Name: visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

ברצוני להכיר בעצות ובהדרכה של ד ר וייז בינדוקאס באוניברסיטת שיקגו. אנו מודים למתקן הליבה של מיקרוסקופ אור משולב באוניברסיטת שיקגו לתמיכה ולשמירה על מיקרוסקופ האור הסריג. עבודה זו נתמכת על ידי NIH חדש המייצרת פרס 1DP2AI144245 ו NSF קריירה פרס 1653782 (כדי J.H.). התוכנית למלגות בוגרת NSF מקיימת בתמיכת ג'יי. פי.

5C. C7 TCR-transgenic RAG2 עכברים בB10. הרקע שימש במחקר זה על פי פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת שיקגו.
1. קציר והפעל תאי T
הערה: חלק זה של הפרוטוקול מבוסס על פרוטוקולים קודמים. ראה אזכורים לפרטים נוספים20,21.<...

<ol>
	<li>Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physical+Basis+of+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+(TIRF)+Microscopy+and+Its+Cellular+Applications.">The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).</li><li>Shroff, H., White, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+Localization+Microscopy+(PALM)+of+Adhesion+Complexes.">Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes.</a> Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).</li><li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level.">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li><li>Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+speed+and+resolution+of+light+microscopy.">Advances in the speed and resolution of light microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).</li><li>. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: <a target="_blank" href="https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr">https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr</a> (2019)</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. , (2014).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+natural+killer+cells+maintain+long-term+antitumor+activity+by+epigenetic+imprinting+and+CD4++T+cell+help.">Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help.</a> Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).</li><li>Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Binds+to+B7-1+Only+In+Cis+on+the+Same+Cell+Surface.">PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).</li><li>Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly49C-dependent+control+of+MCMV+Infection+by+NK+cells+is+cis-regulated+by+MHC+Class+I+molecules.">Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules.</a> PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).</li><li>Sch&#246;neberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+cell+biology:+big+data+image+analytics+and+lattice+light-sheet+imaging+reveal+dynamics+of+clathrin-mediated+endocytosis+in+stem+cell-derived+intestinal+organoids.">4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids.</a> Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), 8302 (2019).</li><li>Cai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dynamic+microvillar+search+and+stabilization+during+ligand+detection+by+T+cells.">Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells.</a> Science. 356 (6338), 3118 (2017).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+Depletion+Initiates+Events+Leading+to+Granule+Secretion+at+the+Immunological+Synapse.">Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse.</a> Immunity. , (2015).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes.">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Peptide-Major+Histocompatibility+Complex+Ligand+Triggers+Digital+Cytokine+Secretion+in+CD4++T+Cells.">A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells.</a> Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).</li><li>Jansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+framework+for+analyzing+T+cell+receptor+scanning+of+peptides.">A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides.</a> Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).</li><li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart.">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li></ol>

הפרוטוקול המוצג היה אופטימיזציה לשימוש של CD4+ T תאים מבודדים מ 5c. בשימוש בכלי ה-LLSM משתמשים, ולכן מערכות תאים אחרות ו-Llsm עשויים להיות ממוטבים באופן שונה. עם זאת, פרוטוקול זה מראה את העוצמה של הדמיה 4D, כפי שניתן להשתמש בו כדי לכמת את הדינמיקה של קולטן פני השטח על תא שלם עם עיוות הפחות בתנאי?...

