Name: visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Wir möchten die Beratung und Anleitung von Dr. Vytas Bindokas von der University of Chicago würdigen. Wir danken der Integrated Light Microscopy Core Facility der University of Chicago für die Unterstützung und Wartung des Gitter-Lichtbogenmikroskops. Diese Arbeit wurde durch den NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 und den NSF Career Award 1653782 (To J.H.) unterstützt. J.R. wird vom NSF Graduate Research Fellowships Program unterstützt.

5C. C7 TCR-transgene RAG2 Knockout-Mäuse in B10. Ein Hintergrund wurde in dieser Studie gemäß einem Protokoll verwendet, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Chicago genehmigt wurde.
1. Ernte und Aktivierung von T-Zellen
HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls basiert auf früheren Protokollen. Siehe Zitate für weitere Details20,21.
<ol><li>Euthanisieren Sie ein 10-12 Woche...

<ol>
	<li>Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physical+Basis+of+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+(TIRF)+Microscopy+and+Its+Cellular+Applications.">The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).</li><li>Shroff, H., White, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+Localization+Microscopy+(PALM)+of+Adhesion+Complexes.">Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes.</a> Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).</li><li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level.">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li><li>Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+speed+and+resolution+of+light+microscopy.">Advances in the speed and resolution of light microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).</li><li>. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: <a target="_blank" href="https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr">https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr</a> (2019)</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. , (2014).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+natural+killer+cells+maintain+long-term+antitumor+activity+by+epigenetic+imprinting+and+CD4++T+cell+help.">Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help.</a> Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).</li><li>Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Binds+to+B7-1+Only+In+Cis+on+the+Same+Cell+Surface.">PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).</li><li>Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly49C-dependent+control+of+MCMV+Infection+by+NK+cells+is+cis-regulated+by+MHC+Class+I+molecules.">Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules.</a> PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).</li><li>Sch&#246;neberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+cell+biology:+big+data+image+analytics+and+lattice+light-sheet+imaging+reveal+dynamics+of+clathrin-mediated+endocytosis+in+stem+cell-derived+intestinal+organoids.">4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids.</a> Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), 8302 (2019).</li><li>Cai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dynamic+microvillar+search+and+stabilization+during+ligand+detection+by+T+cells.">Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells.</a> Science. 356 (6338), 3118 (2017).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+Depletion+Initiates+Events+Leading+to+Granule+Secretion+at+the+Immunological+Synapse.">Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse.</a> Immunity. , (2015).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes.">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Peptide-Major+Histocompatibility+Complex+Ligand+Triggers+Digital+Cytokine+Secretion+in+CD4++T+Cells.">A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells.</a> Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).</li><li>Jansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+framework+for+analyzing+T+cell+receptor+scanning+of+peptides.">A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides.</a> Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).</li><li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart.">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li></ol>

Das vorgestellte Protokoll wurde für die Verwendung von CD4+ T-Zellen optimiert, die von 5C isoliert wurden. C7-Transgenmäuse auf dem verwendeten LLSM-Instrument und daher andere Zellsysteme und LLSMs müssen möglicherweise unterschiedlich optimiert werden. Dieses Protokoll zeigt jedoch die Kraft der 4D-Bildgebung, da es verwendet werden kann, um die Dynamik eines Oberflächenrezeptors auf einer ganzen Zelle mit der geringsten Verzerrung unter physiologischen Bedingungen zu quantifizieren. Daher gibt es vie...

