Name: visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Nous tenons à souligner les conseils et les conseils du Dr Vytas Bindokas de l'Université de Chicago. Nous remercions l'Integrated Light Microscopy Core Facility de l'Université de Chicago d'avoir soutenu et entretenu le microscope à feuilles de lumière en treillis. Ce travail a été soutenu par NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 et NSF Career Award 1653782 (To J.H.). J.R. est soutenu par le NSF Graduate Research Fellowships Program.

5C. C7 TCR-transgénique RAG2 knock-out souris en B10. Un fond ont été employés dans cette étude selon un protocole approuvé par le comité institutionnel de soin et d'utilisation des animaux de l'université de Chicago.
1. Récolter et activer les lymphocytes T
REMARQUE : Cette partie du protocole est basée sur des protocoles précédents. Voir les citations pour plus de détails20,21.
<ol><li>Eutha...

<ol>
	<li>Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physical+Basis+of+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+(TIRF)+Microscopy+and+Its+Cellular+Applications.">The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).</li><li>Shroff, H., White, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+Localization+Microscopy+(PALM)+of+Adhesion+Complexes.">Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes.</a> Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).</li><li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level.">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li><li>Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+speed+and+resolution+of+light+microscopy.">Advances in the speed and resolution of light microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).</li><li>. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: <a target="_blank" href="https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr">https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr</a> (2019)</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. , (2014).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+natural+killer+cells+maintain+long-term+antitumor+activity+by+epigenetic+imprinting+and+CD4++T+cell+help.">Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help.</a> Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).</li><li>Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Binds+to+B7-1+Only+In+Cis+on+the+Same+Cell+Surface.">PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).</li><li>Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly49C-dependent+control+of+MCMV+Infection+by+NK+cells+is+cis-regulated+by+MHC+Class+I+molecules.">Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules.</a> PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).</li><li>Sch&#246;neberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+cell+biology:+big+data+image+analytics+and+lattice+light-sheet+imaging+reveal+dynamics+of+clathrin-mediated+endocytosis+in+stem+cell-derived+intestinal+organoids.">4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids.</a> Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), 8302 (2019).</li><li>Cai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dynamic+microvillar+search+and+stabilization+during+ligand+detection+by+T+cells.">Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells.</a> Science. 356 (6338), 3118 (2017).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+Depletion+Initiates+Events+Leading+to+Granule+Secretion+at+the+Immunological+Synapse.">Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse.</a> Immunity. , (2015).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes.">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Peptide-Major+Histocompatibility+Complex+Ligand+Triggers+Digital+Cytokine+Secretion+in+CD4++T+Cells.">A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells.</a> Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).</li><li>Jansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+framework+for+analyzing+T+cell+receptor+scanning+of+peptides.">A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides.</a> Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).</li><li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart.">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li></ol>

Le protocole présenté a été optimisé pour l'utilisation des cellules CD4et T isolées de 5C. Les souris transgéniques C7 sur l'instrument LLSM utilisé, et donc d'autres systèmes cellulaires et LLSM peuvent avoir besoin d'être optimisés différemment. Cependant, ce protocole montre la puissance de l'imagerie 4D, car il peut être utilisé pour quantifier la dynamique d'un récepteur de surface sur une cellule entière avec le moins de distorsion dans les conditions physiologiques. Par conséquent, il ...