הדינמיקה המדויקת של הסחר במולקולות והפצת המשטחים התלת-ממדיים בזמן אמת הייתה תעלומה לפתרון. מיקרוסקופ תמיד היה איזון של מהירות, רגישות, ורזולוציה; אם אחד או שניים מהם מוגדלים, השליש ממוזער. לכן, בשל גודל קטן ומהירות עצומה עם אילו קולטני פני השטח לנוע, מעקב אחר הדינמיקה שלהם נשאר אתגר טכנולוגי גדול לתחום של ביולוגיה התא. לדוגמה, מחקרים רבים נערכו באמצעות סך השתקפות פנימית מיקרוסקופ (tirf)1,2,3, אשר יש ברזולוציה הטמפורלית הגבוהה, אבל יכול רק תמונה פרוסה דקה מאוד של קרום T-cell (~ 100 nm), ולכן מחמיץ אירועים קורה רחוק יותר בתא. אלה תמונות TIRF גם מראה קטע דו מימדי של התא. לעומת זאת, טכניקות ברזולוציה סופר, כגון מיקרוסקופ סטוכסטי שחזור אופטי (סטורם)4, מיקרוסקופ לוקליזציה פוטומופעל (PALM)5, ו מיקרוסקופית פליטה מגורה (ההיסטד)6, יכול להתגבר על מגבלת מגביל של אבה של האור. טכניקות אלה יש רזולוציה מרחבית גבוהה (~ 20 החלטה nm)4,5,6,7, אבל לעתים קרובות הם לוקחים הרבה דקות כדי לרכוש מלא דו-ממדי (2d) או תלת מימדי (3d) התמונה, ולכן הרזולוציה הטמפורלית אובד. בנוסף, טכניקות כגון הסערה והדקל המסתמכים על אותות מהבהבים עשויים להיות אי-דיוקים בספירת8,9. מיקרוסקופ אלקטרוני יש הרזולוציה הגבוהה ביותר (עד 50 pm החלטה)10; זה יכול אפילו להתבצע תלת מימדי עם קרן יון ממוקדת סריקה אלקטרון מיקרוסקופ (פרפור-SEM), וכתוצאה מכך 3 ננומטר XY ו 500 nm Z החלטה11. עם זאת, כל צורה של אלקטרון מיקרוסקופ דורש הכנה לדוגמה קשה יכול להתבצע רק עם תאים קבועים או רקמות, ביטול האפשרות של הדמיה לחיות דגימות לאורך זמן.
טכניקות כדי להשיג את הרזולוציה גבוהה זמן זמן הדרוש כדי לזהות את הדינמיקה של פני השטח מולקולות תאיים בתאים חיים בטבע הפיזיולוגי האמיתי שלהם 3d הוא רק לאחרונה פיתח. אחת הטכניקות הללו היא מיקרוסקופ גיליון האור של סריג (LLSM)12, אשר מנצל גיליון אור מובנה כדי להקטין באופן דרסטי הלבנה. פותח בשנת 2014 על ידי חתן פרס נובל אריק ביאזיג, הרזולוציה הגבוהה בציר, הלבנה נמוכה ורעש הרקע, ואת היכולת לדמות בו מאות מטוסים לשדה התצוגה להפוך מיקרוסקופים מעולה לשדה שטח, tirf וקונפוקלית יקרוסקופים12,13,14,15,16,17,18,19. זה 4-מימדי (x, y, z ו-time) הדמיה טכניקה, בעוד עקיפה מוגבלת (~ 200 ננומטר החלטה XYZ), יש ברזולוציה הטמפורלית מדהים (השגנו שיעור מסגרת של כ 100 fps, וכתוצאה מכך תמונת תא 3D שוחזר עם 0.85 שניות לכל מסגרת) עבור רכישה מרחבית תלת-ממדית.
Llsm ניתן להשתמש בדרך כלל כדי לעקוב אחר הדינמיקה בזמן אמת של כל המולקולות בתוך תא כלשהו ברמת מולקולה אחת וברמה תא יחיד, במיוחד אלה בתאי נעים מאוד כגון תאים חיסוניים. לדוגמה, אנו מראים כאן כיצד להשתמש ב-LLSM כדי להמחיש דינאמיקה של קולטן T-cell (TCR). תאי T הם התאים האפקטור של המערכת החיסונית אדפטיבית. TCRs אחראים לזיהוי פפטיד-MHC (pMHC) ליגנדס הציג על פני השטח של תאים המציגים אנטיגן (APC), אשר קובע את הבחירה, פיתוח, בידול, גורל, ותפקוד של תא T. הכרה זו מתרחשת בממשק שבין תאי T ו-APCs, וכתוצאה מכך, באשכולות הקולטן מקומי כדי ליצור את מה שנקרא סינפולוגית. אמנם ידוע כי TCRs ב סינפולוגית החיסונית הם הכרחי לפונקציה T-cell אפקטור, עדיין לא ידוע הם המנגנונים הבסיסיים של סחר TCR בזמן אמת הסינפסה. LLSM אפשרה לנו לדמיין בזמן אמת את הדינמיקה של TCRs לפני ואחרי הסחר בסינפסה עם האינטראקציה הנובעת pMHC-TCR (איור 1). LLSM ניתן להשתמש לפיכך כדי לפתור את השאלות הנוכחיות של הדינמיקה המעצבים של TCRs ולספק תובנות כדי להבין כיצד תא מבדיל בין אנטיגנים עצמאיים וזרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm round coverslips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>502040</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70um Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7201431</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR &#946; chain Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109215</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>X&#38;Y Cell Culture</td>
			<td>FBS-500</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Denisty gradient reagent for T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lattice Light-Sheet Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope Used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLSpy</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK</td>
			<td>Elimbio</td>
			<td>Custom Synthesis</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penacillin/Streptamycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122_3683884612</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse IL-2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0523</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slidebook</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSM imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Dissection Tools</td>
			<td>Nova-Tech International</td>
			<td>DSET10</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231710126</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44685</td>
			<td>For preparing Fab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy

האיתות והתפקוד של תא מוכתבים על-ידי מבנים דינאמיים ואינטראקציות של קולטני פני השטח שלה. כדי באמת להבין את היחסים מבנה פונקציה של קולטנים אלה באתרו, אנחנו צריכים להמחיש ולעקוב אחריהם על פני השטח התא לחיות עם רזולוציה מספקת הזמן הזמני. כאן אנו מראים כיצד להשתמש לאחרונה פיתח רשת מיקרוסקופית גיליון אור (LLSM) לתמונה קולטני T-cell (TCRs) ארבע-מימדי (4D, מרחב וזמן) בקרום התא החי. תאי T הם אחד התאים העיקרי של האפקטור של המערכת החיסונית אדפטיבית, וכאן השתמשנו בתאי T כדוגמה כדי להראות כי האיתות והפונקציה של תאים אלה מונעים על ידי הדינמיקה ואינטראקציות של TCRs. LLSM מאפשר הדמיה 4D עם רזולוציה חסרת תקדים הזמני. טכניקה זו מיקרוסקופית ולכן ניתן להחיל בדרך כלל על מגוון רחב של מולקולות משטח או תאיים של תאים שונים בביולוגיה.

כאן, אנו מתארים את הבידוד, ההכנה, והדמיה של העכבר הראשי 5C. התאים C7 T באמצעות סריג במיקרוסקופ האור. במהלך סעיף 3, זה הכרחי ליישר את המיקרוסקופ כראוי, ולאסוף PSF היומי שבו כדי לפרק את הנתונים לאחר האוסף. באיור 2, אנו מציגים את התמונות יישור הנכון שיראו בעת יישור המיקרוסקופ. <strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד להשתמש במיקרוסקופיה של יריעות האור כדי להמחיש באופן זמני את הדינמיקה של קולטן פני השטח בתאים חיים. כאן קולטני תא T על CD4+ תאי t הראשי מוצגים.