Die genaue Dynamik des Molekülhandels und der Streuung auf der dreidimensionalen Zelloberfläche in Echtzeit war ein Rätsel, das es zu lösen gilt. Mikroskopie war schon immer ein Gleichgewicht zwischen Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und Auflösung; Wenn ein oder zwei Maximierungen, wird die dritte minimiert. Aufgrund der geringen Größe und der immensen Geschwindigkeit, mit der sich Oberflächenrezeptoren bewegen, ist die Verfolgung ihrer Dynamik eine große technologische Herausforderung für den Bereich der Zellbiologie geblieben. Zum Beispiel wurden viele Studien mit der totalen inneren Reflexionsfluoreszenz (TIRF) Mikroskopie1,2,3durchgeführt, die eine hohe zeitliche Auflösung hat, aber nur ein sehr dünnes Stück der T-Zell-Membran (ca. 100 nm) abbilden kann und daher Ereignisse vermisst, die weiter entfernt in der Zelle geschehen. Diese TIRF-Bilder zeigen auch nur einen zweidimensionalen Abschnitt der Zelle. Im Gegensatz dazu können superhochauflösende Techniken wie die stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM)4, die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM)5und die stimulierte Emissionserschöpfungsmikroskopie (STED)6die Abbe-Beugungsgrenze des Lichts überwinden. Diese Techniken haben eine hohe räumliche Auflösung (20 nm Auflösung)4,5,6,7, aber sie dauern oft viele Minuten, um ein vollständiges zweidimensionales (2D) oder dreidimensionales (3D) Bild zu erhalten, und daher geht die zeitliche Auflösung verloren. Darüber hinaus können Techniken wie STORM und PALM, die auf blinkenden Signalen basieren, Ungenauigkeiten bei der Zählungvon 8,9haben. Elektronenmikroskopie hat bei weitem die höchste Auflösung (bis 50 pm Auflösung)10; es kann sogar dreidimensional mit fokussierter Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) durchgeführt werden, was zu bis zu 3 nm XY und 500 nm Z Auflösung11führt. Jede Form der Elektronenmikroskopie erfordert jedoch eine harte Probenvorbereitung und kann nur mit festen Zellen oder Geweben durchgeführt werden, wodurch die Möglichkeit einer Bildgebung von Lebendenproben im Laufe der Zeit ausgeschlossen wird.
Techniken zur Erzielung der hohen raumzeitlichen Auflösung, die erforderlich ist, um die Dynamik von Oberflächen- und intrazellulären Molekülen in lebenden Zellen in ihrer wahren physiologischen 3D-Natur zu identifizieren, werden erst vor kurzem entwickelt. Eine dieser Techniken ist Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, die eine strukturierte Lichtplatte verwendet, um photobleaching drastisch zu senken. Entwickelt im Jahr 2014 von Nobelpreisträger Eric Betzig, die hohe axiale Auflösung, geringe Photobleaching und Hintergrundgeräusche, und die Fähigkeit, gleichzeitig Hunderte von Ebenen pro Sichtfeld bilden LLS Mikroskope überlegen Widefield, TIRF und konfokale Mikroskope12,13,14,15,16,17,18,19. Diese vierdimensionale (x, y, z und zeit) Bildgebungstechnik, die zwar noch beugungsbegrenzt ist (200 nm XYZ-Auflösung), hat eine unglaubliche zeitliche Auflösung (wir haben eine Bildrate von etwa 100 fps erreicht, was zu einem 3D-rekonstruierten Zellbild mit 0,85 Sekunden pro Frame führt) für die 3D-Raumerfassung.
LLSM kann im Allgemeinen verwendet werden, um die Echtzeitdynamik von Molekülen innerhalb einer Zelle auf Einzelmolekül- und Einzelzellebene zu verfolgen, insbesondere in stark motilen Zellen wie Immunzellen. Zum Beispiel zeigen wir hier, wie man LLSM verwendet, um die T-Zell-Rezeptor-Dynamik (TCR) zu visualisieren. T-Zellen sind die Effektorzellen des adaptiven Immunsystems. TCRs sind verantwortlich für die Erkennung von Peptid-MHC (pMHC) Liganden, die auf der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen (APC) angezeigt werden, die die Auswahl, Entwicklung, Differenzierung, Dasschicksal und Funktion einer T-Zelle bestimmen. Diese Erkennung tritt an der Schnittstelle zwischen T-Zellen und APCs auf, was zu lokalisierten Rezeptorclustern führt, um die so genannte immunologische Synapse zu bilden. Während bekannt ist, dass TCRs an der immunologischen Synapse für die T-Zell-Effektorfunktion unerlässlich sind, sind noch unbekannt die zugrunde liegenden Mechanismen des Echtzeit-TCR-Handels zur Synapse. LLSM hat es uns ermöglicht, die Dynamik von TCRs vor und nach dem Handel mit der resultierenden pMHC-TCR-Interaktion in Echtzeit zu visualisieren (Abbildung 1). LLSM kann daher verwendet werden, um aktuelle Fragen der prägenden Dynamik von TCRs zu lösen und Erkenntnisse zu liefern, um zu verstehen, wie eine Zelle zwischen selbst- und fremder Antigene unterscheidet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm round coverslips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>502040</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70um Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7201431</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR &#946; chain Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109215</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>X&#38;Y Cell Culture</td>
			<td>FBS-500</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Denisty gradient reagent for T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lattice Light-Sheet Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope Used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLSpy</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK</td>
			<td>Elimbio</td>
			<td>Custom Synthesis</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penacillin/Streptamycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122_3683884612</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse IL-2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0523</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slidebook</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSM imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Dissection Tools</td>
			<td>Nova-Tech International</td>
			<td>DSET10</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231710126</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44685</td>
			<td>For preparing Fab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy

Die Signalisierung und Funktion einer Zelle wird durch die dynamischen Strukturen und Wechselwirkungen ihrer Oberflächenrezeptoren diktiert. Um die Struktur-Funktions-Beziehung dieser Rezeptoren vor Ort wirklich zu verstehen, müssen wir sie auf der Oberfläche der lebenden Zelle mit genügend raumzeitlicher Auflösung visualisieren und verfolgen. Hier zeigen wir, wie sie die kürzlich entwickelte Lattice Light-Sheet-Mikroskopie (LLSM) verwenden, um T-Zellrezeptoren (TCRs) vierdimensional (4D, Raum und Zeit) an der lebenden Zellmembran abzubilden. T-Zellen sind eine der Haupteffektorzellen des adaptiven Immunsystems, und hier haben wir T-Zellen als Beispiel verwendet, um zu zeigen, dass die Signalisierung und Funktion dieser Zellen durch die Dynamik und Wechselwirkungen der TCRs angetriebenwerden. LLSM ermöglicht 4D-Bildgebung mit beispielloser Raumzeitauflösung. Diese Mikroskopietechnik kann daher in der Biologie allgemein auf eine Vielzahl von Oberflächen- oder intrazellulären Molekülen verschiedener Zellen angewendet werden.

Hier beschreiben wir die Isolierung, Vorbereitung und Abbildung der primären Maus 5C. C7 T-Zellen mit einem Gitter-Lichtbogenmikroskop. In Abschnitt 3 ist es zwingend erforderlich, das Mikroskop richtig auszurichten und täglich PSF zu sammeln, mit dem die Daten nach der Erfassung dekonvolvenieren können. In Abbildung 2zeigen wir die richtigen Ausrichtungsbilder, die beim Ausrichten des Mikroskops zu sehen sind. Abbildung 2A und <strong class=...

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Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie die Lattice Light-Sheet-Mikroskopie verwendet wird, um die Dynamik von Oberflächenrezeptoren in lebenden Zellen vierdimensional zu visualisieren. Hier werden T-Zellrezeptoren auf CD4+ primären T-Zellen gezeigt.

Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Die Lattice-Lichtbogenmikroskopie ist eine leistungsstarke Bildgebungstechnologie, aber nur wenige Labore auf der Welt sind in der Lage, sie zu verwenden. Dieses Protokoll gibt einen detaillierten Überblick über den Einsatz des handelsüblichen Gitter-Lichtbogenmikroskops. Es ist ein extrem leistungsfähiges System, das in der Lage ist, einzelne Zellen oder Embryonen vierdimensional zu bebildern, was eine Echtzeitverfolgung von Molekülen ermöglicht.Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einzelne lebende Zellen oder Organe mit hoher raumzeitlicher Auflösung und minimaler Fotobleiche dreidimensional abbilden kann. Das Gittermuster des Lichtbogens ermöglicht es uns, Hochgeschwindigkeits-Bildproben zu erstellen und Echtzeitvideos von dreidimensionalen lebenden Zellen und Organen mit molekularen Details zu erhalten, die andere Techniken nicht erreichen können. Dieses erste Videoprotokoll zeigt, wie wir Lichtbogenmikroskopie vergittern, um einzelne Zellen vierdimensional abzubilden.Dies ist eine sehr komplizierte Technik aufgrund der Ausrichtung und Probenvorbereitung. Und wir glauben, dass visuelle Demonstration die Zugänglichkeit verbessern wird, indem es mehr Wissenschaftlern ermöglicht wird, viele verschiedene Moleküle, Zellen und Organe in der Biologie abzubilden. Um dieses Verfahren zu beginnen, inkubieren Sie fünf Millimeter runde Abdeckungen mit 0,1%Poly-L-Lysin bei Raumtemperatur für 10 Minuten.Die Flüssigkeit absaugen und die Deckellipsen auf natürliche Weise trocknen lassen. Als nächstes fügen Sie drei Milliliter Dichtegradient zu einem 15 Milliliter konischen Rohr hinzu. Fügen Sie vorsichtig Zellen tropfenweise an den Rand des Rohres.Zentrifuge bei 930 mal g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie anschließend sorgfältig die dünne mittlere Zellschicht zwischen dem gesamten Medium und dem Dichtegradientenreagenz, um sicherzustellen, dass jeder Zelltyp in ein separates konisches Rohr gelegt wird. Zentrifuge bei 300 mal g für fünf Minuten, um die Zellen zu waschen.Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie fünf Milliliter RPMI zu den Röhren von T-Zellen und CH27-Zellen hinzu. Wiederholen Sie die Wäsche mit frischem RPMI, bis drei Gesamtwäschen durchgeführt wurden. Setzen Sie dann die Zellen in jeder Röhre mit einem Milliliter vollständiger RPMI wieder aus und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.Setzen Sie eine Million antigenpräsentierende Zellen in 500 Mikrolitern kompletten RPMI aus und fügen Sie 10 mikromolare SMCC hinzu. Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für drei Stunden inkubieren. Danach setzen Sie eine Million T-Zellen in 500 Mikroliter n. Chr.Fügen Sie zwei Mikrogramm Anti-TCR Beta Alexa 488 mit der Bezeichnung FAB hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 30 Minuten. Als nächstes zentrieren Sie beide Zellen bei 300 mal g für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 500 Mikroliter komplettes RPMI hinzu und wiederholen Sie die Zentrifuge, um die Zellen zu waschen.Wiederholen Sie die Wäsche mit frischem RPMI, bis drei Gesamtwäschen durchgeführt wurden, die den Überstand nach jeder Wäsche entsorgen. Danach setzen Sie beide Zelltypen in 500 Mikroliterbild wieder aus. Fügen Sie zunächst 10 Milliliter Wasser und 30 Mikroliter Fluorescein in das LLSM-Bad.Drücken Sie Bild nach Hause, um das Objekt in die Bildposition zu verschieben und ein einzelnes Bessel-Laserstrahlmuster zu betrachten. Richten Sie den Laserstrahl mit der Führung und dem voreingestellten Bereich von Interesse aus, um den Strahl zu einem dünnen Muster zu machen, das in alle Richtungen ausbalanciert ist. Der Strahl sollte auch in der Finderkamera fokussiert erscheinen.Verwenden Sie die beiden Spiegelneigungsregler, das Mikrometer mit dem oberen Fokus und die Objektivfarbe, um den Strahl anzupassen. Als nächstes waschen Sie das Bad und die Ziele mit mindestens 200 Milliliter Wasser, um fluorescein vollständig zu entfernen. Um Standard-Leuchtstoffperlen abzubilden, schalten Sie Dither ein, indem Sie in der Xgalvo-Bereichsbox auf drei setzen und Live drücken, um das aktuelle Feld anzuzeigen.Passen Sie den Neigungsspiegel, die Objektivfarbe und das Fokusmikrometer manuell für höchste Grauwerte an. Passen Sie dann bei Bedarf an, um die richtigen Muster für den Objektivscan, Z galvo, Z plus Objektiv und die Stichprobenaufnahmemodi zu erhalten. Danach drücken Sie Execute im Sample-Scan-Modus, um die Sample-Point-Spread-Funktion für De-Skewing und De-Convolution zu sammeln.