La dynamique précise du trafic et de la diffusion des molécules sur la surface tridimensionnelle des cellules en temps réel a été une énigme à résoudre. La microscopie a toujours été un équilibre de vitesse, de sensibilité et de résolution; si un ou deux sont maximisés, le troisième est minimisé. Par conséquent, en raison de la petite taille et de la vitesse immense avec laquelle les récepteurs de surface se déplacent, le suivi de leur dynamique est resté un défi technologique majeur dans le domaine de la biologie cellulaire. Par exemple, de nombreuses études ont été menées à l'aide de la microscopie interne totale de fluorescence (TIRF)1,2,3, qui a une résolution temporelle élevée, mais ne peut imager qu'une tranche très mince de la membrane des lymphocytes T (100 nm), et manque donc des événements qui se produisent plus loin dans la cellule. Ces images TIRF ne montrent également qu'une section bidimensionnelle de la cellule. En revanche, les techniques de super-résolution, telles que la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM)4, la microscopie de localisation photoactivée (PALM)5, et la microscopie d'épuisement des émissions stimulée (STED)6, peuvent surmonter la limite de diffraction de l'abbéenne de la lumière. Ces techniques ont une résolution spatiale élevée (résolution de 20 nm)4,5,6,7, mais elles prennent souvent de nombreuses minutes pour acquérir une image bidimensionnelle complète (2D) ou tridimensionnelle (3D), et donc la résolution temporelle est perdue. En outre, des techniques telles que STORM et PALM qui reposent sur des signaux clignotants peuvent avoir des inexactitudes dans le comptage8,9. La microscopie électronique a de loin la plus haute résolution (jusqu'à 50 h de résolution)10; il peut même être effectué en trois dimensions avec la microscopie électronique focalisée de balayage de faisceau d'ions (FIB-SEM), ayant pour résultat jusqu'à 3 nm XY et 500 nm Z résolution11. Cependant, toute forme de microscopie électronique nécessite une préparation d'échantillons rigoureux et ne peut être menée qu'avec des cellules ou des tissus fixes, éliminant ainsi la possibilité d'imagerie d'échantillons vivants au fil du temps.
Les techniques pour obtenir la résolution spatiotemporal élevée exigée pour identifier la dynamique des molécules de surface et intracellulaires dans les cellules vivantes dans leur vraie nature physiologique 3D sont seulement récemment développées. Une de ces techniques est Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, qui utilise une feuille de lumière structurée pour réduire considérablement photoblanchiment. Développé en 2014 par le prix Nobel Eric Betzig, la haute résolution axiale, le faible photoblanchiment et le bruit de fond, et la capacité d'imager simultanément des centaines d'avions par champ de vision font des microscopes LLS supérieurs aux microscopes widefield, TIRF et confocal12,13,14,15,16,17,18,19. Cette technique d'imagerie en quatre dimensions (x, y, z et temps), bien que toujours limitée à la diffraction (résolution XYZ de 200 nm), a une résolution temporelle incroyable (nous avons atteint un taux d'image d'environ 100 fps, résultant en une image cellulaire reconstruite en 3D avec 0,85 seconde par image) pour l'acquisition spatiale 3D.
LLSM peut généralement être utilisé pour suivre la dynamique en temps réel de toutes les molécules dans n'importe quelle cellule au niveau monomolécule et unicellulaire, en particulier ceux dans les cellules très motiles telles que les cellules immunitaires. Par exemple, nous montrons ici comment utiliser LLSM pour visualiser la dynamique des récepteurs des lymphocytes T (TCR). Les lymphocytes T sont les cellules effectrices du système immunitaire adaptatif. Les TCR sont chargés de reconnaître les ligands peptide-MHC (pMHC) affichés à la surface des cellules présentant des antigènes (APC), qui déterminent la sélection, le développement, la différenciation, le sort et la fonction d'une cellule T. Cette reconnaissance se produit à l'interface entre les lymphocytes T et les APC, résultant en un regroupement localisé des récepteurs pour former ce qu'on appelle la synapse immunologique. Bien qu'il soit connu que les TCR à la synapse immunologique sont impératifs pour la fonction effector de Cellule T, encore inconnus sont les mécanismes sous-jacents du trafic en temps réel de TCR à la synapse. LLSM nous a permis de visualiser en temps réel la dynamique des TCR avant et après le trafic à la synapse avec l'interaction pMHC-TCR qui en résulte (Figure 1). LLSM peut donc être utilisé pour résoudre les questions actuelles de la dynamique formatrice des TCR et fournir des idées pour comprendre comment une cellule fait la distinction entre l'individu et les antigènes étrangers.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm round coverslips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>502040</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70um Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7201431</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR &#946; chain Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109215</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>X&#38;Y Cell Culture</td>
			<td>FBS-500</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Denisty gradient reagent for T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lattice Light-Sheet Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope Used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLSpy</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK</td>
			<td>Elimbio</td>
			<td>Custom Synthesis</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penacillin/Streptamycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122_3683884612</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse IL-2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0523</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slidebook</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSM imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Dissection Tools</td>
			<td>Nova-Tech International</td>
			<td>DSET10</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231710126</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44685</td>
			<td>For preparing Fab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy

