Name: visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

우리는 시카고 대학의 비타스 빈도카 박사의 조언과 지도를 인정하고 싶습니다. 우리는 격자 광 시트 현미경을 지원하고 유지에 대한 시카고 대학의 통합 빛 현미경 코어 시설에 감사드립니다. 이 작품은 NIH 뉴 이노베이터 어워드 1DP2AI14245 및 NSF 커리어 어워드 1653782(J.H.)에 의해 지원되었습니다. J.R.은 NSF 대학원 연구 펠로우십 프로그램에 의해 지원됩니다.

5C. B10에서 C7 TCR 형질전환 RAG2 녹아웃 마우스. 배경은 시카고 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라이 연구에서 사용되었다.
1. 수확 및 T 세포 활성화
참고: 프로토콜의 이 부분은 이전 프로토콜을 기반으로 합니다. 자세한 내용은 인용을 참조하십시오20,21.
<ol><li>10-12 주 된 5C를 ...

<ol>
	<li>Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physical+Basis+of+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+(TIRF)+Microscopy+and+Its+Cellular+Applications.">The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).</li><li>Shroff, H., White, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+Localization+Microscopy+(PALM)+of+Adhesion+Complexes.">Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes.</a> Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).</li><li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level.">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li><li>Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+speed+and+resolution+of+light+microscopy.">Advances in the speed and resolution of light microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).</li><li>. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: <a target="_blank" href="https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr">https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr</a> (2019)</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. , (2014).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+natural+killer+cells+maintain+long-term+antitumor+activity+by+epigenetic+imprinting+and+CD4++T+cell+help.">Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help.</a> Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).</li><li>Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Binds+to+B7-1+Only+In+Cis+on+the+Same+Cell+Surface.">PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).</li><li>Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly49C-dependent+control+of+MCMV+Infection+by+NK+cells+is+cis-regulated+by+MHC+Class+I+molecules.">Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules.</a> PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).</li><li>Sch&#246;neberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+cell+biology:+big+data+image+analytics+and+lattice+light-sheet+imaging+reveal+dynamics+of+clathrin-mediated+endocytosis+in+stem+cell-derived+intestinal+organoids.">4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids.</a> Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), 8302 (2019).</li><li>Cai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dynamic+microvillar+search+and+stabilization+during+ligand+detection+by+T+cells.">Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells.</a> Science. 356 (6338), 3118 (2017).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+Depletion+Initiates+Events+Leading+to+Granule+Secretion+at+the+Immunological+Synapse.">Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse.</a> Immunity. , (2015).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes.">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Peptide-Major+Histocompatibility+Complex+Ligand+Triggers+Digital+Cytokine+Secretion+in+CD4++T+Cells.">A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells.</a> Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).</li><li>Jansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+framework+for+analyzing+T+cell+receptor+scanning+of+peptides.">A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides.</a> Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).</li><li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart.">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li></ol>

제시된 프로토콜은 5C로부터 단리된CD4+ T 세포의 사용을 위해 최적화되었다. LLSM 계측기상 C7 형질전환 마우스가 사용되고, 따라서 다른 세포 시스템 및 LLSM은 다르게 최적화되어야 할 수도 있다. 그러나, 이 프로토콜은 생리적 조건에서 최소한의 왜곡으로 전체 세포에 표면 수용체의 역학을 정량화하는 데 사용될 수 있기 때문에 4D 이미징의 힘을 보여줍니다. 따라서 이 기술의 향후 응용 프...

