Name: visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Vorremmo riconoscere i consigli e la guida del Dr. Vytas Bindokas presso l'Università di Chicago. Ringraziamo l'Integrated Light Microscopy Core Facility dell'Università di Chicago per aver sostenuto e mantenuto il microscopio a fogli luminosi a reticolo. Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 e dal NSF Career Award 1653782 (A J.H.). J.R. è supportato dal NSF Graduate Research Fellowships Program.

5C. C7-transgenico TOpo rag2 knockout in B10. Uno sfondo è stato utilizzato in questo studio secondo un protocollo approvato dal Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Chicago.
1. Raccogliere e attivare le cellule T
NOTA: questa parte del protocollo si basa su protocolli precedenti. Vedere citazioni per ulteriori dettagli20,21.
<ol><li>Eutanasia un 5C di 10-12 settimane. C7 topo t...

<ol>
	<li>Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physical+Basis+of+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+(TIRF)+Microscopy+and+Its+Cellular+Applications.">The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).</li><li>Shroff, H., White, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+Localization+Microscopy+(PALM)+of+Adhesion+Complexes.">Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes.</a> Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).</li><li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level.">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li><li>Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+speed+and+resolution+of+light+microscopy.">Advances in the speed and resolution of light microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).</li><li>. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: <a target="_blank" href="https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr">https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr</a> (2019)</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. , (2014).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+natural+killer+cells+maintain+long-term+antitumor+activity+by+epigenetic+imprinting+and+CD4++T+cell+help.">Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help.</a> Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).</li><li>Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Binds+to+B7-1+Only+In+Cis+on+the+Same+Cell+Surface.">PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).</li><li>Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly49C-dependent+control+of+MCMV+Infection+by+NK+cells+is+cis-regulated+by+MHC+Class+I+molecules.">Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules.</a> PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).</li><li>Sch&#246;neberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+cell+biology:+big+data+image+analytics+and+lattice+light-sheet+imaging+reveal+dynamics+of+clathrin-mediated+endocytosis+in+stem+cell-derived+intestinal+organoids.">4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids.</a> Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), 8302 (2019).</li><li>Cai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dynamic+microvillar+search+and+stabilization+during+ligand+detection+by+T+cells.">Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells.</a> Science. 356 (6338), 3118 (2017).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+Depletion+Initiates+Events+Leading+to+Granule+Secretion+at+the+Immunological+Synapse.">Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse.</a> Immunity. , (2015).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes.">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Peptide-Major+Histocompatibility+Complex+Ligand+Triggers+Digital+Cytokine+Secretion+in+CD4++T+Cells.">A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells.</a> Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).</li><li>Jansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+framework+for+analyzing+T+cell+receptor+scanning+of+peptides.">A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides.</a> Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).</li><li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart.">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li></ol>

Il protocollo presentato è stato ottimizzato per l'utilizzo di cellule CD4- T isolate da 5C. I topi transgenici C7 sullo strumento LLSM utilizzati, e quindi altri sistemi cellulari e LLSM potrebbero dover essere ottimizzati in modo diverso. Tuttavia, questo protocollo mostra la potenza dell'imaging 4D, in quanto può essere utilizzato per quantificare la dinamica di un recettore superficiale su un'intera cellula con la minima distorsione in condizioni fisiologiche. Pertanto, ci sono molte possibili applicazio...

