Name: visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00
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Nos gustaría reconocer el consejo y la orientación del Dr. Vytas Bindokas de la Universidad de Chicago. Agradecemos a la Instalación Central integrada de microscopía de luz de la Universidad de Chicago por apoyar y mantener el microscopio de lámina de luz de celosía. Este trabajo fue apoyado por NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 y NSF Career Award 1653782 (A J.H.). J.R. cuenta con el apoyo del Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la NSF.

5C. C7 Ratones noqueadores RAG2 transgénicos en B10. Un fondo se utilizó en este estudio de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Chicago.
1. Cosecha y Activa células T
NOTA: Esta parte del protocolo se basa en protocolos anteriores. Véanse las citas para másdetalles 20,21.
<ol><li>Eutanasia a 10-12 semanas de 5C. Ratón transg...

<ol>
	<li>Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physical+Basis+of+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+(TIRF)+Microscopy+and+Its+Cellular+Applications.">The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).</li><li>Shroff, H., White, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+Localization+Microscopy+(PALM)+of+Adhesion+Complexes.">Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes.</a> Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).</li><li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level.">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li><li>Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+speed+and+resolution+of+light+microscopy.">Advances in the speed and resolution of light microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).</li><li>. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: <a target="_blank" href="https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr">https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr</a> (2019)</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. , (2014).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+natural+killer+cells+maintain+long-term+antitumor+activity+by+epigenetic+imprinting+and+CD4++T+cell+help.">Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help.</a> Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).</li><li>Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Binds+to+B7-1+Only+In+Cis+on+the+Same+Cell+Surface.">PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).</li><li>Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly49C-dependent+control+of+MCMV+Infection+by+NK+cells+is+cis-regulated+by+MHC+Class+I+molecules.">Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules.</a> PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).</li><li>Sch&#246;neberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+cell+biology:+big+data+image+analytics+and+lattice+light-sheet+imaging+reveal+dynamics+of+clathrin-mediated+endocytosis+in+stem+cell-derived+intestinal+organoids.">4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids.</a> Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), 8302 (2019).</li><li>Cai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dynamic+microvillar+search+and+stabilization+during+ligand+detection+by+T+cells.">Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells.</a> Science. 356 (6338), 3118 (2017).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+Depletion+Initiates+Events+Leading+to+Granule+Secretion+at+the+Immunological+Synapse.">Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse.</a> Immunity. , (2015).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes.">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Peptide-Major+Histocompatibility+Complex+Ligand+Triggers+Digital+Cytokine+Secretion+in+CD4++T+Cells.">A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells.</a> Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).</li><li>Jansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+framework+for+analyzing+T+cell+receptor+scanning+of+peptides.">A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides.</a> Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).</li><li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart.">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li></ol>

El protocolo presentado fue optimizado para el uso de células CD4+ T aisladas de 5C. Los ratones transgénicos C7 en el instrumento LLSM utilizado, y por lo tanto otros sistemas celulares y LLSM pueden necesitar ser optimizados de manera diferente. Sin embargo, este protocolo muestra la potencia de las imágenes 4D, ya que se puede utilizar para cuantificar la dinámica de un receptor de superficie en una célula entera con la menor distorsión en condiciones fisiológicas. Por lo tanto, hay muchas posibles a...

