Name: visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Vi vil gjerne anerkjenne råd og veiledning fra Dr. Vytas Bindokas ved University of Chicago. Vi takker Integrated Light Microscopy Core Facility ved University of Chicago for å støtte og vedlikeholde gitterets lysarkmikroskop. Dette arbeidet ble støttet av NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 og NSF Career Award 1653782 (Til J.H.). J.R. støttes av NSF Graduate Research Fellowships Program.

5C. C7 TCR-transgene RAG2 knockout mus i B10. En bakgrunn ble brukt i denne studien i henhold til en protokoll godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Chicago.
1. Høst og aktiver T-celler
MERK: Denne delen av protokollen er basert på tidligere protokoller. Se sitater for nærmere detaljer20,21.
<ol><li>Euthanize en 10-12 uke gammel 5C. C7 transgene musen til begge kjønn...

<ol>
	<li>Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physical+Basis+of+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+(TIRF)+Microscopy+and+Its+Cellular+Applications.">The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).</li><li>Shroff, H., White, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+Localization+Microscopy+(PALM)+of+Adhesion+Complexes.">Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes.</a> Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).</li><li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level.">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li><li>Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+speed+and+resolution+of+light+microscopy.">Advances in the speed and resolution of light microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).</li><li>. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: <a target="_blank" href="https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr">https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr</a> (2019)</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. , (2014).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+natural+killer+cells+maintain+long-term+antitumor+activity+by+epigenetic+imprinting+and+CD4++T+cell+help.">Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help.</a> Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).</li><li>Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Binds+to+B7-1+Only+In+Cis+on+the+Same+Cell+Surface.">PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).</li><li>Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly49C-dependent+control+of+MCMV+Infection+by+NK+cells+is+cis-regulated+by+MHC+Class+I+molecules.">Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules.</a> PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).</li><li>Sch&#246;neberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+cell+biology:+big+data+image+analytics+and+lattice+light-sheet+imaging+reveal+dynamics+of+clathrin-mediated+endocytosis+in+stem+cell-derived+intestinal+organoids.">4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids.</a> Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), 8302 (2019).</li><li>Cai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dynamic+microvillar+search+and+stabilization+during+ligand+detection+by+T+cells.">Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells.</a> Science. 356 (6338), 3118 (2017).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+Depletion+Initiates+Events+Leading+to+Granule+Secretion+at+the+Immunological+Synapse.">Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse.</a> Immunity. , (2015).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes.">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Peptide-Major+Histocompatibility+Complex+Ligand+Triggers+Digital+Cytokine+Secretion+in+CD4++T+Cells.">A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells.</a> Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).</li><li>Jansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+framework+for+analyzing+T+cell+receptor+scanning+of+peptides.">A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides.</a> Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).</li><li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart.">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li></ol>

Den presenterte protokollen ble optimalisert for bruk av CD4+ T-celler isolert fra 5C. C7 transgene mus på LLSM-instrumentet som brukes, og derfor kan andre cellesystemer og LLSMer kanskje må optimaliseres annerledes. Denne protokollen viser imidlertid kraften i 4D-avbildning, da den kan brukes til å kvantifisere dynamikken i en overflatereseptor på en hel celle med minst forvrengning i fysiologiske forhold. Derfor er det mange mulige fremtidige anvendelser av denne teknikken.
E...