La dinamica precisa del traffico e della diffazione delle molecole sulla superficie cellulare tridimensionale in tempo reale è stata un enigma da risolvere. La microscopia è sempre stata un equilibrio di velocità, sensibilità e risoluzione; se uno o due sono ingranditi, il terzo viene ridotto a icona. Pertanto, a causa delle piccole dimensioni e dell'immensa velocità con cui i recettori di superficie si muovono, il monitoraggio delle loro dinamiche è rimasto una grande sfida tecnologica per il campo della biologia cellulare. Ad esempio, molti studi sono stati condotti utilizzando la microscopia a fluorescenza interna totale (TIRF)1,2,3, che ha un'alta risoluzione temporale, ma può solo immaginare una fetta molto sottile della membrana a T-cell (100 nm), e quindi manca eventi che accadono più lontano nella cella. Queste immagini TIRF mostrano anche solo una sezione bidimensionale della cella. Al contrario, le tecniche di super-risoluzione, come la microscopia stocastica della ricostruzione ottica (STORM)4, la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM)5e la microscopia stimolata all'esaurimento delle emissioni (STED)6,possono superare il limite di diffrazione di Abbe della luce. Queste tecniche hanno un'elevata risoluzione spaziale (risoluzione di 20 nm)4,5,6,7, ma spesso richiedono molti minuti per acquisire un'immagine bidimensionale (2D) o tridimensionale (3D) completa e pertanto la risoluzione temporale viene persa. Inoltre, tecniche come STORM e PALM che si basano su segnali lampeggianti possono avere imprecisioni nel conteggio8,9. La microscopia elettronica ha di gran lunga la risoluzione più alta (fino a risoluzione fino alle 17)10; può anche essere condotta tridimensionalmente con la microscopia elettronica a scansione del fascio ionico focalizzato (FIB-SEM), con conseguente fino a 3 nm XY e 500 nm - risoluzione11. Tuttavia, qualsiasi forma di microscopia elettronica richiede una dura preparazione dei campioni e può essere condotta solo con cellule o tessuti fissi, eliminando la possibilità di imaging di campioni vivi nel tempo.
Le tecniche per ottenere l'alta risoluzione spatiotemporale necessaria per identificare la dinamica delle molecole superficiali e intracellulari nelle cellule vive nella loro vera natura 3D fisiologica sono state sviluppate solo di recente. Una di queste tecniche è Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, che utilizza un foglio luminoso strutturato per ridurre drasticamente il fotobleaching. Sviluppato nel 2014 dal premio Nobel Eric Betzig, l'alta risoluzione assiale, il basso fotosbiancamento e il rumore di fondo, e la capacità di visualizzare contemporaneamente centinaia di piani per campo visivo rendono i microscopi LLS superiori ai microscopi widefield, TIRF e confocal e confocal e confocal12,13,14,15,16,17,18. Questa tecnica di imaging quadridimensionale (x, y, z e time), mentre ancora la diffrazione limitata (risoluzione XYz da 200 nm) ha un'incredibile risoluzione temporale (abbiamo raggiunto una frequenza fotogrammi di circa 100 fps, con un'immagine cellulare ricostruita 3D con 0,85 secondi per fotogramma) per l'acquisizione spaziale 3D.
Il LLSM può essere generalmente utilizzato per monitorare la dinamica in tempo reale di qualsiasi molecola all'interno di qualsiasi cellula a livello di singola molecola e singola cellula, in particolare quelle nelle cellule altamente motili come le cellule immunitarie. Ad esempio, qui mostriamo come utilizzare LLSM per visualizzare le dinamiche del recettore delle cellule T (TCR). Le cellule T sono le cellule efsiate del sistema immunitario adattivo. I TCR sono responsabili del riconoscimento dei ligandi peptide-MHC (pMHC) visualizzati sulla superficie delle cellule che presentano l'antigene (APC), che determina la selezione, lo sviluppo, la differenziazione, il destino e la funzione di una cellula T. Questo riconoscimento si verifica nell'interfaccia tra le cellule T e gli APC, con conseguente clustering del recettore localizzato per formare quella che viene chiamata sinapsi immunologica. Mentre è noto che i TCR nella sinapsi immunologica sono imperativi per la funzione dell'effettore delle cellule T, ancora sconosciuti sono i meccanismi sottostanti del traffico di TCR in tempo reale verso la sinapsi. LLSM ci ha permesso di visualizzare in tempo reale le dinamiche dei TCR prima e dopo il traffico verso la sinapsi con la conseguente interazione pMHC-TCR (Figura 1). Il LLSM può quindi essere utilizzato per risolvere le attuali questioni delle dinamiche formative delle TCR e fornire informazioni per capire come una cellula distingue tra antigeni auto ed estranei.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm round coverslips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>502040</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70um Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7201431</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR &#946; chain Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109215</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>X&#38;Y Cell Culture</td>
			<td>FBS-500</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Denisty gradient reagent for T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lattice Light-Sheet Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope Used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLSpy</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK</td>
			<td>Elimbio</td>
			<td>Custom Synthesis</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penacillin/Streptamycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122_3683884612</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse IL-2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0523</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slidebook</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSM imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Dissection Tools</td>
			<td>Nova-Tech International</td>
			<td>DSET10</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231710126</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44685</td>
			<td>For preparing Fab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy

La segnalazione e la funzione di una cellula sono dettate dalle strutture dinamiche e dalle interazioni dei suoi recettori superficiali. Per comprendere veramente la relazione struttura-funzione di questi recettori in situ, dobbiamo visualizzarli e tracciarli sulla superficie della cellula viva con una risoluzione spatiotemporale sufficiente. Qui mostriamo come utilizzare la microscopia Lattice Light-Sheet (LLSM) recentemente sviluppata per immagini di recettori delle cellule T (TCR) in quarta dimensione (4D, spazio e tempo) alla membrana cellulare attiva. Le cellule T sono una delle principali cellule efcomeotrici del sistema immunitario adattivo, e qui abbiamo usato le cellule T come esempio per dimostrare che la segnalazione e la funzione di queste cellule sono guidate dalle dinamiche e dalle interazioni dei TCR. LLSM consente l'imaging 4D con una risoluzione spatiotemporale senza precedenti. Questa tecnica di microscopia può quindi essere generalmente applicata a una vasta gamma di molecole superficiali o intracellulari di cellule diverse in biologia.

Qui, descriviamo l'isolamento, la preparazione e l'imaging del mouse primario 5C. C7 cellule T utilizzando un microscopio a fogli di luce reticolo. Durante la sezione 3, è imperativo allineare correttamente il microscopio e raccogliere PSF ogni giorno con cui deconvolve i dati dopo la raccolta. Nella Figura 2, vengono mostrate le immagini di allineamento corrette che verranno visualizzate durante l'allineamento del microscopio. Figura 2A e <str...

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Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

L'obiettivo di questo protocollo è quello di mostrare come utilizzare la microscopia Lattice Light-Sheet per visualizzare in modo quadridimensionale le dinamiche del recettore superficiale nelle cellule vive. Qui vengono mostrati i recettori delle cellule T su CD4- cellule T primarie.

Visualizzazione delle dinamiche del recettore a cellule T di superficie in modo quad-dimensionale utilizzando la microscopia A fogli di luce a reticolo

