Name: visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende råd og vejledning fra Dr. Vytas Bindokas ved University of Chicago. Vi takker den integrerede Lysmikroskop kernefacilitet ved University of Chicago for at støtte og vedligeholde gitterets lysplademikroskop. Dette arbejde blev støttet af NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 og NSF Career Award 1653782 (Til J.H.). J.R. støttes af NSF Graduate Research Fellowships Program.

5C. C7 TCR-transgene RAG2 knockout mus i B10. En baggrund blev brugt i denne undersøgelse i henhold til en protokol godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee fra University of Chicago.
1. Høst og aktivér T-celler
BEMÆRK: Denne del af protokollen er baseret på tidligere protokoller. Se citater for yderligere detaljer20,21.
<ol><li>Euthanize en 10-12 uger gammel 5C. C7 transgene mus af beg...

<ol>
	<li>Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physical+Basis+of+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+(TIRF)+Microscopy+and+Its+Cellular+Applications.">The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).</li><li>Shroff, H., White, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+Localization+Microscopy+(PALM)+of+Adhesion+Complexes.">Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes.</a> Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).</li><li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level.">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li><li>Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+speed+and+resolution+of+light+microscopy.">Advances in the speed and resolution of light microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).</li><li>. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: <a target="_blank" href="https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr">https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr</a> (2019)</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. , (2014).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+natural+killer+cells+maintain+long-term+antitumor+activity+by+epigenetic+imprinting+and+CD4++T+cell+help.">Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help.</a> Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).</li><li>Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Binds+to+B7-1+Only+In+Cis+on+the+Same+Cell+Surface.">PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).</li><li>Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly49C-dependent+control+of+MCMV+Infection+by+NK+cells+is+cis-regulated+by+MHC+Class+I+molecules.">Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules.</a> PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).</li><li>Sch&#246;neberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+cell+biology:+big+data+image+analytics+and+lattice+light-sheet+imaging+reveal+dynamics+of+clathrin-mediated+endocytosis+in+stem+cell-derived+intestinal+organoids.">4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids.</a> Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), 8302 (2019).</li><li>Cai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dynamic+microvillar+search+and+stabilization+during+ligand+detection+by+T+cells.">Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells.</a> Science. 356 (6338), 3118 (2017).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+Depletion+Initiates+Events+Leading+to+Granule+Secretion+at+the+Immunological+Synapse.">Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse.</a> Immunity. , (2015).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes.">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Peptide-Major+Histocompatibility+Complex+Ligand+Triggers+Digital+Cytokine+Secretion+in+CD4++T+Cells.">A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells.</a> Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).</li><li>Jansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+framework+for+analyzing+T+cell+receptor+scanning+of+peptides.">A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides.</a> Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).</li><li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart.">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li></ol>

Den præsenterede protokol blev optimeret til brug af CD4+ T-celler isoleret fra 5C. C7 transgene mus på det anvendte LLSM-instrument, og derfor kan det være nødvendigt at optimere andre cellesystemer og LLSM'er forskelligt. Denne protokol viser imidlertid styrken ved 4D-billeddannelse, da den kan bruges til at kvantificere dynamikken i en overfladereceptor på en hel celle med mindst forvrængning under fysiologiske forhold. Derfor er der mange mulige fremtidige anvendelser af denne teknik.
<p class="j...