Den nøyaktige dynamikken i molekyler smugling og diffusering på tredimensjonal celleoverflaten i sanntid har vært en gåte å løse. Mikroskopi har alltid vært en balanse mellom hastighet, følsomhet og oppløsning; hvis en eller to er maksimert, minimeres den tredje. Derfor, på grunn av den lille størrelsen og enorme hastigheten som overflatereseptorer beveger seg, har sporing av dynamikken deres vært en stor teknologisk utfordring for cellebiologiens felt. For eksempel har mange studier blitt utført ved hjelp av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi1,2,3, som har høy temporal oppløsning, men kan bare bilde en veldig tynn skive av T-celle membran (~ 100 nm), og derfor savner hendelser som skjer lenger unna i cellen. Disse TIRF-bildene viser også bare en todimensjonal del av cellen. Derimot kan superoppløsningsteknikker, som stokastisk optisk rekonstruksjonmikroskopi (STORM)4, fotoaktivert lokaliseringmikroskopi (PALM)5og stimulert utslippsuttømmingsmikroskopi (STED)6, overvinne Abbe-diffraksjonsgrensen for lys. Disse teknikkene har høy romlig oppløsning (~ 20 nm oppløsning)4,5,6,7, men de tar ofte mange minutter å skaffe seg en full todimensjonal (2D) eller tredimensjonal (3D) bilde, og derfor temporal oppløsning går tapt. I tillegg kan teknikker som STORM og PALM som er avhengige av blinkende signaler ha unøyaktigheter i tellingen 8,9. Elektronmikroskopi har den klart høyeste oppløsningen (opptil 50 pm oppløsning)10; Det kan til og med gjennomføres tredimensjonalt med fokusert ionstråleskanning elektronmikroskopi (FIB-SEM), noe som resulterer i opptil 3 nm XY og 500 nm Z oppløsning11. Imidlertid krever enhver form for elektronmikroskopi hard prøveforberedelse og kan bare utføres med faste celler eller vev, noe som eliminerer muligheten for å forestille levende prøver over tid.
Teknikker for å oppnå den høye spatiotemporal oppløsning som kreves for å identifisere dynamikken i overflaten og intracellulære molekyler i levende celler i deres sanne fysiologiske 3D natur blir bare nylig utviklet. En av disse teknikkene er Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, som benytter et strukturert lysark til drastisk lavere fotobleking. Utviklet i 2014 av nobelprisvinner Eric Betzig, høy aksial oppløsning, lav fotobleking og bakgrunnsstøy, og evne til samtidig å bilde hundrevis av fly per synsfelt gjør LLS mikroskoper bedre enn widefield, TIRF og confocal mikroskoper12,13,14,15,16,17,18,19. Denne firedimensjonale (x, y, z og tid) bildeteknikk, mens fortsatt diffraksjon begrenset (~ 200 nm XYZ oppløsning), har utrolig temporal oppløsning (vi har oppnådd en bildefrekvens på ca 100 fps, noe som resulterer i en 3D rekonstruert cellebilde med 0,85 sekunder per ramme) for 3D romlig oppkjøp.
LLSM kan vanligvis brukes til å spore sanntidsdynamikk av molekyler i en hvilken som helst celle på enmolekyl- og encellenivå, spesielt de i svært motileceller som immunceller. For eksempel viser vi her hvordan du bruker LLSM til å visualisere T-cellereseptor (TCR) dynamikk. T-celler er effektorcellene i det adaptive immunsystemet. TCRs er ansvarlig for å gjenkjenne peptid-MHC (pMHC) ligander som vises på overflaten av antigenpresenterende celler (APC), som bestemmer valg, utvikling, differensiering, skjebne og funksjon av en T-celle. Denne anerkjennelsen skjer i grensesnittet mellom T-celler og APK-er, noe som resulterer i lokalisert reseptorklynge for å danne det som kalles immunologisk synapse. Mens det er kjent at TCRs ved immunologisk synapse er avgjørende for T-celle effektor funksjon, fortsatt ukjent er de underliggende mekanismene for sanntidTCR trafficking til synapse. LLSM har tillatt oss å visualisere i sanntid dynamikken i TCRs før og etter menneskehandel til synapse med den resulterende pMHC-TCR interaksjon (Figur 1). LLSM kan derfor brukes til å løse aktuelle spørsmål om den formative dynamikken til TCRs og gi innsikt for å forstå hvordan en celle skiller mellom selv og utenlandske antigener.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm round coverslips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>502040</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70um Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7201431</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR &#946; chain Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109215</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>X&#38;Y Cell Culture</td>
			<td>FBS-500</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Denisty gradient reagent for T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lattice Light-Sheet Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope Used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLSpy</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK</td>
			<td>Elimbio</td>
			<td>Custom Synthesis</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penacillin/Streptamycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122_3683884612</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse IL-2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0523</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slidebook</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSM imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Dissection Tools</td>
			<td>Nova-Tech International</td>
			<td>DSET10</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231710126</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44685</td>
			<td>For preparing Fab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy

Signalingen og funksjonen til en celle dikteres av de dynamiske strukturene og interaksjonene til overflatereseptorene. For å virkelig forstå struktur-funksjon forholdet mellom disse reseptorene in situ, må vi visualisere og spore dem på live celleoverflaten med nok spatiotemporal oppløsning. Her viser vi hvordan du bruker nylig utviklet Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) til å bilde T-celle reseptorer (TCRs) firedimensjonalt (4D, rom og tid) på live celle membran. T-celler er en av de viktigste effektorcellene i det adaptive immunsystemet, og her brukte vi T-celler som et eksempel for å vise at signalog funksjon av disse cellene er drevet av dynamikken og interaksjonene til TCRs. LLSM tillater 4D-avbildning med enestående spatiotemporal oppløsning. Denne mikroskopiteknikken kan derfor vanligvis brukes på et bredt spekter av overflate- eller intracellulære molekyler av forskjellige celler i biologi.