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

La microscopia a fogli di luce reticolare è una potente tecnologia di imaging, ma pochi laboratori al mondo sono in grado di usarla. Questo protocollo fornisce una panoramica dettagliata di come utilizzare il microscopio a fogli di luce reticolare disponibile in commercio. È un sistema estremamente potente in grado di imaging quadridimensionale di singole cellule o embrioni che consente il tracciamento in tempo reale delle molecole.Il vantaggio principale di questa tecnica è che può immagini tridimensionale singole cellule o organi vivi con alta risoluzione spaziotemporale e sbiancamento fotografico minimo. Il modello reticolare della lastra luminosa ci consente di campioni di immagini ad alta velocità e ottenere video in tempo reale di cellule e organi viventi tridimensionali con dettagli molecolari che altre tecniche non possono ottenere. Questo primo protocollo video che mostra come per noi microscopia a foglio luminoso reticolare per l'immagine di una singola cella quadridimensionale.Questa è una tecnica molto complicata a causa dell'allineamento e della preparazione del campione. E crediamo che la dimostrazione visiva migliorerà l'accessibilità permettendo a più scienziati di immaginiamo molte molecole, cellule e organi diversi in biologia. Per iniziare questa procedura, incubare cinque coverlips rotonde millimetri con 0,1% poli-L-lisina a temperatura ambiente per 10 minuti.Aspirare il liquido e lasciare asciugare naturalmente l'aria dei copripavimenti. Aggiungere quindi tre millilitri di gradiente di densità a un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere con cura le cellule per quanto riguarda la caduta sul bordo del tubo.Centrifuga a 930 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, rimuovere con cura il sottile strato intermedio di celle tra il supporto completo e il reagente gradiente di densità assicurandosi di mettere ogni tipo di cella in un tubo conico separato. Centrifugare a 300 volte g per cinque minuti per lavare le cellule.Scartare il supernatante e aggiungere cinque millilitri di RPMI ai tubi delle cellule T e CH27. Ripetere il lavaggio con RPMI fresco fino a quando non sono stati eseguiti tre lavaggi totali. Quindi, rimescolare le cellule in ogni tubo con un millilitro di RPMI completo e contare le cellule con un emocitometro.Resuspend un milione di cellule che presentano antigeni in 500 microlitri di RPMI completo e aggiungere 10 MCC micromolare. Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per tre ore. Successivamente, rimospendì un milione di cellule T in 500 microlitri di RPMI completo.Aggiungere due microgrammi di anti-TCR beta Alexa 488 etichettato FAB e incubare a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Quindi, centrifuga entrambe le cellule a 300 volte g per cinque minuti e scarta il supernatante. Aggiungere 500 microlitri di RPMI completo e ripetere la centrifuga per lavare le cellule.Ripetere il lavaggio con RPMI fresco fino a quando non sono stati eseguiti tre lavaggi totali scartando il supernatante dopo ogni lavaggio. Successivamente, resuspend entrambi i tipi di cellule in 500 microlitri di supporti di imaging. In primo luogo, aggiungere 10 millilitri di acqua e 30 microlitri di fluoresceina al bagno LLSM.Premete Home immagine per spostare l'oggetto nella posizione dell'immagine e guardate un singolo motivo a fascio laser di Bessel. Allineare il raggio laser utilizzando la guida e la regione di interesse preimpostata per rendere il fascio un modello sottile bilanciato in tutte le direzioni. Il fascio dovrebbe anche apparire focalizzato nella fotocamera del finder.Utilizzare i due regolatori di inclinazione dello specchio, il micrometro di messa a fuoco superiore e il colore obiettivo per regolare il fascio. Successivamente, lavare il bagno e gli obiettivi con almeno 200 millilitri di acqua per rimuovere completamente qualsiasi fluoresceina. Per visualizzare le perline fluorescenti standard, attivare il dithering impostando su tre nella casella intervallo Xgalvo e premere Live per visualizzare il campo corrente.Regola manualmente lo specchio di inclinazione, il colore obiettivo e il micrometro di messa a fuoco per i valori grigi più alti. Quindi, regola se necessario per ottenere modelli adeguati per le modalità di acquisizione della scansione obiettiva, Z galvo, Z plus e sample scan. Successivamente, premere Esegui in modalità di scansione di esempio per raccogliere la funzione di diffusione del punto di esempio per la de-skewing e la de-convoluzione.Modificare i laser in tre modalità colore e premere di nuovo Esegui. Per iniziare, aggiungere 100.000 cellule anti-presentazione al coverslip circolare preparato di cinque millimetri di diametro e consentire loro di depositarsi per 