La dinámica precisa del tráfico y difusión de moléculas en la superficie celular tridimensional en tiempo real ha sido un enigma a resolver. La microscopía siempre ha sido un equilibrio entre velocidad, sensibilidad y resolución; si uno o dos se maximizan, el tercero se minimiza. Por lo tanto, debido al pequeño tamaño y la inmensa velocidad con la que se mueven los receptores de superficie, el seguimiento de su dinámica ha seguido siendo un gran desafío tecnológico para el campo de la biología celular. Por ejemplo, muchos estudios se han realizado utilizando la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)1,2,3, que tiene alta resolución temporal, pero sólo puede imaginar una rebanada muy delgada de la membrana de la célula T (100 nm), y por lo tanto echa de menos eventos que ocurren más lejos en la célula. Estas imágenes TIRF también muestran solo una sección bidimensional de la celda. Por el contrario, las técnicas de superresolución, como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM)4, la microscopía de localización fotoactivada (PALM)5y la microscopía de agotamiento de emisiones estimulada (STED)6,pueden superar el límite de difracción de la luz de Abbe. Estas técnicas tienen una alta resolución espacial (resolución de 20 nm)4,5,6,7, pero a menudo tardan muchos minutos en adquirir una imagen bidimensional completa (2D) o tridimensional (3D), y por lo tanto se pierde la resolución temporal. Además, técnicas como STORM y PALM que dependen de señales parpadeantes pueden tener imprecisiones en el conteo8,9. La microscopía electrónica tiene con mucho la resolución más alta (resolución de hasta 50 pm)10; incluso se puede llevar a cabo tridimensionalmente con microscopía electrónica de barrido de haz iónico focalizado (FIB-SEM), lo que resulta en hasta 3 nm XY y 500 nm Z resolución11. Sin embargo, cualquier forma de microscopía electrónica requiere una preparación dura de la muestra y sólo se puede llevar a cabo con células o tejidos fijos, eliminando la posibilidad de tomar imágenes de muestras en vivo a lo largo del tiempo.
Técnicas para obtener la alta resolución espaciotemporal necesaria para identificar la dinámica de las moléculas superficiales e intracelulares en células vivas en su verdadera naturaleza fisiológica 3D sólo se está desarrollando recientemente. Una de estas técnicas es Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, que utiliza una hoja de luz estructurada para reducir drásticamente el fotoblanqueo. Desarrollado en 2014 por el Premio Nobel Eric Betzig, la alta resolución axial, bajo fotoblanqueo y ruido de fondo, y la capacidad de crear simultáneamente imágenes de cientos de planos por campo de visión hacen que los microscopios LLS sean superiores a los microscopios de campo ancho, TIRF yconfocal12,13,14,15,16,17,18,19. Esta técnica de imagen de cuatro dimensiones (x, y, z y tiempo), aunque todavía difracción limitada (resolución XYZ de 200 nm), tiene una resolución temporal increíble (hemos logrado una velocidad de fotogramas de unos 100 fps, lo que resulta en una imagen de celda reconstruida en 3D con 0,85 segundos por fotograma) para la adquisición espacial 3D.
LLSM se puede utilizar generalmente para rastrear la dinámica en tiempo real de cualquier molécula dentro de cualquier célula a nivel de una sola molécula y una sola célula, particularmente aquellas en células altamente móviles como las células inmunes. Por ejemplo, mostramos aquí cómo utilizar LLSM para visualizar la dinámica del receptor de células T (TCR). Las células T son las células efector del sistema inmunitario adaptativo. Las TPR son responsables de reconocer los ligandos peptídicos-MHC (pMHC) que se muestran en la superficie de las células que presentan antígenos (APC), que determina la selección, desarrollo, diferenciación, destino y función de una célula T. Este reconocimiento se produce en la interfaz entre las células T y los AAP, lo que resulta en clustering de receptores localizados para formar lo que se llama la sinapsis inmunológica. Si bien se sabe que los TCR en la sinapsis inmunológica son imperativos para la función del efector de células T, todavía desconocidos son los mecanismos subyacentes del tráfico de TCR en tiempo real a la sinapsis. LLSM nos ha permitido visualizar en tiempo real la dinámica de los TCR antes y después del tráfico a la sinapsis con la interacción resultante pMHC-TCR(Figura 1). Por lo tanto, llSM se puede utilizar para resolver cuestiones actuales de la dinámica formativa de los TPR y proporcionar información para entender cómo una célula distingue entre antígenos uno mismo y otros.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm round coverslips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>502040</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70um Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7201431</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR &#946; chain Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109215</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>X&#38;Y Cell Culture</td>
			<td>FBS-500</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Denisty gradient reagent for T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lattice Light-Sheet Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope Used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLSpy</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK</td>
			<td>Elimbio</td>
			<td>Custom Synthesis</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penacillin/Streptamycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122_3683884612</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse IL-2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0523</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slidebook</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSM imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Dissection Tools</td>
			<td>Nova-Tech International</td>
			<td>DSET10</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231710126</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44685</td>
			<td>For preparing Fab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy

La señalización y la función de una célula están dictadas por las estructuras dinámicas y las interacciones de sus receptores de superficie. Para entender realmente la relación estructura-función de estos receptores in situ, necesitamos visualizarlos y rastrearlos en la superficie celular viva con suficiente resolución espaciotemporal. Aquí mostramos cómo utilizar la microscopía de hoja de luz de celosía (LLSM) recientemente desarrollada para crear imágenes de receptores de células T (TPR) en cuatro dimensiones (4D, espacio y tiempo) en la membrana celular viva. Las células T son una de las principales células efector del sistema inmune adaptativo, y aquí usamos las células T como ejemplo para mostrar que la señalización y la función de estas células son impulsadas por la dinámica y las interacciones de losTPR. LLSM permite imágenes 4D con una resolución espaciotemporal sin precedentes. Por lo tanto, esta técnica de microscopía se puede aplicar generalmente a una amplia gama de moléculas superficiales o intracelulares de diferentes células en biología.

Aquí, describimos el aislamiento, la preparación y la creación de imágenes del ratón primario 5C. Células T C7 utilizando un microscopio de lámina de luz de celosía. Durante la sección 3, es imprescindible alinear el microscopio correctamente y recopilar PSF diariamente con el que desconvolver los datos después de la recolección. En la Figura 2,mostramos las imágenes de alineación correctas que se verán al alinear el microscopio. La Figura 2<strong...

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Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

El objetivo de este protocolo es mostrar cómo utilizar la microscopía de hoja de luz de celosía para visualizar la dinámica de receptores de superficie en células vivas. Aquí se muestran los receptores de células T en CD4+ células T primarias.

Visualización de la dinámica del receptor de células T de superficie de cuatro dimensiones mediante la microscopía de hoja de luz de celosía