3차원 세포 표면에서 실시간으로 트래피킹하고 확산되는 분자의 정확한 역학은 해결해야 할 수수께끼였습니다. 현미경 검사법은 항상 속도, 감도 및 해상도의 균형이었습니다. 하나 또는 두 개가 최대화되면 세 번째가 최소화됩니다. 따라서 표면 수용체가 이동하는 작은 크기와 엄청난 속도로 인해 역학을 추적하는 것은 세포 생물학 분야의 주요 기술적 과제로 남아 있습니다. 예를 들어, 많은 연구는 전체 내부 반사 형광을 사용하여 실시되었습니다 (TIRF) 현미경 검사법1,2,3,이는 높은 측두력을 가지고 있지만, T 세포 막의 매우 얇은 조각을 이미지 할 수 있습니다 (~ 100 nm), 따라서 세포에서 멀리 일어나는 이벤트를 놓친다. 이러한 TIRF 이미지는 또한 세포의 2차원 섹션만을 보여준다. 이와 대조적으로, 경질 광학 재건 현미경 검사법(STORM)4,광활성화 국소화 현미경(PALM)5및 자극방출 고갈 현미경(STED)6,빛의 절제 한계를 극복할 수 있는 초고해상도 기술. 이러한 기술은 높은 공간 해상도 (~ 20 nm 해상도)4,5,6,7,그러나 그들은 종종 전체 2 차원 (2D) 또는 3 차원 (3D) 이미지를 취득하는 데 많은 시간이 소요되므로 시간 해상도가 손실됩니다. 또한 깜박이는 신호에 의존하는 STORM 및 PALM과 같은 기술은8,9를계산하는 데 부정확할 수 있습니다. 전자 현미경 검사법은 지금까지 가장 높은 해상도 (최대 50 오후 해상도)10; 그것은 심지어 최대 3 nm XY 및 500 nm Z 해상도11의결과로 집중 된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 검사법 (FIB-SEM)으로 3 차원으로 수행 될 수 있습니다. 그러나, 전자 현미경 검사법의 어떤 양식든지 가혹한 견본 준비를 요구하고 고정형 세포 또는 조직으로만, 시간이 지남에 따라 화상 진찰 살아있는 견본의 가능성을 제거하.
그들의 진정한 생리학적 3D 성질에서 살아있는 세포에서 표면 및 세포내 분자의 역학을 식별하는 데 필요한 높은 시공간적 분해능을 얻는 기술은 최근에 개발되고 있다. 이러한 기술 중 하나는 격자 빛 시트 현미경 검사법 (LLSM)12,이는 크게 광 표백을 낮추기 위해 구조화 된 빛 시트를 활용. 2014년 노벨상 수상자 에릭 베치그(Eric Betzig)가 개발한 높은 축 해상도, 낮은 광표백 및 배경 잡음, 그리고 시야당 수백 개의 평면을 동시에 이미지화할 수 있는 능력은 LLS 현미경을 광시야, TIRF 및 공초점 현미경12,13,14,15,16,18,18, 19보다우수하게 만듭니다. 이 4차원(x, y, z 및 시간) 이미징 기술은 여전히 회절 제한(~200 nm XYZ 해상도)을 유지하면서 놀라운 시간 해상도(약 100fps의 프레임 속도를 달성하여 프레임당 0.85초로 3D 재구성셀 이미지를 생성함)를 가지고 있습니다.
LLSM은 일반적으로 단일 분자 및 단일 세포 수준에서 임의의 세포 내의 임의의 분자의 실시간 역학을 추적하는 데 사용될 수 있으며, 특히 면역 세포와 같은 매우 운동성 세포에서 그. 예를 들어, 우리는 T 세포 수용체 (TCR) 역학을 시각화하기 위해 LLSM을 사용하는 방법을 여기에 보여줍니다. T 세포는 적응형 면역 계통의 이펙터 세포이다. TRS는 T 세포의 선택, 발달, 분화, 운명 및 기능을 결정하는 항원 제시 세포(APC)의 표면에 표시되는 펩티드-MHC(pMHC) 리간드를 인식하는 책임이 있다. 이 인식은 T 세포와 APC 사이의 인터페이스에서 발생, 면역 시냅스라고 불리는 것을 형성하기 위해 국지적 인 수용체 클러스터링의 결과. 면역 학적 시냅스에서 TCR이 T 세포 이펙터 기능에 필수적이라고 알려져 있지만, 아직 알려지지 않은 시냅스로 실시간 TCR 인신 매매의 기본 메커니즘은 알 수 없습니다. LLSM은 결과 pMHC-TCR 상호 작용으로 시냅스로 인신 매매 전후의 TCR의 역학을 실시간으로 시각화할 수 있게 해 주었으며(그림1). 따라서 LLSM은 TCRs의 조형 역학에 대한 현재의 질문을 해결하고 세포가 자기 항원과 외국 항원을 구별하는 방법을 이해하는 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm round coverslips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>502040</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70um Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7201431</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR &#946; chain Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109215</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>X&#38;Y Cell Culture</td>
			<td>FBS-500</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Denisty gradient reagent for T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lattice Light-Sheet Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope Used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLSpy</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK</td>
			<td>Elimbio</td>
			<td>Custom Synthesis</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penacillin/Streptamycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122_3683884612</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse IL-2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0523</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slidebook</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSM imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Dissection Tools</td>
			<td>Nova-Tech International</td>
			<td>DSET10</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231710126</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44685</td>
			<td>For preparing Fab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy

세포의 신호 및 기능은 표면 수용체의 동적 구조와 상호 작용에 의해 결정됩니다. 진정으로 이 수용체의 구조 기능 관계를 이해하기 위하여는, 우리는 충분한 주분체 해결책을 가진 살아있는 세포 표면에 그(것)들을 구상하고 추적할 필요가 있습니다. 여기에서 우리는 살아있는 세포막에 있는 T 세포 수용체 (TCRs) 4 차원 (4D, 공간 및 시간)를 심상하기 위하여 최근에 개발한 격자 빛 시트 현미경 검사법 (LLSM)를 사용하는 방법을 보여줍니다. T 세포는 적응형 면역 계통의 주요 이펙터 세포 중 하나이며, 여기서 우리는 이러한 세포의 신호및 기능이 TCRs의 역학 및 상호작용에 의해 구동된다는 것을 보여주기 위해 T 세포를 예로사용하였다. LLSM은 전례 없는 시공간 해상도로 4D 이미징을 가능하게 합니다. 이 현미경 기술은 그러므로 생물학에 있는 다른 세포의 표면 또는 세포내 분자의 넓은 배열에 일반적으로 적용될 수 있습니다.

여기서, 우리는 1차 마우스 5C의 분리, 준비 및 이미징에 대해 설명한다. 격자 광 시트 현미경을 사용하여 C7 T 세포. 섹션 3 동안, 현미경을 올바르게 정렬하고 수집 후 데이터를 디선볼로 하는 매일 PSF를 수집하는 것이 필수적입니다. 그림 2에서는현미경을 정렬할 때 볼 수 있는 올바른 정렬 이미지를 보여 준다. 그림 2A 및 도 ...

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Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

이 프로토콜의 목표는 살아있는 세포에 있는 표면 수용체 역학을 4 차원으로 가시화하기 위하여 격자 빛 시트 현미경 검사를 사용하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 여기서CD4+ 원발성 T 세포상에 T 세포 수용체가 도시된다.

