Name: visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Gostaríamos de reconhecer o conselho e a orientação do Dr. Vytas Bindokas na Universidade de Chicago. Agradecemos ao Centro Integrado de Microscopia Leve da Universidade de Chicago por apoiar e manter o microscópio de folha de luz de rede. Este trabalho foi apoiado pelo NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 e pelo NSF Career Award 1653782 (To J.H.). J.R. é apoiado pelo Programa de Bolsas de Pesquisa de Pós-Graduação da NSF.

5C. C7 TCR-transgênico RAG2 ratos knockout em B10. Um pano de fundo foi utilizado neste estudo de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Chicago.
1. Colher e Ativar células T
NOTA: Esta parte do protocolo é baseada em protocolos anteriores. Veja citações para mais detalhes20,21.
<ol><li>Eutanize um 5C de 10 a 12 semanas. C7 mouse tra...

<ol>
	<li>Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physical+Basis+of+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+(TIRF)+Microscopy+and+Its+Cellular+Applications.">The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).</li><li>Shroff, H., White, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+Localization+Microscopy+(PALM)+of+Adhesion+Complexes.">Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes.</a> Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).</li><li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level.">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li><li>Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+speed+and+resolution+of+light+microscopy.">Advances in the speed and resolution of light microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).</li><li>. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: <a target="_blank" href="https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr">https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr</a> (2019)</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. , (2014).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+natural+killer+cells+maintain+long-term+antitumor+activity+by+epigenetic+imprinting+and+CD4++T+cell+help.">Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help.</a> Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).</li><li>Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Binds+to+B7-1+Only+In+Cis+on+the+Same+Cell+Surface.">PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).</li><li>Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly49C-dependent+control+of+MCMV+Infection+by+NK+cells+is+cis-regulated+by+MHC+Class+I+molecules.">Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules.</a> PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).</li><li>Sch&#246;neberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+cell+biology:+big+data+image+analytics+and+lattice+light-sheet+imaging+reveal+dynamics+of+clathrin-mediated+endocytosis+in+stem+cell-derived+intestinal+organoids.">4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids.</a> Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), 8302 (2019).</li><li>Cai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dynamic+microvillar+search+and+stabilization+during+ligand+detection+by+T+cells.">Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells.</a> Science. 356 (6338), 3118 (2017).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+Depletion+Initiates+Events+Leading+to+Granule+Secretion+at+the+Immunological+Synapse.">Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse.</a> Immunity. , (2015).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes.">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Peptide-Major+Histocompatibility+Complex+Ligand+Triggers+Digital+Cytokine+Secretion+in+CD4++T+Cells.">A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells.</a> Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).</li><li>Jansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+framework+for+analyzing+T+cell+receptor+scanning+of+peptides.">A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides.</a> Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).</li><li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart.">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li></ol>

O protocolo apresentado foi otimizado para o uso de células CD4+ T isoladas de 5C. Camundongos transgênicos C7 no instrumento LLSM usados e, portanto, outros sistemas celulares e LLSMs podem precisar ser otimizados de forma diferente. No entanto, este protocolo mostra o poder da imagem 4D, pois pode ser usado para quantificar a dinâmica de um receptor de superfície em uma célula inteira com a menor distorção em condições fisiológicas. Portanto, existem muitas aplicações futuras possíveis desta té...