La signalisation et la fonction d'une cellule sont dictées par les structures dynamiques et les interactions de ses récepteurs de surface. Pour vraiment comprendre la relation structure-fonction de ces récepteurs in situ, nous devons les visualiser et les suivre sur la surface des cellules vivantes avec une résolution spatiotemporal suffisante. Ici, nous montrons comment utiliser récemment développé Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) pour l'image des récepteurs à cellule T (TCRs) en quatre dimensions (4D, l'espace et le temps) à la membrane cellulaire vivante. Les lymphocytes T sont l'une des principales cellules effectrices du système immunitaire adaptatif, et ici nous avons utilisé les lymphocytes T comme exemple pour montrer que la signalisation et la fonction de ces cellules sont entraînées par la dynamique et les interactions des TCR. LLSM permet une imagerie 4D avec une résolution spatiotemporal sans précédent. Cette technique de microscopie peut donc être généralement appliquée à un large éventail de molécules de surface ou intracellulaires de différentes cellules en biologie.

Ici, nous décrivons l'isolement, la préparation, et l'imagerie de la souris primaire 5C. Cellules T C7 à l'aide d'un microscope à feuilles de lumière en treillis. Pendant la section 3, il est impératif d'aligner correctement le microscope et de recueillir quotidiennement des FPS pour décongestionner les données après la collecte. Dans la figure 2, nous montrons les images d'alignement correctes qui seront vues lors de l'alignement du microscope. La figure 2</str...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Le but de ce protocole est de montrer comment utiliser la microscopie lattice Light-Sheet pour visualiser en quatre dimensions la dynamique des récepteurs de surface dans les cellules vivantes. Ici, les récepteurs des lymphocytes T sur les lymphocytes T CD4et primaires sont montrés.

Visualisation de la dynamique des récepteurs T-Cell de surface à quatre dimensions à l'aide de microscopie à feuilles de lumière en treillis