Ändern Sie die Laser in den Dreifarbenmodus, und drücken Sie erneut Ausführen. Fügen Sie zunächst 100.000 antipräsentierende Zellen zu dem vorbereiteten kreisförmigen Abdeckungsrutsch mit fünf Millimeterdurchmessern hinzu und lassen Sie sie sich für 10 Minuten begnügen. Fetten Sie den Probenhalter und fügen Sie den Coverslip zur Zellseite hinzu.Fügen Sie als Nächstes einen Tropfen Bildverarbeitungsmedien auf der Rückseite des Coversliphinzus hinzu. Schrauben Sie den Probenhalter auf den Piezo und drücken Sie Image Home. Finden Sie eine Antigen-präsentierende Zelle zum Abbild und stellen Sie sicher, dass die LLSM- und Bildverarbeitungssoftware ordnungsgemäß funktioniert.Drücken Sie Live, um das aktuelle Bild anzuzeigen. Bewegen Sie sich entlang Z, um den Deckzettel und die Zellen zu finden. Finden Sie das Zentrum einer Antigen-präsentierenden Zelle, indem Sie sich in Z-Richtung bewegen, und drücken Sie dann Stopp, um den Laser anzuhalten.Überprüfen Sie 3D und geben Sie die gewünschten Einstellungen ein. Drücken Sie center, und drücken Sie dann Execute, um die Daten zu sammeln. Senken Sie die Stufe auf die Lastposition und fügen Sie 50 Mikroliter T-Zellen und Bildmedien tropfenweise direkt über den Deckelschlupf hinzu.Am besten lassen Sie einen Tropfen am Ende der Pipettenspitze bilden und berühren Sie dann die Spitze an der Badeflüssigkeit. Heben Sie die Bühne zurück, indem Sie auf Bildrückgabe klicken. Beginnen Sie mit der Bildgebung.Stellen Sie sicher, dass Sie den gewünschten Z-Stack und die Länge des Zeitraffers einstellen. Bild 60 Z stapelt beispielsweise mit einer Schrittgröße von 0,4 Mikrometern und gibt 500 Zeitrahmen ein. Beenden Sie die Aufnahme, bevor 500 Frames erreicht werden, um Fotobleichen zu vermeiden.Verwenden Sie den Live-Modus, um nach Zellpaaren zu suchen, und wenn bereite und gewünschte Einstellungen eingegeben wurden, drücken Sie Ausführen, um Daten zu sammeln. In dieser Studie werden primäre Maus 5CC7 T-Zellen isoliert und vorbereitet und dann mit einem Gitter-Lichtbogenmikroskop abgebildet. Hier werden die richtigen Strahlweg und Strahlausrichtung gezeigt, wenn sie mit Fluorescein abgebildet werden.Der Objektivscan sollte in den XZ- und YZ-Projektionen eine große X-Form aufweisen, die so symmetrisch wie möglich ist. Sie sollten auch so angepasst werden, dass sie so klein wie möglich von einem X sind. Der Z-Galvo-Scan sollte ein Oval in XZ und XY mit einem einzigen Punkt auf beiden Seiten anzeigen.Schließlich sollten sowohl der Z plus Objektivscan als auch der Beispielscan Punkte anzeigen, die so rund wie möglich aussehen. Anhand dieses Protokolls konnte die vierdimensionale Dynamik der T-Zell-Rezeptoren auf einer T-Zell-Oberfläche gesehen werden. Der Hauptvorteil dieses Mikroskops liegt in der Fähigkeit, die visualisierten Oberflächeneinheiten der T-Zell-Rezeptoren zu verfolgen und quantifizierte Daten aus größe, Bewegung, Signalintensität und Ausscheidung zu erhalten.Das Wichtigste, was Sie sich merken sollten, ist die Qualität Ihrer Ausrichtung. Das Gitterlichtblatt muss täglich ausgerichtet werden, und wenn dies nicht richtig geschieht, führt dies zu einer verzerrten Bildgebung. In ähnlicher Weise wirkt sich die Qualität der gesammelten PSF direkt auf die Qualität der Devolution aus, was letztendlich zur Qualität Ihres endgültigen Bildes führt.Einer der Gründe, warum diese Methode so leistungsstark ist, ist, dass jede Zelle und jedes Etikett ersetzt werden kann, um viele Zelltypen und Moleküle zu visualisieren. Daher kann diese Methode verwendet werden, um alle Fragen im Zusammenhang mit der vierdimensionalen Nachverfolgung von Molekülen zu beantworten. Wir glauben, dass diese Technik den Weg für Forscher ebnen wird, neue Fragen im Bereich des Molekularhandels zu erforschen.Es ist noch nicht weit verbreitet aufgrund des komplizierten Systems, so dass wir hoffen, dass dieses Jove Video die Zugänglichkeit auf die Technik verbessern wird. Die laser, die auf dem System verwendet werden, sind Klasse vier, daher ist absolute Vorsicht geboten, um die Lasersicherheit zu gewährleisten. Bitte nehmen Sie vor der Anwendung dieser Methode an einem erforderlichen Lasersicherheitstraining teil.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Forschung

Biochemie

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantifizierung der Protein-Interaktionsnetzwerkdynamik mit Multiplex-Co-Immunopräzipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening auf Phytoöstrogene mit einem Zell-basierten Östrogen-Rezeptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Überwachung der Protein-RNA-Interaktionsdynamik in vivo mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung von χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisierung der Diffusionsdynamik von Gold-Nanostäben auf der Zellmembran mit Single Nanoparticle Darkfield-Mikroskopie

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Quantifizierung der subzellulären Glykogenverteilung in Skelettmuskelfasern mittels Transmissionselektronenmikroskopie

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultane Visualisierung der Dynamik von vernetzten und einzelnen Mikrotubuli in vitro mittels TIRF-Mikroskopie

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Verwendung von Mikrofluidik und Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der Montagedynamik von einzelnen Actin-Filamenten und -Bündeln

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...