Her beskriver vi isolasjon, forberedelse og avbildning av primær mus 5C. C7 T-celler ved hjelp av et gitterlysarkmikroskop. Under avsnitt 3 er det viktig å justere mikroskopet riktig, og å samle PSF daglig for å dekonvolve dataene etter innsamling. I figur 2viser vi de riktige justeringsbildene som vil bli sett når vi justerer mikroskopet. Figur 2A og figur 2B viser henholdsvis riktig stråleba...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Målet med denne protokollen er å vise hvordan du bruker Lattice Light-Sheet Microscopy til firedimensjonalt visualisere overflatereseptordynamikk i levende celler. Her vises T-cellereseptorer på CD4+ primære T-celler.

Visualisere Surface T-cell reseptor Dynamics firedimensjonalt ved hjelp av gitter lysark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Gitterlysmikroskopi er en kraftig bildeteknologi, men få laboratorier i verden er i stand til å bruke den. Denne protokollen gir en detaljert oversikt over hvordan du bruker det kommersielt tilgjengelige gitterlysmikroskopet. Det er et ekstremt kraftig system som er i stand til firedimensjonal avbildning av individuelle celler eller embryoer som muliggjør sanntidssporing av molekyler.Den største fordelen med denne teknikken er at den kan tredimensjonalt bilde enkelt levende celler eller organer med høy romlig oppløsning og minimal fotobleking. Gittermønsteret i lysarket gjør det mulig for oss å høyhastighets bildeprøver og få sanntidsvideoer av tredimensjonale levende celler og organer med molekylære detaljer som andre teknikker ikke kan oppnå. Denne første videoprotokollen som viser hvordan vi får gitterlysmikroskopi til bilde av encelle firedimensjonalt.Dette er en svært komplisert teknikk på grunn av justering og prøveforberedelse. Og vi tror at visuell demonstrasjon vil forbedre tilgjengeligheten ved å la flere forskere bilde mange forskjellige molekyler, celler og organer i biologi. For å starte denne prosedyren, inkuber fem millimeter runde dekkslepper med 0,1% poly-L-lysin ved romtemperatur i 10 minutter.Aspirer av væsken og la dekslepper luft tørke naturlig. Deretter legger du til tre milliliter tetthetsgradient til et konisk rør på 15 milliliter. Legg forsiktig celler drop-wise til kanten av røret.Sentrifuge på 930 ganger g og ved fire grader Celsius i 10 minutter. Etter dette fjerner du forsiktig det tynne midterste laget av celler mellom hele mediet og tetthetsreagensen som sørger for å sette hver celletype inn i et eget konisk rør. Sentrifuge 300 ganger g i fem minutter for å vaske cellene.Kast supernatant og tilsett fem milliliter RPMI til rørene til T-celler og CH27-celler. Gjenta vasken med frisk rPMI til det er utført tre totale vasker. Deretter bruker du cellene i hvert rør på nytt med ett milliliter fullstendig RPMI og teller cellene med et hemocytometer.Gjenoppusser en million antigen-presentere celler i 500 mikroliter med komplett RPMI og legge til 10 mikromos MCC. Inkuber ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i tre timer. Etter dette, gjenbruke en million T-celler i 500 mikroliter med komplett RPMI.Tilsett to mikrogram anti-TCR beta Alexa 488 merket FAB og inkuber ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i 30 minutter. Deretter sentrifuger begge cellene på 300 ganger g i fem minutter og kast supernatanten. Tilsett 500 mikroliter med fullstendig RPMI og gjenta sentrifugen for å vaske cellene.Gjenta vasken med friskt RPMI til det er utført tre totale vasker ved å kaste supernatanten etter hver vask. Etter dette bruker du begge celletypene på nytt i 500 mikroliter av bildemedier. Tilsett først 10 milliliter vann og 30 mikroliter fluorescein til LLSM-badet.Trykk på Image Home for å flytte objektet til bildeposisjon og se på et enkelt Bessel laserstrålemønster. Juster laserstrålen ved hjelp av føreren og det forhåndsinnstilte området av interesse for å gjøre strålen til et tynt mønster som er balansert i alle retninger. Strålen skal også vises fokusert i finder kameraet.Bruk de to speilvippjusteringene, mikrometeret i hovedfokus og den objektive fargen til å justere strålen. Deretter vasker du badet og målene med minst 200 milliliter vann for å fjerne fluorescein helt. Hvis du vil se standard fluorescerende perler, slår du på spredning ved å sette på tre i Xgalvo-områdeboksen og trykker på Live for å vise gjeldende felt.Juster vippespeilet, objektivfargen og fokusmikrometeret manuelt for høyeste grå verdier. Deretter justerer du etter behov for å oppnå riktige mønstre for objektiv skanning, Z galvo, Z pluss mål og prøveskanningsopptaksmoduser. Deretter trykker du på Utfør i eksempelskanningsmodus for å samle inn oppslagsfunksjonen for avd-skjevhet og overføring av dekonering.Endre laserne til tre fargemodus og trykk på Utfør på nytt. For å begynne, legg