A dinâmica precisa do tráfico de moléculas e difusão na superfície celular tridimensional em tempo real têm sido um enigma para resolver. A microscopia sempre foi um equilíbrio de velocidade, sensibilidade e resolução; se qualquer um ou dois forem maximizados, o terceiro é minimizado. Portanto, devido ao pequeno tamanho e imensa velocidade com que os receptores de superfície se movem, o rastreamento de sua dinâmica tem permanecido um grande desafio tecnológico para o campo da biologia celular. Por exemplo, muitos estudos têm sido realizados utilizando a microscopia total de fluorescência interna (TIRF)1,2,3, que tem alta resolução temporal, mas só pode imaginar uma fatia muito fina da membrana t-cell (~100 nm), e, portanto, perde eventos acontecendo mais longe na célula. Essas imagens tirf também mostram apenas uma seção bidimensional da célula. Em contrapartida, técnicas de superresolução, como microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM)4,microscopia de localização fotoativada (PALM)5e microscopia de esgotamento de emissões estimuladas (STED)6, podem superar o limite de difração de luz abbe. Essas técnicas têm alta resolução espacial (~20 nm resolução)4,5,6,7,mas muitas vezes levam muitos minutos para adquirir uma imagem bidimensional completa (2D) ou tridimensional (3D) e, portanto, a resolução temporal é perdida. Além disso, técnicas como STORM e PALM que dependem de sinais piscando podem ter imprecisões na contagemde 8,9. A microscopia eletrônica tem de longe a mais alta resolução (até 50 pm resolução)10; ele pode até ser conduzido tridimensionalmente com microscopia eletrônica de varredura de feixe de íon focada (FIB-SEM), resultando em até 3 nm XY e resolução de 500 nm Z11. No entanto, qualquer forma de microscopia eletrônica requer preparação de amostra gemida severa e só pode ser conduzida com células ou tecidos fixos, eliminando a possibilidade de imagens de amostras vivas ao longo do tempo.
Técnicas para obter a alta resolução spatiotemporal necessária para identificar a dinâmica das moléculas superficiais e intracelulares em células vivas em sua verdadeira natureza 3D fisiológica só estão sendo desenvolvidas recentemente. Uma dessas técnicas é a Microscopia de Folha de Luz de Retta (LLSM)12,que utiliza uma folha de luz estruturada para diminuir drasticamente o fotobranqueamento. Desenvolvido em 2014 pelo ganhador do Nobel Eric Betzig, a alta resolução axial, o baixo fotobranqueamento e o ruído de fundo, e a capacidade de imagem simultânea de centenas de aviões por campo de visão tornam microscópios LLS superiores aos microscópios widefield, TIRF e confocals12,13,14,15,16,17,18,19. Esta técnica de imagem de quatro dimensões (x, y, z e tempo), embora ainda limitada (resolução XYZ de ~200 nm), tem uma incrível resolução temporal (alcançamos uma taxa de quadros de cerca de 100 fps, resultando em uma imagem celular reconstruída em 3D com 0,85 segundos por quadro) para aquisição espacial 3D.
LlSM pode ser geralmente usado para rastrear dinâmicas em tempo real de quaisquer moléculas dentro de qualquer célula no nível de única molécula e unicelular, particularmente aquelas em células altamente mois, como células imunes. Por exemplo, mostramos aqui como usar llsm para visualizar a dinâmica do receptor de células T (TCR). As células T são as células effector do sistema imunológico adaptativo. Os TCRs são responsáveis pelo reconhecimento de ligantes peptídeos-MHC (pMHC) exibidos na superfície das células presentes a antígenos (APC), que determina a seleção, desenvolvimento, diferenciação, destino e função de uma célula T. Esse reconhecimento ocorre na interface entre células T e APCs, resultando em agrupamento de receptores localizados para formar o que é chamado de sinapse imunológica. Embora se saiba que os TCRs na sinapse imunológica são imperativos para a função de efeito t-células, ainda desconhecidos são os mecanismos subjacentes do tráfico de TCR em tempo real para a sinapse. A LLSM nos permitiu visualizar em tempo real a dinâmica dos TCRs antes e depois do tráfico para a sinapse com a interação pMHC-TCR resultante (Figura 1). O LLSM pode, portanto, ser usado para resolver questões atuais da dinâmica formativa dos TCRs e fornecer insights para entender como uma célula distingue entre antígenos eu e estrangeiros.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm round coverslips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>502040</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70um Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7201431</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR &#946; chain Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109215</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>X&#38;Y Cell Culture</td>
			<td>FBS-500</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Denisty gradient reagent for T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lattice Light-Sheet Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope Used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLSpy</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK</td>
			<td>Elimbio</td>
			<td>Custom Synthesis</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penacillin/Streptamycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122_3683884612</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse IL-2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0523</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slidebook</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSM imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Dissection Tools</td>
			<td>Nova-Tech International</td>
			<td>DSET10</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231710126</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44685</td>
			<td>For preparing Fab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy

A sinalização e a função de uma célula são ditadas pelas estruturas dinâmicas e interações de seus receptores de superfície. Para realmente entender a relação estrutura-função desses receptores in situ, precisamos visualizá-los e rastreá-los na superfície das células vivas com resolução suficiente spatiotemporal. Aqui mostramos como usar microscopia de folha de luz de rede recém-desenvolvida (LLSM) para imagem de receptores de células T (TCRs) quatro dimensionalmente (4D, espaço e tempo) na membrana celular ao vivo. As células T são uma das principais células effectoras do sistema imunológico adaptativo, e aqui usamos as células T como exemplo para mostrar que a sinalização e a função dessas células são impulsionadas pela dinâmica e interações dos TCRs. O LLSM permite imagens 4D com resolução sem precedentes. Esta técnica de microscopia, portanto, pode ser geralmente aplicada a uma ampla gama de moléculas superficiais ou intracelulares de diferentes células na biologia.

Aqui, descrevemos o isolamento, preparação e imagem do mouse primário 5C. Células C7 T usando um microscópio de folha de luz de rede. Durante a seção 3, é imprescindível alinhar o microscópio corretamente, e coletar PSF diariamente com o qual desconvolve os dados após a coleta. Na Figura 2,mostramos as imagens de alinhamento corretas que serão vistas ao alinhar o microscópio. A Figura 2A e a Figura 2<st...