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

La microscopie à feuilles lumineuses en treillis est une puissante technologie d’imagerie, mais peu de laboratoires dans le monde sont capables de l’utiliser. Ce protocole donne un aperçu détaillé de la façon d’utiliser le microscope à feuilles lumineuses en treillis disponible dans le commerce. C’est un système extrêmement puissant capable d’imagerie quadridimensionnelle de cellules individuelles ou d’embryons qui permet un suivi en temps réel des molécules.Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut en trois dimensions l’image de cellules ou d’organes vivants simples avec une résolution spatiotemporale élevée et un minimum de blanchiment photo. Le modèle de treillis de la feuille de lumière nous permet d’échantillons d’images à grande vitesse et d’obtenir des vidéos en temps réel de cellules vivantes tridimensionnelles et d’organes avec des détails moléculaires que d’autres techniques ne peuvent pas atteindre. Ce premier protocole vidéo montrant comment nous treillis microscopie feuille de lumière à l’image d’une seule cellule en quatre dimensions.Il s’agit d’une technique très compliquée en raison de l’alignement et la préparation de l’échantillon. Et nous croyons que la démonstration visuelle améliorera l’accessibilité en permettant à plus de scientifiques d’image de nombreuses molécules, cellules et organes différents en biologie. Pour commencer cette procédure, incuber cinq millimètres de coverslips ronds avec 0,1% de poly-L-lysine à température ambiante pendant 10 minutes.Aspirer le liquide et laisser sécher l’air des coverslips naturellement. Ensuite, ajoutez trois millilitres de gradient de densité à un tube conique de 15 millilitres. Ajouter délicatement les cellules drop-wise sur le bord du tube.Centrifugeuse à 930 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après cela, retirez soigneusement la fine couche moyenne des cellules entre le milieu complet et le réaccente de gradient de densité en vous assurant de mettre chaque type de cellule dans un tube conique séparé. Centrifugeuse à 300 fois g pendant cinq minutes pour laver les cellules.Jetez le supernatant et ajoutez cinq millilitres de RPMI aux tubes des cellules T et CH27. Répétez le lavage avec du RPMI frais jusqu’à ce que trois lavages totaux aient été effectués. Ensuite, resuspendez les cellules dans chaque tube avec un millilitre de RPMI complet et comptez les cellules avec un hémocytomètre.Resuspendez un million de cellules présentant des antigènes dans 500 microlitres de RPMI complet et ajoutez 10 MCC micromolaires. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant trois heures. Après cela, résuspendez un million de T-cellules dans 500 microlitres de RPMI complet.Ajouter deux microgrammes d’anti-TCR bêta Alexa 488 étiqueté FAB et incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Ensuite, centrifuger les deux cellules à 300 fois g pendant cinq minutes et jeter le supernatant. Ajouter 500 microlitres de RPMI complet et répéter la centrifugeuse pour laver les cellules.Répétez le lavage avec rpmi frais jusqu’à ce que trois lavages totaux ont été effectués rejetant le supernatant après chaque lavage. Après cela, resuspendez les deux types de cellules dans 500 microlitres de médias d’imagerie. Tout d’abord, ajouter 10 millilitres d’eau et 30 microlitres de fluorescéine au bain LLSM.Appuyez sur Image Accueil pour déplacer l’objet vers la position de l’image et regarder un seul modèle de faisceau laser Bessel. Alignez le faisceau laser à l’aide du guide et prédéfinir la région d’intérêt pour faire du faisceau un motif mince qui est équilibré dans toutes les directions. Le faisceau doit également apparaître concentré dans la caméra de recherche.Utilisez les deux ajusteurs d’inclinaison du miroir, le micromètre de mise au point supérieur et la couleur objective pour régler le faisceau. Ensuite, lavez le bain et les objectifs avec au moins 200 millilitres d’eau pour éliminer complètement toute fluorescéine. Pour l’image des perles fluorescentes standard, allumez le tramage en fixant à trois dans la boîte de gamme Xgalvo et appuyez sur Live pour voir le champ actuel.Ajustez manuellement le miroir d’inclinaison, la couleur objective et le micromètre de mise au point pour les valeurs grises les plus élevées. Ensuite, ajustez au besoin pour obtenir des modèles appropriés pour l’analyse objective, Z galvo, Z plus objectif, et les modes de capture d’analyse d’échantillon. Après cela, appuyez sur Exécuter en mode analyse d’échantillon pour recueillir la fonction de propagation de point d’échantillon pour le dé-biaisage et la dé-convolution.Changez les lasers en mode trois couleurs et appuyez à nouveau Exécuter à nouveau. Pour commencer, ajoutez 100 000 cellules anti-présentation à la couverture circulaire préparée de cinq millimètres de diamètre et laissez-leur se contenter de 10 minutes. Graisser le support de l’échantillon et ajouter le coverslip sur le côté cellulaire vers le haut.Ensuite, ajoutez une goutte de supports d’imagerie à l’arrière du coverslip. Vissez le porte-échantillon sur le Piezo et appuyez sur Image Home. Trouvez une cellule présentant des antigènes à l’image et assurez-vous que le LLSM et le logiciel d’imagerie fonctionnent correctement.Appuyez en direct pour afficher