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

La microscopía de láminas de luz de celosía es una poderosa tecnología de imagen, pero pocos laboratorios en el mundo son capaces de usarla. Este protocolo ofrece una descripción detallada de cómo utilizar el microscopio de lámina de luz de celosía disponible comercialmente. Es un sistema extremadamente potente capaz de imágenes tridimensionales de células individuales o embriones que permite el seguimiento en tiempo real de moléculas.La principal ventaja de esta técnica es que puede imaginar tridimensionalmente células u órganos vivos individuales con alta resolución espaciotemporal y blanqueo fotográfico mínimo. El patrón de celosía de la lámina de luz nos permite tomar muestras de imágenes de alta velocidad y obtener vídeos en tiempo real de células y órganos vivos tridimensionales con detalles moleculares que otras técnicas no pueden lograr. Este primer protocolo de video que muestra cómo nos la microscopía de lámina de luz de celosía para crear imágenes de una sola celda de cuatro dimensiones.Esta es una técnica muy complicada debido a la alineación y la preparación de la muestra. Y creemos que la demostración visual mejorará la accesibilidad al permitir que más científicos imaginen muchas moléculas, células y órganos diferentes en biología. Para comenzar este procedimiento, incubar cubreobjetos redondos de cinco milímetros con 0,1%poli-L-lisina a temperatura ambiente durante 10 minutos.Aspirar el líquido y dejar que los cubreobjetos se sequen al aire de forma natural. A continuación, agregue tres mililitros de gradiente de densidad a un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue con cuidado las células en el borde del tubo.Centrifugar a 930 veces g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Después de esto, retire cuidadosamente la fina capa media de las células entre el medio completo y el reactivo de gradiente de densidad asegurándose de poner cada tipo de celda en un tubo cónico separado. Centrifugar a 300 g durante cinco minutos para lavar las células.Deseche el sobrenadante y agregue cinco mililitros de RPMI a los tubos de las células T y las células CH27. Repita el lavado con RPMI fresca hasta que se hayan realizado tres lavados totales. Luego, resuspender las células en cada tubo con un mililitro de RPMI completa y contar las células con un hemocitociómetro.Resuspender un millón de células que presentan antígenos en 500 microlitros de RPMI completa y añadir 10 MCC micromolares. Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante tres horas. Después de esto, resuspender un millón de células T en 500 microlitros de RPMI completa.Añadir dos microgramos de anti-TCR beta Alexa 488 etiquetado FAB e incubar a 37 grados Celsius con 5% dióxido de carbono durante 30 minutos. A continuación, centrifugar ambas células a 300 veces g durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Añadir 500 microlitros de RPMI completa y repetir la centrífuga para lavar las células.Repita el lavado con RPMI fresca hasta que se hayan realizado tres lavados totales desechando el sobrenadante después de cada lavado. Después de esto, resuspendir ambos tipos de células en 500 microlitros de medios de imagen. En primer lugar, añadir 10 mililitros de agua y 30 microlitros de fluoresceína al baño LLSM.Pulse Inicio de imagen para mover el objeto a la posición de la imagen y ver un único patrón de rayo láser Bessel. Alinee el rayo láser utilizando la guía y la región preestablecida de interés para hacer de la viga un patrón delgado que esté equilibrado en todas las direcciones. El haz también debe aparecer enfocado en la cámara del buscador.Utilice los dos ajustadores de inclinación del espejo, el micrómetro de enfoque superior y el color objetivo para ajustar la viga. A continuación, lave el baño y los objetivos con al menos 200 mililitros de agua para eliminar por completo cualquier fluoresceína. Para crear una imagen de los cordones fluorescentes estándar, active el tramado estableciendo tres en el cuadro de rango Xgalvo y pulse En vivo para ver el campo actual.Ajuste manualmente el espejo de inclinación, el color objetivo y el micrómetro de enfoque para obtener los valores de gris más altos. A continuación, ajuste según sea necesario para obtener patrones adecuados para los modos de exploración objetiva, Z galvo, Z plus y captura de escaneo de muestra. Después de esto, presione Ejecutar en el modo de escaneo de muestra para recopilar la función de propagación de punto de muestra para desssenganchar y desenvolucionar.Cambie los láseres al modo de tres colores y pulse Ejecutar de nuevo. Para empezar, agregue 100.000 celdas anti-presentación al cubreobjetos circulares de cinco milímetros de diámetro preparado y démúlese durante 10 minutos. Engrase el soporte de la muestra y agregue el cubreobjetos al lado de la celda hacia arriba.A continuación, agregue una gota de medios de imágenes a la parte posterior del cubreobjetos. Atornille el soporte de muestra en el Piezo y presione Image Home. Encuentre una celda que presente antígeno a la imagen y asegúrese de que el LLSM y el software de imágenes funcionen correctamente.Pulse Live para ver la