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Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

O objetivo deste protocolo é mostrar como usar microscopia de folha de luz de rede para visualizar quatro dimensões a dinâmica do receptor de superfície em células vivas. Aqui são mostrados receptores de células T em células CD4+ T primárias.

Visualizando dinâmica sadrindo de receptor estéta de células t usando microscopia de folha de luz de rede

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

A microscopia de folhas de luz reticundo é uma poderosa tecnologia de imagem, mas poucos laboratórios no mundo são capazes de usá-la. Este protocolo fornece uma visão geral detalhada de como usar o microscópio de folha de luz disponível comercialmente. É um sistema extremamente poderoso capaz de imagens quadridimensionais de células individuais ou embriões que permite o rastreamento em tempo real de moléculas.A principal vantagem desta técnica é que ela pode imagem tridimensional de células ou órgãos vivos únicos com alta resolução espesso e branqueamento mínimo de fotos. O padrão de rede da folha de luz nos permite amostras de imagens de alta velocidade e obter vídeos em tempo real de células vivas tridimensionais e órgãos com detalhes moleculares que outras técnicas não podem alcançar. Este primeiro protocolo de vídeo mostrando como para nós reticufato microscopia folha de luz para imagem única célula quatrodimensionalmente.Esta é uma técnica muito complicada devido ao alinhamento e preparação da amostra. E acreditamos que a demonstração visual melhorará a acessibilidade, permitindo que mais cientistas visualizem muitas moléculas, células e órgãos diferentes na biologia. Para iniciar este procedimento, incubar tampas redondas de cinco milímetros com 0,1% de poli-L-lisina em temperatura ambiente por 10 minutos.Aspire o líquido e deixe as tampas secarem naturalmente. Em seguida, adicione três mililitros de gradiente de densidade a um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione cuidadosamente as células à borda do tubo.Centrifugar a 930 vezes g e a 4 graus Celsius por 10 minutos. Depois disso, remova cuidadosamente a fina camada média das células entre a mídia completa e o reagente gradiente de densidade certificando-se de colocar cada tipo de célula em um tubo cônico separado. Centrifugar a 300 vezes g por cinco minutos para lavar as células.Descarte o supernatante e adicione cinco mililitros de RPMI aos tubos de células T e células CH27. Repita a lavagem com RPMI fresco até que três lavagens totais tenham sido realizadas. Em seguida, resuspende as células em cada tubo com um mililitro de RPMI completo e conte as células com um hemótmetro.Resuspend um milhão de células que apresentam antígeno em 500 microliters de RPMI completo e adicionar 10 MCC micromolar. Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três horas. Depois disso, resuspense um milhão de células T em 500 microliters de RPMI completo.Adicione dois microgramas de beta anti-TCR Alexa 488 rotulado FAB e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Em seguida, centrifugar ambas as células a 300 vezes g por cinco minutos e descartar o supernante. Adicione 500 microliters de RPMI completo e repita a centrífuga para lavar as células.Repita a lavagem com RPMI fresco até que três lavagens totais tenham sido realizadas descartando o supernatante após cada lavagem. Depois disso, resuspende ambos os tipos de células em 500 microliters de mídia de imagem. Primeiro, adicione 10 mililitros de água e 30 microliters de fluoresceína ao banho LLSM.Pressione o Image Home para mover o objeto para a posição da imagem e olhar para um único padrão de raio laser Bessel. Alinhe o raio laser usando a região de interesse do guia e predefinido para tornar o feixe um padrão fino que é equilibrado em todas as direções. O feixe também deve aparecer focado na câmera do localizador.Use os dois ajustadores de inclinação do espelho, o micrometro de foco superior e a cor objetiva para ajustar o feixe. Em seguida, lave o banho e os objetivos com pelo menos 200 mililitros de água para remover completamente qualquer fluoresceína. Para as contas fluorescentes padrão de imagem, ligue o dither configurando-se para três na caixa de alcance Xgalvo e pressione Ao Vivo para ver o campo atual.Ajuste manualmente o espelho de inclinação, a cor objetiva e o micrometro de foco para os valores cinzentos mais altos. Em seguida, ajuste conforme necessário para obter padrões adequados para a varredura objetiva, Z galvo, Z mais modos objetivos e de captura de varredura de amostras. Depois disso, pressione Executar no modo de varredura de amostras para coletar a função de spread de ponto de amostra para desvasar e descompustion.Mude os lasers para três modos de cor e pressione Execute novamente. Para começar, adicione 100.000 células anti-presentes ao deslizamento circular de cinco milímetros de diâmetro preparado e permita que elas se acomodem por 10 minutos. Unte o suporte da amostra e adicione a mancha de tampa ao lado da célula para cima.Em