l’image actuelle. Déplacez-vous le long de Z pour trouver le coverslip et les cellules. Trouvez le centre d’une cellule présentant des antigènes en vous déplaçant dans la direction Z, puis appuyez sur Arrêter pour mettre le laser en pause.Vérifiez la 3D et entrez les paramètres souhaités. Centre de presse, puis appuyez sur Exécuter pour recueillir les données. Abaissez la scène à la position de charge et ajoutez 50 microlitres de T-cells et de supports d’imagerie drop-wise directement sur le coverslip.Il est préférable de laisser une goutte se former à l’extrémité de la pointe pipette, puis toucher la pointe vers le liquide du bain. Remontez la scène en cliquant sur Retour d’image. Commencez l’imagerie.Assurez-vous de définir la pile Z désirée et la longueur timelapse. Par exemple, l’image 60 Z s’empile à une taille d’étape de 0,4 micromètre et entre 500 délais. Arrêtez d’enregistrer avant que 500 images ne soient atteintes pour éviter le blanchiment des photos.Utilisez le mode live pour rechercher des paires de cellules et lorsque les paramètres prêts et désirés ont été entrés, appuyez sur Exécuter pour collecter des données. Dans cette étude, les cellules T 5CC7 de souris primaires sont isolées et préparées et sont ensuite photographiées à l’aide d’un microscope à feuilles lumineuses en treillis. Montré ici sont le chemin de faisceau correct et l’alignement du faisceau lorsqu’il est représenté avec de la fluorescéine.L’analyse objective doit montrer une grande forme X dans les projections XZ et YZ qui est aussi symétrique que possible. Ils doivent également être ajustés pour être aussi petits qu’un X que possible. Le scan Z galvo doit montrer un ovale en XZ et XY avec un seul point de chaque côté.Enfin, l’analyse objective Z plus et l’analyse de l’échantillon doivent montrer des points qui semblent aussi ronds que possible. À l’aide de ce protocole, on a pu voir la dynamique quadridimensionnelle des récepteurs des cellules T à la surface des cellules T. Le principal avantage de ce microscope réside dans la capacité de suivre les unités de surface visualisées des récepteurs des cellules T et d’obtenir des données quantifiées de leur taille, mouvement, intensité du signal et excréments.La chose la plus importante à retenir est la qualité de votre alignement. La feuille de lumière en treillis doit être alignée quotidiennement et ne pas le faire correctement entraînera une imagerie déformée. De même, la qualité du PSF collecté a un impact direct sur la qualité de la dé-convolution qui aboutt finalement à la qualité de votre image finale.Une des raisons pour lesquelles cette méthode est si puissante est parce que chaque cellule et étiquette peut être remplacée pour visualiser de nombreux types de cellules et molécules. Par conséquent, cette méthode peut être utilisée pour répondre à toute question liée au suivi quadridimensionnel des molécules. Nous pensons que cette technique ouvrira la voie aux chercheurs pour explorer de nouvelles questions dans le domaine du trafic moléculaire.Il n’est pas encore largement utilisé en raison du système compliqué, donc nous espérons que cette vidéo Jove permettra d’améliorer l’accessibilité à la technique. Les lasers utilisés sur le système sont de classe quatre, donc une prudence absolue doit être prise pour assurer la sécurité laser. S’il vous plaît prendre la formation nécessaire à la sécurité laser avant d’utiliser cette méthode.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Technologie des microréseaux protéine extracellulaire pour détection haut débit des Interactions Ligand-récepteur de faible affinité

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Recherche

Biochimie

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sonder la Structure et la dynamique des nucléosomes à l’aide de la microscopie de Force atomique d’imagerie

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantification de la dynamique du réseau d'interaction des protéines à l'aide de la co-immunoprécipitation multiplexée

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Production d'ensembles moteurs d'adn et de kinésine sur des nanostructures d'origami d'ADN pour l'observation d'une seule molécule

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Dépistage des phytoestrogènes à l’aide d’un récepteur d’œstrogènes à base β de Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Surveillance de la dynamique d’interaction protéine-ARN in vivo à haute résolution temporelle à l’aide de χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisation de la dynamique diffusionnelle des nanorods d’or sur la membrane cellulaire à l’aide d’une microscopie darkfield nanoparticule unique

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Quantification de la distribution subcellulaire du glycogène dans les fibres musculaires squelettiques à l’aide de la microscopie électronique à transmission

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Visualisation simultanée de la dynamique des microtubules réticulés et simples in vitro par microscopie TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Utilisation de la microfluidique et de la microscopie à fluorescence pour étudier la dynamique d’assemblage des filaments et des faisceaux d’actine unique

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...