Name: visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Vi vill erkänna råd och vägledning från Dr Vytas Bindokas vid University of Chicago. Vi tackar Integrated Light Microscopy Core Facility vid University of Chicago för att stödja och underhålla galler ljusplåtmikroskop. Detta arbete stöddes av NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 och NSF Career Award 1653782 (till J.H.). Jr stöds av NSF Graduate Research Fellowships Program.

5C. C7 TCR-transgena RAG2 knockout möss i B10. En bakgrund användes i denna studie enligt ett protokoll som godkänts av institutionella Animal Care and Use Committee vid University of Chicago.
1. Skörda och aktivera T-celler
Den här delen av protokollet baseras på tidigare protokoll. Se citat för mer information20,21.
<ol><li>Avliva en 10-12 veckor gammal 5C. C7 transgen mus av båda könen (~ 20-25...

<ol>
	<li>Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physical+Basis+of+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+(TIRF)+Microscopy+and+Its+Cellular+Applications.">The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).</li><li>Shroff, H., White, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+Localization+Microscopy+(PALM)+of+Adhesion+Complexes.">Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes.</a> Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).</li><li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level.">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li><li>Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+speed+and+resolution+of+light+microscopy.">Advances in the speed and resolution of light microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).</li><li>. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: <a target="_blank" href="https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr">https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr</a> (2019)</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. , (2014).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+natural+killer+cells+maintain+long-term+antitumor+activity+by+epigenetic+imprinting+and+CD4++T+cell+help.">Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help.</a> Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).</li><li>Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Binds+to+B7-1+Only+In+Cis+on+the+Same+Cell+Surface.">PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).</li><li>Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly49C-dependent+control+of+MCMV+Infection+by+NK+cells+is+cis-regulated+by+MHC+Class+I+molecules.">Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules.</a> PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).</li><li>Sch&#246;neberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+cell+biology:+big+data+image+analytics+and+lattice+light-sheet+imaging+reveal+dynamics+of+clathrin-mediated+endocytosis+in+stem+cell-derived+intestinal+organoids.">4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids.</a> Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), 8302 (2019).</li><li>Cai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dynamic+microvillar+search+and+stabilization+during+ligand+detection+by+T+cells.">Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells.</a> Science. 356 (6338), 3118 (2017).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+Depletion+Initiates+Events+Leading+to+Granule+Secretion+at+the+Immunological+Synapse.">Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse.</a> Immunity. , (2015).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes.">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Peptide-Major+Histocompatibility+Complex+Ligand+Triggers+Digital+Cytokine+Secretion+in+CD4++T+Cells.">A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells.</a> Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).</li><li>Jansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+framework+for+analyzing+T+cell+receptor+scanning+of+peptides.">A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides.</a> Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).</li><li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart.">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li></ol>

Det presenterade protokollet optimerades för användning av CD4+ T-celler isolerade från 5C. C7 transgena möss på LLSM-instrumentet som används, och därför kan andra cellsystem och LLSMs behöva optimeras på olika sätt. Detta protokoll visar dock kraften i 4D-avbildning, eftersom det kan användas för att kvantifiera dynamiken i en ytreceptor på en hel cell med minst distorsion i fysiologiska förhållanden. Därför finns det många möjliga framtida tillämpningar av denna teknik.
<p class="jo...