Den præcise dynamik molekyler handel og sprede på de tre-dimensionelle celle overflade i realtid har været en gåde at løse. Mikroskopi har altid været en balance mellem hastighed, følsomhed og opløsning; hvis en eller to er maksimeret, minimeres den tredje. Derfor, på grund af den lille størrelse og enorme hastighed, hvormed overfladen receptorer flytte, sporing deres dynamik har været en stor teknologisk udfordring for området cellebiologi. For eksempel er mange undersøgelser blevet udført ved hjælp af total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi1,2,3, som har høj tidsmæssig opløsning, men kan kun billedet en meget tynd skive af T-cellemembranen (~ 100 nm), og derfor savner begivenheder sker længere væk i cellen. Disse TIRF billeder viser også kun en to-dimensionel del af cellen. Derimod kan superopløsningsteknikker, såsom stokastiske optiske rekonstruktionsmikroskopi (STORM)4, fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi (PALM)5og stimuleret emissionsnedbrydelsesmikroskopi (STED)6, overvinde Abbe diffraktionsgrænsen for lys. Disse teknikker har høj rumlig opløsning (~ 20 nm opløsning)4,5,6,7, men de ofte tager mange minutter at erhverve en fuld to-dimensionelle (2D) eller tre-dimensionelle (3D) billede, og derfor den tidsmæssige opløsning er tabt. Desuden kan teknikker som STORM og PALM, der er afhængige af blinkende signaler, have unøjagtigheder ioptællingen af 8,9. Elektronmikroskopi har langt den højeste opløsning (op til 50 pm opløsning)10; det kan endda udføres tredimensionelt med fokuseret ionstråle scanning elektron mikroskopi (FIB-SEM), hvilket resulterer i op til 3 nm XY og 500 nm Z opløsning11. Enhver form for elektronmikroskopi kræver imidlertid barske prøveforberedelse og kan kun udføres med faste celler eller væv, hvilket eliminerer muligheden for billeddannelse levende prøver over tid.
Teknikker til at opnå den høje spatiotemporal opløsning, der kræves for at identificere dynamikken i overflade og intracellulære molekyler i levende celler i deres sande fysiologiske 3D natur er først for nylig udviklet. En af disse teknikker er Lattice Light-Sheet Mikroskopi (LLSM)12, som udnytter en struktureret lysplade til drastisk lavere fotoblegning. Udviklet i 2014 af Nobelprismodtageren Eric Betzig, den høje aksiale opløsning, lav fotoblegning og baggrundsstøj, og evne til samtidig at billedet hundredvis af fly pr synsfelt gøre LLS mikroskoper overlegen i forhold til widefield, TIRF og konfokale mikroskoper12,13,14,15,16,17,18,19. Denne fire-dimensionelle (x, y, z og tid) billeddannelse teknik, mens der stadig diffraktion begrænset (~ 200 nm XYZ opløsning), har utrolige tidsmæssige opløsning (vi har opnået en frame rate på omkring 100 fps, hvilket resulterer i en 3D rekonstrueret cellebillede med 0,85 sekunder per ramme) for 3D rumlig erhvervelse.
LLSM kan generelt bruges til at spore real-time dynamik af alle molekyler i enhver celle på enkelt-molekyle og encellede niveau, især dem i stærkt motile celler såsom immunceller. For eksempel viser vi her, hvordan man bruger LLSM til at visualisere T-celle receptor (TCR) dynamik. T celler er effektor celler i adaptive immunsystem. TCR'er er ansvarlige for at genkende peptid-MHC (pMHC) ligands vises på overfladen af antigen-præsentere celler (APC), som bestemmer udvælgelse, udvikling, differentiering, skæbne, og funktion af en T-celle. Denne anerkendelse sker på grænsefladen mellem T-celler og APC'er, hvilket resulterer i lokaliseret receptorklyngedannelse for at danne det, der kaldes den immunologiske synaps. Selv om det er kendt, at TCR'er ved den immunologiske synaps er afgørende for T-celle effektor funktion, stadig ukendt er de underliggende mekanismer i realtid TCR menneskehandel til synapsen. LLSM har tilladt os at visualisere i realtid dynamikken i TCR'er før og efter menneskehandel til synapsen med den resulterende pMHC-TCR interaktion(Figur 1). LLSM kan derfor bruges til at løse aktuelle spørgsmål om de tcrs formative dynamik og give indsigt til at forstå, hvordan en celle skelner mellem selv- og udenlandske antigener.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm round coverslips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>502040</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70um Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7201431</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR &#946; chain Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109215</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>X&#38;Y Cell Culture</td>
			<td>FBS-500</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Denisty gradient reagent for T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lattice Light-Sheet Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope Used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLSpy</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK</td>
			<td>Elimbio</td>
			<td>Custom Synthesis</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penacillin/Streptamycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122_3683884612</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse IL-2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0523</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slidebook</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSM imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Dissection Tools</td>
			<td>Nova-Tech International</td>
			<td>DSET10</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231710126</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44685</td>
			<td>For preparing Fab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy

Signalning og funktion af en celle er dikteret af de dynamiske strukturer og interaktioner af dens overflade receptorer. For virkelig at forstå strukturen-funktion forholdet mellem disse receptorer in situ, vi nødt til at visualisere og spore dem på levende celle overflade med nok spatiotemporal opløsning. Her viser vi, hvordan man bruger nyligt udviklede Lattice Light-Sheet Mikroskopi (LLSM) til billede T-celle receptorer (THRs) fire-dimensionelt (4D, rum og tid) på levende celle membran. T celler er en af de vigtigste effektor celler i adaptive immunsystem, og her brugte vi T celler som et eksempel for at vise, at signalering og funktion af disse celler er drevet af dynamikken og samspillet mellem THR'er. LLSM giver mulighed for 4D-billeddannelse med hidtil uset spatiotemporal opløsning. Denne mikroskopi teknik kan derfor generelt anvendes på en bred vifte af overflade eller intracellulære molekyler af forskellige celler i biologi.