seguida, adicione uma gota de mídia de imagem na parte de trás do deslizamento de cobertura. Enrosque o suporte da amostra no Piezo e pressione Image Home. Encontre uma célula de apresentação de antígeno à imagem e certifique-se de que o LLSM e o software de imagem estejam funcionando corretamente.Pressione ao vivo para ver a imagem atual. Mova-se ao longo de Z para encontrar o deslizamento de tampas e células. Encontre o centro de uma célula que apresenta antígeno movendo-se na direção Z e pressione Pare para pausar o laser.Verifique 3D e insira as configurações desejadas. Pressione o Centro de Pressão e pressione Executar para coletar os dados. Abaixe o estágio para a posição de carga e adicione 50 microliters de células T e mídia de imagem drop-wise diretamente sobre o deslizamento de fenda.É melhor deixar uma forma de gota na ponta da ponta da pipeta e, em seguida, tocar a ponta para o líquido do banho. Levante o palco para trás clicando em "Retorno de Imagem". Comece a imagem.Certifique-se de definir a pilha Z desejada e o comprimento do timelapse. Por exemplo, a imagem de 60 Z empilhia a um tamanho de passo de 0,4 micrômetro e entrada de 500 prazos. Pare de gravar antes que 500 quadros sejam alcançados para evitar branqueamento de fotos.Use o modo ao vivo para procurar pares de células e, quando as configurações prontas e desejadas tiverem sido inseridas, pressione Executar para coletar dados. Neste estudo, as células T do mouse primário 5CC7 são isoladas e preparadas e são então imagens usando um microscópio de folha de luz de rede. Aqui estão mostrados o caminho correto do feixe e o alinhamento do feixe quando imagens com fluoresceína.A varredura objetiva deve mostrar uma grande forma X nas projeções XZ e YZ que é o mais simétrico possível. Eles também devem ser ajustados para ser o menor de um X possível. O z galvo scan deve mostrar um oval em XZ e XY com um único ponto em ambos os lados.Finalmente, tanto o Z mais o escaneamento objetivo e a amostra devem mostrar pontos que parecem o mais redondos possível. Usando este protocolo, a dinâmica quadridimensional dos receptores de células T em uma superfície de células T podia ser vista. A principal vantagem deste microscópio está na capacidade de rastrear as unidades de superfície visualizadas dos receptores de células T e obter dados quantificados de seu tamanho, movimento, intensidade de sinal e excreta.A coisa mais importante a se lembrar é a qualidade do seu alinhamento. A folha de luz da rede deve ser alinhada diariamente e não fazê-lo corretamente resultará em imagens distorcidas. Da mesma forma, a qualidade do PSF coletado impacta diretamente na qualidade da descognição que, em última análise, resulta na qualidade de sua imagem final.Uma das razões pelas quais esse método é tão poderoso é porque cada célula e rótulo pode ser substituído para visualizar muitos tipos e moléculas celulares. Portanto, este método pode ser usado para responder a qualquer pergunta relacionada ao rastreamento quadridimensional de moléculas. Acreditamos que essa técnica abrirá caminho para os pesquisadores explorarem novas questões no campo do tráfico molecular.Ele ainda não está sendo amplamente utilizado devido ao sistema complicado, então esperamos que este vídeo Jove melhore a acessibilidade à técnica. Os lasers usados no sistema são classe quatro, por isso deve-se ter absoluta cautela para garantir a segurança do laser. Por favor, faça o treinamento necessário de segurança a laser antes de usar este método.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Bioquímica

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondando a estrutura e a dinâmica de Nucleosomes usando imagem de microscopia de força atômica

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantificação da dinâmica da rede de interação de proteínas usando co-imunoprecipitação multiplexada

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produção de conjuntos de motor de dynein e de Kinesin em nanostructures do ADN origami para a única observação da molécula

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Triagem para Fitoestrogênios usando um receptor de estrogênio baseado em células β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Monitorando a Dinâmica da Interação Proteína-RNA In Vivo em Alta Resolução Temporal Usando χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualizando dinâmica difusional de nanorods de ouro na membrana celular usando microscopia de campo escuro de nanopartícula única

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Quantificação da Distribuição de Glicogênio Subcelular em Fibras Musculares Esqueléticas usando Microscopia eletrônica de transmissão

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Visualização Simultânea da Dinâmica dos Microtúbulos Cruzados e Únicos In Vitro pela Microscopia TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Usando Microfluidos e Microscopia de Fluorescência para Estudar a Dinâmica de Montagem de Filamentos e Pacotes de Actin Único

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...