Den exakta dynamiken i molekyler som handlar och sprider sig på den tredimensionella cellytan i realtid har varit en gåta att lösa. Mikroskopi har alltid varit en balans mellan hastighet, känslighet och upplösning; Om någon eller två maximeras minimeras den tredje. Därför, på grund av den lilla storleken och enorma hastighet med vilken ytan receptorer flytta, spåra deras dynamik har förblivit en stor teknisk utmaning för området cellbiologi. Till exempel har många studier genomförts med hjälp av total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi1,2,3, som har hög tidsmässig upplösning, men kan bara bild en mycket tunn del av T-cell membranet (~ 100 nm), och därför missar händelser som händer längre bort i cellen. Dessa TIRF-bilder visar också bara en tvådimensionell del av cellen. Däremot super-upplösning tekniker, såsom stokastiska optisk akonstruktion mikroskopi (STORM)4, fotoaktiverat lokalisering mikroskopi (PALM)5, och stimuleras utsläpp utarmning mikroskopi (STED)6, kan övervinna Abbe diffraktion gränsen för ljus. Dessa tekniker har hög rumslig upplösning (~ 20 nm upplösning)4,5,6,7, men de tar ofta många minuter att förvärva en fullständig tvådimensionell (2D) eller tredimensionell (3D) bild, och därför den tidsmässiga upplösningen går förlorad. Dessutom kan tekniker som STORM och PALM som är beroende av blinkande signaler ha felaktigheter i att räkna8,9. Elektronmikroskopi har den överlägset högsta upplösningen (upp till 50 upplösning)10; det kan även genomföras tredimensionellt med fokuserad jonstråle scanning elektronmikroskopi (FIB-SEM), vilket resulterar i upp till 3 nm XY och 500 nm Z upplösning11. Emellertid, någon form av elektronmikroskopi kräver hårda provberedning och kan endast utföras med fasta celler eller vävnader, vilket eliminerar möjligheten att avbildning levande prover över tiden.
Tekniker för att få den höga spatiotemporal upplösning som krävs för att identifiera dynamiken i ytan och intracellulära molekyler i levande celler i deras sanna fysiologiska 3D-natur är först nyligen utvecklas. En av dessa tekniker är Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, som använder en strukturerad ljusark för att drastiskt lägre photobleaching. Utvecklad 2014 av Nobelpristagaren Eric Betzig, den höga axiella upplösningen, låg photobleaching och bakgrundsljud, och förmåga att samtidigt bild hundratals plan per synfält gör LLS mikroskop överlägsen widefield, TIRF och konfokala mikroskop12,13,14,15,16,17,18,19. Denna fyrdimensionella (x, y, z och tid) bildteknik, medan fortfarande diffraktion begränsad (~ 200 nm XYZ upplösning), har otrolig tidsupplösning (vi har uppnått en bildhastighet på ca 100 fps, vilket resulterar i en 3D rekonstruerad cellbild med 0,85 sekunder per bild) för 3D spatial förvärv.
LLSM kan i allmänhet användas för att spåra realtidsdynamiken hos alla molekyler inom någon cell på enmolekyl- och encellnivå, särskilt de i mycket rörliga celler som immunceller. Till exempel visar vi här hur du använder LLSM för att visualisera T-cellsreceptordynamik (TCR). T-celler är effektorcellerna i det adaptiva immunsystemet. TCRs ansvarar för att känna igen peptid-MHC (pMHC) ligands visas på ytan av antigen-presenteraceller (APC), som bestämmer urval, utveckling, differentiering, öde och funktion av en T-cell. Detta erkännande sker vid gränssnittet mellan T-celler och APC, vilket resulterar i lokaliserade receptorkludering för att bilda vad som kallas immunologisk synaps. Även om det är känt att TCRs vid immunologiska synaps är absolut nödvändigt för T-cells effector funktion, fortfarande okänd är de underliggande mekanismerna för realtid TCR människohandel till synapsen. LLSM har gjort det möjligt för oss att i realtid visualisera dynamiken i TCRs före och efter människohandel till synapsen med den resulterande pMHC-TCR interaktion (figur 1). LLSM kan därför användas för att lösa aktuella frågor om tcr-formatdynamiken och ge insikter för att förstå hur en cell skiljer mellan själv- och utländska antigener.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm round coverslips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>502040</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70um Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7201431</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR &#946; chain Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109215</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>X&#38;Y Cell Culture</td>
			<td>FBS-500</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Denisty gradient reagent for T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lattice Light-Sheet Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope Used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLSpy</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK</td>
			<td>Elimbio</td>
			<td>Custom Synthesis</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penacillin/Streptamycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122_3683884612</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse IL-2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0523</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slidebook</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSM imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Dissection Tools</td>
			<td>Nova-Tech International</td>
			<td>DSET10</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231710126</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44685</td>
			<td>For preparing Fab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy

Signalering och funktion av en cell dikteras av de dynamiska strukturerna och interaktionerna hos dess ytreceptorer. För att verkligen förstå struktur-funktion förhållandet mellan dessa receptorer på plats, måste vi visualisera och spåra dem på levande cellytan med tillräckligt spatiotemporal upplösning. Här visar vi hur man använder nyligen utvecklade Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) för att avbilda T-cellsreceptorer (TCRs) fyrdimensionellt (4D, utrymme och tid) vid levande cellmembranet. T-celler är en av de viktigaste effektorcellerna i det adaptiva immunsystemet, och här använde vi T-celler som ett exempel för att visa att signalering och funktion av dessa celler drivs av dynamiken och interaktionerna hosTAT. LLSM möjliggör 4D-avbildning med oöverträffad spatiotemporal upplösning. Denna mikroskopiteknik kan därför i allmänhet appliceras på ett brett spektrum av yt- eller intracellulära molekyler av olika celler i biologin.

Här beskriver vi isolering, förberedelse och avbildning av primär mus 5C. C7 T-celler med hjälp av ett galler ljusplåtmikroskop. Under avsnitt 3 är det absolut nödvändigt att justera mikroskopet korrekt och att dagligen samla in PSF som för att avsvälla data efter insamling. I figur 2visar vi rätt justeringsbilder som kommer att ses när mikroskopet justeras. Figur 2A och figur 2B visar r...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Målet med detta protokoll är att visa hur man använder Lattice Light-Sheet Mikroskopi för att fyrdimensionellt visualisera ytreceptordynamik i levande celler. Här visas T-cellreceptorer på CD4+ primära T-celler.