Her beskriver vi isolering, forberedelse og billeddannelse af primær mus 5C. C7 T celler ved hjælp af en gitter lysplade mikroskop. I afsnit 3 er det bydende nødvendigt at justere mikroskopet korrekt og indsamle polyesterbrug dagligt, som dataene kan afgrænses efter indsamlingen. I figur 2viser vi de korrekte justeringsbilleder, der vil blive set, når mikroskopet justeres. Figur 2A og figur 2B ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Målet med denne protokol er at vise, hvordan man bruger Lattice Light-Sheet Mikroskopi til firedimensionelt visualisere overflade receptor dynamik i levende celler. Her vises T-cellereceptorer på CD4+ primære T-celler.

Visualisere Surface T-Cell Receptor Dynamics Fire-Dimensionelt Ved hjælp af gitter light-sheet mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Lattice lys-ark mikroskopi er en kraftfuld billedbehandling teknologi, men kun få laboratorier i verden er i stand til at bruge det. Denne protokol giver et detaljeret overblik over, hvordan du bruger det kommercielt tilgængelige gitters lysarkmikroskop. Det er et ekstremt kraftfuldt system i stand til fire-dimensionelle billeddannelse af individuelle celler eller embryoner, der giver mulighed for real-time sporing af molekyler.Den største fordel ved denne teknik er, at det kan tre-dimensionelt billede enkelt levende celler eller organer med høj spatiotemporal opløsning og minimal foto blegning. Gittermønsteret i lysarket giver os mulighed for at højhastighedstog billedprøver og få real-time videoer af tre-dimensionelle levende celler og organer med molekylære detaljer, som andre teknikker ikke kan opnå. Denne første video protokol, der viser, hvordan vi gitter lys-ark mikroskopi til billedet enkelt celle firedimensionelt.Dette er en meget kompliceret teknik på grund af tilpasning og prøve forberedelse. Og vi mener, at visuel demonstration vil forbedre tilgængeligheden ved at give flere forskere mulighed for at forestille sig mange forskellige molekyler, celler og organer i biologi. For at begynde denne procedure, inkubere fem millimeter runde coverslips med 0,1% poly-L-lysin ved stuetemperatur i 10 minutter.Aspirate off væsken og lad coverslips lufttørre naturligt. Dernæst tilsættes tre milliliter tæthed gradient til en 15 milliliter konisk rør. Tilsæt forsigtigt celler drop-wise til kanten af røret.Centrifuge ved 930 gange g og ved fire grader Celsius i 10 minutter. Derefter fjernes det tynde midterste lag af celler mellem det komplette medie og detsitetsgradient reagensen og sørg for at sætte hver celletype i et separat konisk rør. Centrifuge ved 300 gange g i fem minutter for at vaske cellerne.Kassér supernatanten og tilsæt fem milliliter RPMI til rør af T-celler og CH27 celler. Vasken gentages med frisk RPMI, indtil der er udført tre vaske i alt. Derefter resuspenderede cellerne i hvert rør med en milliliter komplet RPMI og tælle cellerne med et hæmocytometer.Resuspend en million antigen-præsentere celler i 500 mikroliter af komplet RPMI og tilsæt 10 mikromolar MCC. Inkubere ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i tre timer. Derefter opsender resuspend en million T-celler i 500 mikroliter af komplet RPMI.Tilføj to mikrogram anti-TCR beta Alexa 488 mærket FAB og inkubere ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 30 minutter. Dernæst centrifuge begge celler ved 300 gange g i fem minutter og kassér supernatanten. Tilsæt 500 mikroliter af komplet RPMI og gentag centrifugen for at vaske cellerne.Vasken gentages med frisk RPMI, indtil der er udført tre vaske i alt, som kasseres supernatanten efter hver vask. Derefter skal begge celletyper resuspeneres i 500 mikroliter billedmedier. Først tilsættes 10 milliliter vand og 30 mikroliter fluorescein til LLSM badet.Tryk på Image Home for at flytte objektet til billedposition og se på et enkelt Bessel-laserstrålemønster. Juster laserstrålen ved hjælp af styrestyret og det forudindstillede område af interesse for at gøre strålen til et tyndt mønster, der er afbalanceret i alle retninger. Strålen skal også vises fokuseret i finderen kameraet.Brug de to spejl tilt justeringsankere, det øverste fokus mikrometer, og den objektive farve til at justere strålen. Dernæst vaske badet og målene med mindst 200 milliliter vand til helt at fjerne eventuelle fluorescein. Hvis du vil afbilde standardlysstofrør, skal du slå rastersimuleringsværktøjet til ved at indstille til tre i Xgalvo-områdeboksen og trykke på Live for at få vist det aktuelle felt.Juster tiltspejlet, målfarven og fokusmikrometeret manuelt for de højeste grå værdier. Derefter justeres efter behov for at opnå korrekte mønstre for objektiv scanning, Z galvo, Z plus mål, og prøve scanning fange tilstande. Derefter skal du trykke på Execute in sample scan mode for at indsamle eksempelpunktsspredningsfunktionen til de-skævhed og de-convolution.Skift lasere til tre farver, og tryk på