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

מיקרוסקופיית יריעות אור סריג היא טכנולוגיית הדמיה רבת עוצמה, אבל מעבדות מעטות בעולם מסוגלות להשתמש בו. פרוטוקול זה מספק סקירה מפורטת של אופן השימוש במיקרוסקופ גיליון האור המסחרי הזמין. זוהי מערכת חזקה מאוד המסוגלת הדמיה ארבע מימדית של תאים בודדים או עוברים המאפשר מעקב בזמן אמת של מולקולות.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לדמיין תלת מימדי תאים חיים בודדים או איברים ברזולוציה מרחבית גבוהה והלבנת תמונות מינימלית. דפוס הסריג של יריעת האור מאפשר לנו דגימות תמונה במהירות גבוהה ולקבל קטעי וידאו בזמן אמת של תאים חיים תלת מימדיים ואיברים עם פרטים מולקולריים שטכניקות אחרות לא יכולות להשיג. פרוטוקול וידאו ראשון זה מראה כיצד לנו סריג מיקרוסקופיה גיליון אור לתמונה תא יחיד ארבע מימדי.זוהי טכניקה מסובכת מאוד עקב יישור הכנת מדגם. ואנחנו מאמינים שהדגמה חזותית תשפר את הנגישות בכך שתאפשר ליותר מדענים לדמיין מולקולות, תאים ואיברים רבים ושונים בביולוגיה. כדי להתחיל בהליך זה, דגירה חמישה מילימטר עגול מכסה עם 0.1% פולי-L-ליסין בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.שאף את הנוזל ותן לכיסויים להתייבש באופן טבעי. לאחר מכן, להוסיף שלושה מיליליטר של שיפוע צפיפות לצינור חרוט 15 מיליליטר. בזהירות להוסיף תאים טיפה חכם לקצה הצינור.צנטריפוגה ב 930 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר בזהירות את השכבה האמצעית הדקה של התאים בין המדיה המלאה לבין רה"מ הדרגתי הצפיפות הקפד לשים כל סוג תא לתוך צינור חרוט נפרד. צנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות כדי לשטוף את התאים.השלך את העל-טבעי והוסף חמישה מיליליטר של RPMI לצינורות של תאי T ותאי CH27. חזור על השטיפה עם RPMI טרי עד שלוש שטיפות סה"כ בוצעו. לאחר מכן, תן שימוש חוזר בתאים בכל צינור עם מיליליטר אחד של RPMI מלא וספירת התאים עם המוציטמטר.תוסיפו מחדש מיליון תאים המציגים אנטיגן ב-500 מיקרוליטרים של RPMI מלא ותוסיפו 10 מיקרומולרים MCC. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שלוש שעות. לאחר מכן, תן שימוש חוזר במיליון תאי T ב-500 מיקרוליטרים של RPMI מלא.הוסיפו שני מיקרוגרם של בטא אלקסה 488 נגד TCR המסומן כ-FAB ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה שני התאים ב 300 פעמים g במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של RPMI מלא וחוזרים על הצנטריפוגה כדי לשטוף את התאים.חזור על השטיפה עם RPMI טרי עד שלוש שטיפות סה"כ בוצעו השלכת supernatant לאחר כל שטיפה. לאחר מכן, תן שימוש חוזר בשני סוגי התאים ב-500 מיקרוליטרים של מדיית הדמיה. ראשית, מוסיפים 10 מיליליטר מים ו-30 מיקרוליטרים של פלואורסין לאמבטיה LLSM.הקש Image Home כדי להזיז את האובייקט למיקום תמונה ולהסתכל על תבנית קרן לייזר בודדת של Bessel. יישר את קרן הלייזר באמצעות קו היישור ואזור העניין המוגדר מראש כדי להפוך את הקרן לתבנית דקה המאוזנת לכל הכיוונים. הקרן אמורה להופיע גם ממוקדת במצלמת הממצא.השתמש בשני מכוונני הטיית המראה, במיקרומטר המוקד העליון ובצבע המטרה כדי להתאים את הקרן. לאחר מכן, לשטוף את האמבטיה ואת המטרות עם לפחות 200 מיליליטר של מים כדי להסיר לחלוטין כל פלואורסאצין. כדי לדמיין חרוזים פלואורסצנטיים סטנדרטיים, הפעל מיזוג צבעים על-ידי הגדרה לשלוש בתיבה טווח Xgalvo והקש Live כדי להציג את השדה הנוכחי.התאם ידנית את מראה ההטיה, צבע המטרה ומיקרומטר המוקד לערכי האפור הגבוהים ביותר. לאחר מכן, להתאים לפי הצורך כדי לקבל דפוסים נאותים עבור סריקה אובייקטיבית, Z galvo, Z פלוס המטרה, מצבי לכידת סריקה לדוגמה. לאחר מכן, לחץ על בצע במצב סריקה לדוגמה כדי לאסוף את פונקציית התפשטות נקודת הדגימה עבור ביטול הטיה ו de-convolution.