til 100.000 anti-presenterende celler til den forberedte fem millimeter diameter sirkulære dekkslips og la dem bosette seg i 10 minutter. Smør prøveholderen og legg dekkslippen til den cellesiden opp.Deretter legger du til en dråpe bildemedier på baksiden av dekkslippen. Skru prøveholderen på Piezo og trykk på Image Home. Finn en antigen-presenting celle til bilde og sørg for at LLSM og bildebehandling programvare fungerer som den skal.Trykk på Live for å vise det gjeldende bildet. Flytt langs Z for å finne dekkslippen og cellene. Finn midten av en antigen-presentasjon celle ved å flytte i Z-retning, og trykk deretter Stopp for å pause laseren.Kontroller 3D og skriv inn ønskede innstillinger. Trykk Center, og trykk deretter På Utfør for å samle inn dataene. Senk scenen til lastposisjonen og legg til 50 mikroliter T-celler og bildemedier drop-wise rett over dekkslips.Det er best å la en dråpeform på enden av pipettespissen og deretter berøre spissen til badevæsken. Hev scenen tilbake ved å klikke på Bilderetur. Begynn å bilde.Pass på å stille inn ønsket Z-stabel og timelapselengde. Bilde 60 Z stabler for eksempel med en trinnstørrelse på 0,4 mikrometer og legger inn 500 tidsrammer. Stopp opptaket før 500 bilder nås for å unngå bleking av bilder.Bruk live-modus til å søke etter cellepar, og når klare og ønskede innstillinger er angitt, trykker du på Utfør for å samle inn data. I denne studien isoleres primære mus 5CC7 T-celler og tilberedes og blir deretter avbildet ved hjelp av et gitterlysmikroskop. Vist her er riktig strålebane og strålejustering når den avbildet med fluorescein.Målsøket skal vise en stor X-form i XZ- og YZ-projeksjonene som er så symmetriske som mulig. De bør også justeres for å være så små av en X som mulig. Z galvo-skanningen skal vise en oval i XZ og XY med en enkelt prikk på hver side.Til slutt skal både Z pluss objektiv skanning og prøveskanningen vise prikker som ser så runde ut som mulig. Ved hjelp av denne protokollen kan den firedimensjonale dynamikken til T-cellereseptorene på en T-celleoverflate ses. Den største fordelen med dette mikroskopet ligger i evnen til å spore de visualiserte overflateenhetene til T-cellereseptorene og å få kvantifiserte data fra deres størrelse, bevegelse, signalintensitet og ekskreta.Det viktigste å huske er kvaliteten på justeringen. Gitterlysarket må justeres daglig, og ikke gjøre dette riktig vil resultere i forvrengt bildebehandling. På samme måte påvirker kvaliteten på PSF samlet inn direkte kvaliteten på de-convolution som til slutt resulterer i kvaliteten på ditt endelige bilde.En av grunnene til at denne metoden er så kraftig er fordi hver celle og etikett kan erstattes for å visualisere mange celletyper og molekyler. Derfor kan denne metoden brukes til å svare på spørsmål knyttet til firedimensjonal sporing av molekyler. Vi tror at denne teknikken vil bane vei for forskere å utforske nye spørsmål innen molekylær handel.Det er ennå ikke mye brukt på grunn av det kompliserte systemet, så vi håper denne Jove-videoen vil forbedre tilgjengeligheten til teknikken. Laserne som brukes på systemet er klasse fire så absolutt forsiktighet må tas for å sikre lasersikkerhet. Ta nødvendig lasersikkerhetsopplæring før du bruker denne metoden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi for høy gjennomstrømning påvisning av lav affinitet reseptor-Ligand interaksjoner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Verifiserer strukturen og dynamikken i Nucleosomes med Atomic Force mikroskopi Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantifisering av protein samspill nettverk dynamikk ved hjelp av multiplekset co-Immunutfelling

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produksjon av Dynein og Kinesin motor ensembler på DNA Origami nanostrukturer for single molekyl observasjon

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening for fytoøstrogener ved hjelp av en cellebasert østrogenreseptor β Reporter Analyse

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Overvåking av protein-RNA-interaksjonsdynamikk in vivo ved høy temporal oppløsning ved bruk av χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisere diffus dynamikk av gull nanorods på cellemembran ved hjelp av enkelt nanopartikkel Darkfield mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Kvantifisering av subcellulær glykogenfordeling i skjelettmuskulaturfibre ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Samtidig visualisering av dynamikken i krysskoblede og enkle mikrotubuler in vitro av TIRF mikroskopi

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Bruke mikrofluidikk og fluorescensmikroskopi til å studere monteringsdynamikken til enkelt actinfilamenter og bunter

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...