10 minuti. Ungere il portacampioni e aggiungere il coverslip al lato della cella verso l'alto.Aggiungere quindi una goccia di supporti di imaging sul retro del coverslip. Avvitare il portacampioni sul Piezo e premere Image Home. Trova una cella di presentazione dell'antigene su immagine e assicurati che l'LLSM e il software di imaging funzionino correttamente.Premere Live per visualizzare l'immagine corrente. Spostarsi lungo Z per trovare il coverslip e le celle. Trovare il centro di una cella che presenta l'antigene muovendosi nella direzione Z, quindi premere Interrompi per mettere in pausa il laser.Controllare il 3D e inserire le impostazioni desiderate. Premere Centro e quindi Esegui per raccogliere i dati. Abbassare lo stadio alla posizione di carico e aggiungere 50 microlitri di celle A e mezzi di imaging per quanto riguarda la goccia direttamente sopra il coverslip.È meglio lasciare una forma di goccia all'estremità della punta della pipetta e quindi toccare la punta al liquido del bagno. Sollevare nuovamente il palco facendo clic su Ritorno immagine. Inizia l'imaging.Assicurarsi di impostare la pila Z desiderata e la lunghezza timelapse. Ad esempio, l'immagine 60 Z si impila con una dimensione del passo di 0,4 micrometri e immette 500 tempi. Interrompere la registrazione prima di raggiungere 500 fotogrammi per evitare lo sbiancamento delle foto.Utilizzare la modalità live per cercare coppie di celle e quando sono state immesse le impostazioni pronte e desiderate, premere Esegui per raccogliere dati. In questo studio, le cellule T 5CC7 del topo primario vengono isolate e preparate e vengono quindi immagini utilizzando un microscopio a foglio luminoso reticolare. Qui sono mostrati il corretto percorso del fascio e l'allineamento del fascio quando viene immaginato con fluoresceina.La scansione oggettiva dovrebbe mostrare una grande forma a X nelle proiezioni XZ e YZ che sia il più simmetrica possibile. Dovrebbero anche essere regolati per essere il più piccoli possibile di una X. La scansione galvo Z dovrebbe mostrare un ovale in XZ e XY con un singolo punto su entrambi i lati.Infine, sia la scansione obiettivo Z plus che la scansione del campione dovrebbero mostrare punti che sembrano il più rotondi possibile. Usando questo protocollo, si potevano vedere le dinamiche quadridimensionali dei recettori delle cellule T su una superficie di cellule T. Il vantaggio principale di questo microscopio risiede nella capacità di tracciare le unità superficiali visualizzazionete dei recettori delle cellule T e di ottenere dati quantificati dalle loro dimensioni, movimento, intensità del segnale ed escrementi.La cosa più importante da ricordare è la qualità del tuo allineamento. La scheda luminosa del reticolo deve essere allineata quotidianamente e non farlo correttamente si tradurrà in un'immagine distorta. Allo stesso modo, la qualità delle FPF raccolte influisce direttamente sulla qualità della devoluzione che alla fine si traduce nella qualità dell'immagine finale.Uno dei motivi per cui questo metodo è così potente è perché ogni cellula ed etichetta può essere sostituita per visualizzare molti tipi di cellule e molecole. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per rispondere a qualsiasi domanda relativa al tracciamento quadridimensionale delle molecole. Pensiamo che questa tecnica spianerà la strada ai ricercatori per esplorare nuove questioni nel campo del traffico molecolare.Non è ancora ampiamente utilizzato a causa del complicato sistema, quindi speriamo che questo video jove migliori l'accessibilità alla tecnica. I laser utilizzati sul sistema sono di classe quattro, quindi è necessario prestare assoluta cautela per garantire la sicurezza laser. Si prega di eseguire l'allenamento di sicurezza laser necessario prima di utilizzare questo metodo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Ricerca

Biochimica

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

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Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

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Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

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Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

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Monitoraggio delle dinamiche di interazione proteina-RNA in vivo ad alta risoluzione temporale utilizzando χCRAC

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Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

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Utilizzo della microscopia a microfluidica e fluorescenza per studiare la dinamica di assemblaggio di singoli filamenti e fasci di actina

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