격자 광 시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4 차원 시각화

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

격자 광 시트 현미경 검사는 강력한 이미징 기술이지만, 세계에서 몇 실험실은 그것을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 시판되는 격자 광시트 현미경을 사용하는 방법에 대한 자세한 개요를 제공합니다. 그것은 분자의 실시간 추적을 허용하는 개별 적인 세포 또는 태아의 4 차원 화상 진찰의 가능하게 하는 매우 강력한 시스템입니다.이 기술의 주요 장점은 높은 현시성 해상도와 최소한의 사진 표백을 가진 단일 라이브 세포 또는 장기를 입체적으로 이미지할 수 있다는 것입니다. 라이트 시트의 격자 패턴은 우리가 고속 이미지 샘플을 하고 다른 기술이 달성 할 수없는 분자 세부 사항과 3 차원 살아있는 세포와 장기의 실시간 비디오를 얻을 수 있습니다. 이 첫 번째 비디오 프로토콜은 단일 셀을 4차원으로 이미지화하기 위해 빛 시트 현미경 검사를 격자화하는 방법을 보여줍니다.이것은 정렬 및 샘플 준비로 인해 매우 복잡한 기술입니다. 그리고 우리는 시각적 인 데모가 더 많은 과학자들이 생물학에서 많은 다른 분자, 세포 및 장기를 이미지 할 수 있도록함으로써 접근성을 향상시킬 것이라고 믿습니다. 이 절차를 시작하려면 실온에서 0.1% 폴리-L-리신으로 5mm 원형 커버립을 10분 동안 배양합니다.액체를 흡입하고 커버립이 자연스럽게 건조하게 합니다. 다음으로, 15 밀리리터 원내 튜브에 밀도 그라데이션 3밀리리터를 추가합니다. 조심스럽게 튜브의 가장자리에 세포를 드롭 현명한 추가합니다.원심분리기는 930g, 섭씨 4도에서 10분 간. 그 후, 전체 미디어와 밀도 그라데이션 시약 사이의 얇은 중간 층세포를 조심스럽게 제거하여 각 세포 유형을 별도의 원문 튜브에 넣도록 합니다. 세포를 세척하는 5 분 동안 300 배 g에서 원심 분리기.상체를 버리고 T 세포및 CH27 세포의 튜브에 RPMI의 5 밀리리터를 추가합니다. 세 총 세척이 수행 될 때까지 신선한 RPMI로 세척을 반복합니다. 그런 다음, 완전한 RPMI의 1 밀리리터로 각 튜브의 세포를 다시 중단하고 혈종계로 세포를 계산합니다.완전한 RPMI의 500 마이크로 리터에 백만 항원 제시 세포를 다시 중단하고 10 마이크로 몰러 MCC를 추가합니다. 37도에서 3시간 동안 이산화탄소 5%를 배양합니다. 그 후, 완전한 RPMI의 500 마이크로 리터에서 백만 개의 T 세포를 다시 중단합니다.안티 TCR 베타 알렉사 488 라벨 의 마이크로 그램을 추가하고 30 분 동안 5 %의 이산화탄소와 섭씨 37도에서 배양. 다음으로, 두 세포를 300배 g에서 5분간 원심분리하고 상체부를 폐기한다. 완전한 RPMI의 500 마이크로리터를 추가하고 세포를 세척하는 원심분리기를 반복합니다.세정제를 세척할 때마다 3회 세척이 수행될 때까지 신선한 RPMI로 세척을 반복합니다. 그 후, 이미징 미디어의 500 마이크로리터에서 두 세포 유형을 다시 중단합니다. 먼저 LLSM 욕조에 10밀리리터의 물과 30마이크로리터의 형광을 넣습니다.이미지 홈을 눌러 물체를 이미지 위치로 이동하고 하나의 베셀 레이저 빔 패턴을 봅니다. 가이드와 관심 의 사전 설정 영역을 사용하여 레이저 빔을 정렬하여 빔을 모든 방향으로 균형잡힌 얇은 패턴으로 만듭니다. 빔도 파인더 카메라에 초점을 맞춘 것처럼 보입니다.두 개의 미러 틸트 어저스터, 상단 초점 마이크로미터 및 목표 색상을 사용하여 빔을 조정합니다. 다음으로, 목욕과 목적을 최소 200 밀리리터의 물로 씻어 형광을 완전히 제거하십시오. 표준 형광 구슬을 이미지하려면 Xgalvo 레인지 박스에서 3개로 설정하여 디터를 켜고 Live를 눌러 현재 필드를 봅니다.가장 높은 회색 값을 위해 기울기 거울, 목표 색상 및 초점 마이크로미터를 수동으로 조정합니다. 그런 다음 객관적인 스캔, Z 갈보, Z 플러스 목표 및 샘플 스캔 캡처 모드에 대한 적절한 패턴을 얻기 위해 필요에 따라 조정합니다. 그 후 샘플 스캔 모드에서 실행을 눌러 왜곡 해제 및 컨볼루션을 위한 샘플 포인트 스프레드 함수를 수집합니다.레이저를 세 가지 색상 모드로 변경하고 실행을 다시 누릅니다. 