细胞受体。

使用莱迪思光片显微镜可视化表面 T-Cell 受体动力学四维

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

莱迪思光片显微镜是一种强大的成像技术，但世界上很少有实验室能够使用它。该协议详细介绍了如何使用市售的晶格光片显微镜。这是一个极其强大的系统，能够对单个细胞或胚胎进行四维成像，能够实时跟踪分子。该技术的主要优点是，它可以以高时空分辨率和最小的光漂白对单个活细胞或器官进行三维成像。光片的晶格模式使我们能够高速图像样本，并获取具有其他技术无法实现的三维活细胞和器官的实时视频。这第一个视频协议，显示如何格子光片显微镜图像单细胞四维。由于对齐和样品制备，这是一项非常复杂的技术。我们相信，视觉演示将提高可访问性，让更多的科学家在生物学中对许多不同的分子、细胞和器官进行成像。为了开始这个程序，在室温下孵育5毫米圆形盖玻片，用0.1%聚-L-莱辛孵育10分钟。吸走液体，让盖玻片自然干燥。接下来，在 15 毫升锥形管中加入三毫升密度梯度。小心地将细胞滴到管的边缘。在930倍g和4摄氏度的离心机10分钟。在此之后，小心地去除完整介质和密度梯度试剂之间的薄中间层细胞，确保将每种细胞类型放入单独的锥形管中。在300次g下离心5分钟清洗细胞。丢弃上流水，在T细胞和CH27细胞的管中加入5毫升的RPMI。使用新鲜 RPMI 重复洗涤，直到执行三次总洗涤。然后，用一毫升完整的RPMI重新暂停每个管中的细胞，然后用血细胞计对细胞进行计数。在500微升完整的RPMI中重新增加100万抗原呈现细胞，并加入10微摩尔MCC。在37摄氏度下孵育，用5%的二氧化碳孵育3小时。在此之后，在 500 微升完整 RPMI 中重新发送 100 万个 T 细胞。加入两微克的抗 TCR 测试版 Alexa 488 标记 FAB，并在 37 摄氏度下孵育 5%二氧化碳 30 分钟。接下来，将两个细胞在300倍g下离心5分钟，然后丢弃上一代。添加 500 微升完整的 RPMI，并重复离心机清洗细胞。使用新鲜的 RPMI 重复洗涤，直到每次洗涤后进行三次总洗涤，然后丢弃上经液。在此之后，在 500 微升成像介质中重新发送两种细胞类型。首先，在 LLSM 浴池中加入 10 毫升水和 30 微升荧光素。按"图像主页"可将对象移动到图像位置，并查看单个贝塞尔激光束图案。使用参考线和预设感兴趣区域对齐激光束，使光束成为在所有方向上平衡的薄型。光束还应在查找器摄像机中聚焦。使用两个镜面倾斜调节器、顶部对焦千分尺和目标颜色来调节光束。接下来，用至少200毫升的水洗洗浴缸和目标，以完全去除任何荧光素。要对标准荧光珠进行图像成像，请通过在 Xgalvo 范围框中设置为 3 来打开抖动，然后按 Live 查看当前字段。手动调整倾斜镜、目标颜色和焦点千分尺，以达到最高的灰色值。然后，根据需要进行调整，以获得目标扫描、Z galvo、Z 加目标和样本扫描捕获模式的正确模式。在此之后，按"在样本扫描模式下执行"以收集样本点分布函数，以进行去倾斜和去卷积。将激光更改为三种颜色模式，然后再次按"执行"。首先，在准备好的5毫米直径的圆形盖玻片中加入10万个抗呈现细胞，让它们沉淀10分钟。润滑样品架，并将盖玻片向上添加到其细胞侧。接下来，在盖玻片的背面添加一滴成像介质。将样品架拧到压电器上，然后按图像主页。查找抗原呈现细胞以进行图像，并确保 LLSM 和成像软件正常运行。按"实时"以查看当前图像。沿 Z 移动以查找盖玻片和单元格。通过向 Z 方向移动找到抗原呈现细胞的中心，然后按"停止"暂停激光。检查 3D 并输入所需的设置。按"中"，然后按"执行"以收集数据。将舞台降到负载位置，并直接在盖玻片上添加 50 微升的 T 细胞和成像介质。最好让滴在移液器尖端的末端，然后触摸浴液的尖端。单击"图像返回"将舞台升起。开始成像。确保设置所需的 Z 堆栈和延时长度。例如，图像 60 Z 堆栈的步长为 0.4 微米，并输入 500 个时间帧。在达到 500 帧之前停止录制，以避免照片漂白。使用实时模式搜索单元格对，当输入就绪和所需的设置时，按"执行"以收集数据。在这项研究中，原发性小鼠5CC7 T细胞被分离和准备，然后使用晶格光片显微镜进行成像。此处显示使用荧光素成像时，正确的光束路径和光束对齐。目标扫描应在 XZ 和 YZ 投影中显示尽可能对称的大 X 形状。它们也应该调整为尽可能小的 X。Z galvo 扫描应显示 XZ 和 XY 中的椭圆形，两侧都显示单点。最后，Z 加目标扫描和样本扫描都应显示看起来尽可能圆的点。利用该协议，可以看到T细胞表面T细胞受体的四维动力学。这种显微镜的主要优点在于能够跟踪T细胞受体的可视化表面单位，并可以从其大小、运动、信号强度和排泄物获取量化数据。要记住的最重要的事情是对齐的质量。晶格光片必须每天对齐，如果这样做不当将导致成像失真。同样，收集的PSF质量直接影响去卷积的质量，最终导致最终图像的质量。这种方法之所以如此强大，其中一个原因就是每个细胞和标签都可以被替换，以可视化许多细胞类型和分子。因此，此方法可用于回答与分子的四维跟踪相关的任何问题。我们认为，这项技术将为研究人员探索分子贩运领域的新问题铺平道路。由于复杂的系统，它还没有被广泛使用，所以我们希望这个Jove视频将提高对技术的可访问性。系统中使用的激光器为四级，因此必须绝对小心，以确保激光安全。在使用此方法之前，请进行必要的激光安全培训。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

低亲和力受体-配体相互作用的细胞外蛋白微阵列技术

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

科研

生物化学

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

原子力显微镜成像在核细胞结构和动力学研究中的应用

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

使用多路复用共免疫沉淀对蛋白质相互作用网络动力学进行量化

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

生产用于单分子观察的DNA折纸纳米结构的Dynein和Kinesin电机组合

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

使用基于细胞的雌激素受体对植物雌激素进行筛查β记者分析

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

使用χCRAC以高时间分辨率监测体内蛋白质-RNA相互作用动力学

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

使用单纳米粒子暗场显微镜可视化细胞膜上金纳米棒的扩散动力学

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

使用透射电子显微镜定量骨骼肌纤维中的亚细胞糖原分布

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

通过TIRF显微镜 在体外 同时可视化交联和单微管的动力学

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

利用微流体和荧光显微镜研究单根肌动蛋白丝和束的组装动力学

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...