imagen actual. Muévete a lo largo de Z para encontrar el cubreobjetos y las células. Encuentra el centro de una celda que presenta antígenos moviéndote en la dirección Z, luego presiona Parar para pausar el láser.Compruebe 3D e introduzca los ajustes deseados. Presione Center y, a continuación, presione Ejecutar para recopilar los datos. Baje el escenario a la posición de carga y agregue 50 microlitros de células T y medios de imagen directamente sobre el cubreobjetos.Lo mejor es dejar que se forme una gota en el extremo de la punta de la pipeta y luego tocar la punta al líquido de baño. Vuelva a elevar la etapa haciendo clic en Retorno de imagen. Comiencen a tomar imágenes.Asegúrese de establecer la pila Z deseada y la longitud del timelapse. Por ejemplo, la imagen 60 Z se apila con un tamaño de paso de 0,4 micrómetros y introduce 500 marcos de tiempo. Detenga la grabación antes de que se alcancen 500 fotogramas para evitar el blanqueo de fotos.Utilice el modo en vivo para buscar pares de celdas y, cuando se hayan introducido los ajustes listos y deseados, pulse Ejecutar para recopilar datos. En este estudio, las células T primarias del ratón 5CC7 se aíslan y se preparan y luego se visualizan con un microscopio de lámina de luz de celosía. Aquí se muestran la trayectoria de viga correcta y la alineación de la viga cuando se imagen con fluoresceína.El escaneo objetivo debe mostrar una forma X grande en las proyecciones XZ e YZ que sea lo más simétrica posible. También deben ajustarse para que sean lo más pequeños posible de una X. La exploración Z galvo debe mostrar un óvalo en XZ y XY con un solo punto a cada lado.Por último, tanto el escaneo objetivo Z plus como el escaneo de muestra deben mostrar puntos que se vean lo más redondos posible. Usando este protocolo, se pudo ver la dinámica cuadular de los receptores de células T en una superficie de células T. La principal ventaja de este microscopio radica en la capacidad de rastrear las unidades de superficie visualizadas de los receptores de células T y obtener datos cuantificados de su tamaño, movimiento, intensidad de señal y excretas.Lo más importante a recordar es la calidad de su alineación. La lámina de luz de celosía debe estar alineada diariamente y no hacerlo correctamente resultará en imágenes distorsionadas. Del mismo modo, la calidad del PSF recogido afecta directamente a la calidad de la desenvolución, lo que en última instancia resulta en la calidad de su imagen final.Una de las razones por las que este método es tan poderoso es porque cada célula y etiqueta se pueden reemplazar para visualizar muchos tipos de células y moléculas. Por lo tanto, este método se puede utilizar para responder a cualquier pregunta relacionada con el seguimiento en cuatro dimensiones de moléculas. Creemos que esta técnica allanará el camino para que los investigadores exploren nuevas cuestiones dentro del campo del tráfico molecular.Todavía no está siendo ampliamente utilizado debido al complicado sistema, por lo que esperamos que este video de Jove mejore la accesibilidad a la técnica. Los láseres utilizados en el sistema son de clase cuatro, por lo que se debe tener absoluta precaución para garantizar la seguridad del láser. Por favor, tome el entrenamiento de seguridad láser necesario antes de usar este método.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Tecnología de microarrays de proteínas extracelulares para detección de alto rendimiento de las interacciones ligando-Receptor de baja afinidad

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Investigación

Bioquímica

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondear la estructura y dinámica de nucleosomas utilizando imágenes de microscopía de fuerza atómica

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Cuantificación de la dinámica de la red de interacción de proteínas mediante coinmunoprecipitación multiplexada

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Producción de Conjuntos de Motores de Dynein y Kinesin en Nanoestructuras de Origami de ADN para Observación de MoléculaS Simples

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Detección de fitoestrógenos usando un ensayo de receptores de estrógeno a base de células β Reporter

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Monitorización de la dinámica de interacción proteína-ARN in vivo a alta resolución temporal utilizando χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualización de dinámicas diffusionales de nanorods de oro en la membrana celular mediante microscopía de campo oscuro de nanopartícula única

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Cuantificación de la distribución de glucógeno subcelular en fibras musculares esqueléticas mediante microscopía electrónica de transmisión

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Visualización simultánea de la dinámica de microtúbulos reticulados y únicos in vitro mediante microscopía TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Uso de microfluídica y microscopía de fluorescencia para estudiar la dinámica de ensamblaje de filamentos y haces de actina única

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...