שנה את הלייזרים למצב שלושה צבעים ולחץ שוב על בצע. כדי להתחיל, להוסיף 100, 000 תאים אנטי מציגים כדי מוכן חמישה מילימטר קוטר מעגלי coverslip ולאפשר להם להסתפק 10 דקות. משמנים את מחזיק הדגימה ומוסיפים את המכסה לצד התא למעלה.לאחר מכן, הוסף טיפה של מדיה הדמיה בחלק האחורי של כיסוי. בורג מחזיק הדגימה על Piezo ולחץ על תמונה הבית. מצא תא מציג אנטיגן לתמונה וודא כי LLSM ותופת הדמיה מתפקדים כראוי.הקש Live כדי להציג את התמונה הנוכחית. לנוע לאורך Z כדי למצוא את המכסה ותאים. מצא את המרכז של תא מציג אנטיגן על ידי נע בכיוון Z, ולאחר מכן לחץ על עצור כדי להשהות את הלייזר.בדקו תלת-מימד והקלטו את הקנונים הרצויים. לחץ על מרכז ולאחר מכן לחץ על בצע כדי לאסוף את הנתונים. מנמיכים את הבמה למיקום העומס ומוסיפים 50 מיקרוליטרים של תאי T ומדיית הדמיה ירידה חכמה ישירות מעל הכיסוי.עדיף לתת טופס טיפה בקצה קצה פיפטה ולאחר מכן לגעת בקצה לנוזל האמבטיה. העלה את השלב בחזרה על-ידי לחיצה על החזרת תמונה. התחל בהדמיה.הקפד להגדיר את מחסנית Z הרצויה ואת אורך timelapse. לדוגמה, תמונה 60 Z ערימות בגודל צעד 0.4 מיקרומטר ומסגרת זמן קלט 500. הפסק להקליט לפני 500 מסגרות הם הגיעו כדי למנוע הלבנת תמונות.השתמש במצב חי כדי לחפש זוגות תאים וכאשר הוזנו הגדרות מוכנות ורצויות, הקש Execute כדי לאסוף נתונים. במחקר זה, עכבר ראשי 5CC7 T-תאים מבודדים ומוכנים ולאחר מכן הם בתמונה באמצעות מיקרוסקופ סריג אור גיליון. מוצגים כאן נתיב הקרן הנכון ויישור קרן כאשר בתמונה עם פלואורסצין.הסריקה האובייקטיבית אמורה להציג צורת X גדולה בהקרנות XZ ו- YZ שהיא סימטרית ככל האפשר. הם צריכים גם להיות מותאמים להיות קטנים של X ככל האפשר. סריקת Z galvo אמורה להציג אליפסה ב- XZ וב- XY עם נקודה אחת משני הצדדים.לבסוף, הן סריקת המטרה Z פלוס ואת הסריקה לדוגמה צריך להראות נקודות להסתכל עגול ככל האפשר. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן היה לראות את הדינמיקה הארבע מימדית של קולטני תאי T על משטח של תאי T. היתרון העיקרי של מיקרוסקופ זה טמון ביכולת לעקוב אחר יחידות פני השטח המדמיינות של קולטני תאי T ולקבל נתונים מכומתים מגודלם, תנועתם, עוצמת האות והפרשתם.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא איכות היישור שלך. יש ליישר את גיליון תאורת הסריג מדי יום ולא לעשות זאת כראוי יגרום להדמיה מעוותת. באופן דומה, איכות PSF שנאסף משפיע ישירות על איכות de-convolution אשר בסופו של דבר תוצאות איכות התמונה הסופית שלך.אחת הסיבות שיטה זו היא כל כך חזקה היא כי כל תא ותווית ניתן להחליף כדי לדמיין סוגים רבים של תאים ומולקולות. לכן, שיטה זו יכולה לשמש כדי לענות על כל שאלה הקשורה למעקב ארבע מימדי של מולקולות. אנו חושבים כי טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים לחקור שאלות חדשות בתחום הסחר המולקולרי.זה עדיין לא בשימוש נרחב בשל המערכת המסובכת אז אנחנו מקווים וידאו זה Jove ישפר את הנגישות לטכניקה. הלייזרים המשמשים במערכת הם מחלקה ארבע ולכן יש לנקוט זהירות מוחלטת כדי להבטיח בטיחות לייזר. נא בצע את אימוני בטיחות הלייזר הדרושים לפני השימוש בשיטה זו.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

הקרנה לפיטואסטרוגנים באמצעות קולטן אסטרוגן מבוסס תאים β הכתב Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

הדמיה של דינמיקה דיפוזיונית של ננו-ירדס זהב על קרום התא באמצעות מיקרוסקופיה אחת של ננו-חלקיקים בדארקפילד

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

כימות של התפלגות גליקוגן תת-תאית בסיבי שריר השלד באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מיקרוטובולים מקושרים ובודדים במבחנה על ידי מיקרוסקופיה TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...