Execute igen. Til at begynde, tilføje 100,000 anti-præsentere celler til den forberedte fem millimeter diameter cirkulære coverslip og give dem mulighed for at bosætte sig i 10 minutter. Smør prøveholderen og tilsæt dækslæd til den cellesiden op.Tilføj derefter en dråbe billedmedier på bagsiden af dækslæbet. Skru prøveholderen på Piezo, og tryk på Image Home. Find en antigen-præsentationscelle til billede, og sørg for, at LLSM- og billedbehandlingssoftwaren fungerer korrekt.Tryk på Live for at se det aktuelle billede. Flyt langs Z for at finde coverslip og celler. Find midten af en antigen-præsentationscelle ved at bevæge dig i Z-retningen, og tryk derefter på Stop for at sætte laseren på pause.Kontroller 3D, og indtast de ønskede indstillinger. Tryk på Center, og tryk derefter på Udfør for at indsamle dataene. Sænk fasen til belastningspositionen, og tilsæt 50 mikroliter T-celler og billedmedier drop-wise direkte over dækslæbet.Det er bedst at lade en dråbe form på enden af pipette spidsen og derefter røre spidsen til badet væske. Hæv scenen tilbage ved at klikke på Billede retur. Begynd billeddannelse.Sørg for at indstille den ønskede Z-stak og timelapse-længde. For eksempel, billede 60 Z stakke på en 0,4 mikrometer trin størrelse og input 500 tidsrammer. Stop optagelsen før 500 billeder nås for at undgå foto blegning.Brug live-tilstand til at søge efter cellepar, og når du er klar og ønsket indstillinger er indtastet, skal du trykke på Udfør for at indsamle data. I denne undersøgelse isoleres og fremstilles primære muse 5CC7 T-celler og afbildes derefter ved hjælp af et gitterslysarkmikroskop. Vist her er den korrekte stråle sti og stråle justering, når afbildet med fluorescein.Den objektive scanning skal vise en stor X-form i XZ og YZ fremskrivninger, der er så symmetrisk som muligt. De bør også justeres til at være så lille af et X som muligt. Z galvo scanningen skal vise en oval i XZ og XY med en enkelt prik på hver side.Endelig bør både Z plus objektive scanning og prøvescanningen vise prikker, der ser så runde som muligt. Ved hjælp af denne protokol kunne man se den firedimensionale dynamik i T-cellereceptorerne på en T-celleoverflade. Den største fordel ved dette mikroskop ligger i evnen til at spore de visualiserede overfladeenheder af T-celle receptorer og til at opnå kvantificerede data fra deres størrelse, bevægelse, signal intensitet, og ekskrementer.Det vigtigste at huske er kvaliteten af din tilpasning. Gitterlysarket skal justeres dagligt og ikke gøre dette korrekt, vil resultere i forvrænget billeddannelse. På samme måde påvirker kvaliteten af den indsamlede psf direkte kvaliteten af de-convolution, hvilket i sidste ende resulterer i kvaliteten af dit endelige billede.En af grundene til denne metode er så kraftfuld, er fordi hver celle og etiket kan erstattes for at visualisere mange celletyper og molekyler. Derfor kan denne metode bruges til at besvare ethvert spørgsmål relateret til fire-dimensionel sporing af molekyler. Vi mener, at denne teknik vil bane vejen for forskere til at udforske nye spørgsmål inden for molekylær handel.Det er endnu ikke udbredt på grund af det komplicerede system, så vi håber, at denne Jove video vil forbedre tilgængeligheden til teknikken. De lasere, der anvendes på systemet er klasse fire, så absolut forsigtighed skal tages for at sikre laser sikkerhed. Tag den nødvendige lasersikkerhedstræning, før du bruger denne metode.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi til High Throughput påvisning af lav affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondering struktur og dynamik af Nucleosomes ved hjælp af Atomic Force mikroskopi Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantificering af protein interaktions netværk dynamik ved hjælp af Multiplexed Co-Immunopræcipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion af dynein og Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer til observation af et enkelt molekyle

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening for fytoøstrogener ved hjælp af en cellebaseret østrogenreceptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Overvågning af protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo ved høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisering af Diffusional Dynamics of Gold Nanorods på cellemembran ved hjælp af Single Nanoparticle Darkfield Mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Kvantificering af subcellulær glykogenfordeling i skeletmuskelfibre ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Samtidig visualisering af dynamikken i tværbundne og enkelte mikrotubuli in vitro ved hjælp af TIRF-mikroskopi

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Brug af mikrofluidik og fluorescensmikroskopi til at studere samlingsdynamikken i enkeltaktinfilamenter og bundter

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...