시작하려면, 준비된 5밀리미터 직경 순환 커버슬립에 100, 000 안티 제시 세포를 추가하고 10 분 동안 정착 할 수 있도록. 샘플 홀더에 기름을 바르고 커버슬립을 셀 측에 위로 추가합니다.다음으로, 커버슬립 의 뒷면에 이미징 미디어를 한 방울 추가합니다. 샘플 홀더를 피에조에 나사로 조이고 이미지 홈을 누릅니다. 이미지에 항원 제시 셀을 찾아 LLSM 및 이미징 소프트웨어가 제대로 작동하는지 확인합니다.라이브를 눌러 현재 이미지를 봅니다. 덮개 슬립과 세포를 찾기 위해 Z를 따라 이동합니다. Z 방향으로 이동하여 항원 제시 세포의 중심을 찾은 다음 중지를 눌러 레이저를 일시 중지합니다.3D를 확인하고 원하는 설정을 입력합니다. 센터를 누를 다음 실행을 눌러 데이터를 수집합니다. 스테이지를 하중 위치로 낮추고 50마이크로리터의 T-세포및 이미징 미디어를 커버슬립 위에 직접 드롭와이즈하게 추가합니다.파이펫 팁 끝에 양식을 떨어뜨린 다음 팁을 목욕 액체에 만지는 것이 가장 좋습니다. 이미지 반환을 클릭하여 스테이지를 다시 올립니다. 이미징을 시작합니다.원하는 Z 스택과 타임랩스 길이를 설정해야 합니다. 예를 들어 이미지 60 Z는 0.4 마이크로미터 스텝 크기와 입력 500 시간 프레임으로 스택됩니다. 사진 표백을 피하기 위해 500 프레임에 도달하기 전에 녹화를 중지합니다.라이브 모드를 사용하여 셀 쌍을 검색하고 준비되고 원하는 설정이 입력되면 실행을 눌러 데이터를 수집합니다. 이 연구에서는, 1차 마우스 5CC7 T 세포는 단리되고 제조되고 격자 광시트 현미경을 사용하여 심화됩니다. 여기에 는 형광체로 이미지될 때 올바른 빔 경로와 빔 정렬이 표시됩니다.목표 검사는 XZ 및 YZ 프로젝션에 가능한 한 대칭적인 큰 X 모양을 보여줘야 합니다. 또한 가능한 한 X의 작도록 조정해야 합니다. Z 갈보 스캔은 양쪽에 하나의 점이있는 XZ와 XY의 타원형을 보여줘야합니다.마지막으로 Z 플러스 객관적인 스캔과 샘플 스캔 모두 가능한 한 둥글게 보이는 점을 보여줘야 합니다. 이 프로토콜을 사용하여 T 세포 표면에 T 세포 수용체의 4 차원 역학을 볼 수 있었습니다. 이 현미경의 주요 장점은 T 세포 수용체의 시각화 된 표면 단위를 추적하고 크기, 운동, 신호 강도 및 배설물에서 정량화된 데이터를 얻는 능력에 있습니다.기억해야 할 가장 중요한 것은 정렬의 품질입니다. 격자 광시트는 매일 정렬되어야 하며 제대로 수행하지 않으면 왜곡된 이미징이 발생합니다. 마찬가지로 수집된 PSF의 품질은 컨볼루션의 품질에 직접적인 영향을 미치므로 궁극적으로 최종 이미지의 품질이 향상됩니다.이 방법이 이렇게 강력한 이유 중 하나는 각 세포와 라벨을 대체하여 많은 세포 유형과 분자를 시각화할 수 있기 때문입니다. 따라서,이 방법은 분자의 4 차원 추적과 관련된 질문에 대답하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이 기술이 연구원이 분자 인신 매매 분야 내의 새로운 질문을 탐구하는 길을 열 것이라고 생각합니다.복잡한 시스템으로 인해 아직 널리 사용되지 않으므로 이 Jove 비디오가 기술에 대한 접근성을 향상시킬 수 있기를 바랍니다. 시스템에 사용되는 레이저는 클래스 4이므로 레이저 안전을 보장하기 위해 절대주의를 기울여야합니다. 이 방법을 사용하기 전에 필요한 레이저 안전 교육을 받으십시오.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

연구

생화학

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

세포 기반 에스트로겐 수용체를 사용하여 식물에스트로겐에 대한 검사 β 리포터 분석

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

χCRAC를 사용하여 높은 시간 분해능에서 생체 내 단백질-RNA 상호 작용 역학 모니터링

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

단일 나노 입자 암장 현미경 검사를 사용하여 세포 막에 금 나노로드의 확산 역학 시각화

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

투과 전자 현미경을 이용한 골격근섬유의 세포하 글리코겐 분포의 정량화

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...