Visualisera Surface T-cellsreceptordynamik fyrdimensionellt använda lattice ljusark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Lattice ljus-ark mikroskopi är en kraftfull bildteknik, men få laboratorier i världen kan använda den. Detta protokoll ger en detaljerad översikt över hur man använder kommersiellt tillgängliga gitter light-sheet mikroskop. Det är ett extremt kraftfullt system som kan fyrdimensionell avbildning av enskilda celler eller embryon som möjliggör spårning i realtid av molekyler.Den största fördelen med denna teknik är att det kan tredimensionellt bild enda levande celler eller organ med hög spatiotemporal upplösning och minimal foto blekning. Gittermönstret i ljusbladet gör det möjligt för oss att snabba bildprover och få videor i realtid av tredimensionella levande celler och organ med molekylära detaljer som andra tekniker inte kan uppnå. Denna första video protokoll som visar hur vi oss gitter ljus-ark mikroskopi till bild enda cell fyrdimensionellt.Detta är en mycket komplicerad teknik på grund av anpassning och provberedning. Och vi tror att visuell demonstration kommer att förbättra tillgängligheten genom att tillåta fler forskare att avbilda många olika molekyler, celler och organ i biologi. För att påbörja detta förfarande, inkubera fem millimeter runda coverslips med 0,1%poly-L-lysin vid rumstemperatur i 10 minuter.Aspirera av vätskan och låt täckskydden lufttorka naturligt. Därefter lägger du till tre milliliter densitetsgradient till ett 15 milliliter koniskt rör. Lägg försiktigt celler drop-wise till kanten av röret.Centrifugera vid 930 gånger g och vid fyra grader Celsius i 10 minuter. Efter detta försiktigt bort det tunna mellersta lagret av celler mellan den kompletta media och densitet gradient reagens se till att sätta varje celltyp i en separat konisk rör. Centrifugera vid 300 gånger g i fem minuter för att tvätta cellerna.Kassera supernatanten och tillsätt fem milliliter RPMI till rören av T-celler och CH27 celler. Upprepa tvätten med färskt RPMI tills tre totaltvättar har utförts. Sedan, resuspend cellerna i varje rör med en milliliter av komplett RPMI och räkna cellerna med en hemocytometer.Resuspend en miljon antigen-presentera celler i 500 microliters av komplett RPMI och lägga till 10 mikromolar MCC. Inkubera vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid i tre timmar. Efter detta, resuspend en miljon T-celler i 500 microliters av komplett RPMI.Tillsätt två mikrogram anti-TCR beta Alexa 488 märkt FAB och inkubera i 37 grader Celsius med 5%koldioxid i 30 minuter. Därefter centrifug båda cellerna vid 300 gånger g i fem minuter och kassera supernatanten. Tillsätt 500 mikroliter av komplett RPMI och upprepa centrifug för att tvätta cellerna.Upprepa tvätten med färskt RPMI tills tre totala tvättar har utförts kasta supernatanten efter varje tvätt. Efter detta, resuspend båda celltyperna i 500 microliters av bildbehandlingsmedia. Tillsätt först 10 milliliter vatten och 30 mikroliter fluorescein till LLSM-badet.Tryck på Image Home för att flytta objektet till bildposition och titta på ett enda Bessel laserstrålemönster. Rikta in laserstrålen med hjälp av guide och förinställd region av intresse för att göra strålen till ett tunt mönster som är balanserat i alla riktningar. Strålen ska också visas fokuserad i finder kameran.Använd de två spegellutningsjusterarna, den övre fokus mikrometern, och den objektiva färgen för att justera strålen. Därefter tvätta badet och målen med minst 200 milliliter vatten för att helt ta bort eventuella fluorescein. Om du vill avbilda standardfluorescerande pärlor aktiverar du gitter genom att ställa in till tre i rutan Xgalvo-intervall och tryck på Live för att visa aktuellt fält.Justera lutningsspegeln, objektiv färg och fokus mikrometer manuellt för högsta gråvärden. Justera sedan vid behov för att erhålla ordentliga mönster för objektiv skanning, Z galvo, Z plus objektiva och provskanningsavsökningslägen. Efter detta trycker du på Utför i provgenomsökningsläget för att samla provpunktsspridningsfunktionen för de-skevning och de-convolution.Ändra lasrarna till tre färgläge och tryck på Utför igen. Till att börja, tillsätt 100, 000 anti-presentera celler till den förberedda fem millimeter diameter cirkulära coverslip och låta dem nöja sig med 10 minuter. Smörj provhållaren och tillsätt täckskydd till den cellsidan uppåt.Lägg sedan till en droppe bildmedia på baksidan av täcket. Skruva fast provhållaren på Piezo och tryck på Image Home. Hitta en antigenpresenterande cell till bild och se till att LLSM och bildhanteringsprogram fungerar korrekt.Tryck på Live för att visa den aktuella bilden. Flytta längs Z för att hitta coverslip och celler. Hitta mitten av en antigenpresenteringscell genom att röra sig i Z-riktningen och tryck sedan på Stopp för att pausa lasern.Kontrollera 3D och mata in önskade inställningar. Tryck på Center och tryck sedan på Utför för att samla in data. Sänk scenen till lastpositionen och tillsätt 50 mikroliter av T-celler och bildhanteringsmedia droppvis direkt över täcket.Det är bäst att låta en droppe form på slutet av pipetten spets och sedan röra spetsen till badet vätska. Höj scenen bakåt genom att klicka på Bildretur. Påbörja bildbehandling.Var noga med att ställa in önskad Z stack och timelapse längd. Till exempel bild 60 Z stackar vid en 0,4 mikrometer steg storlek och ingång 500 tidsramar. Stoppinspelning innan 500 bildrutor nås för att undvika fotoblekning.Använd live-läge för att söka efter cellpar och när redo och önskade inställningar har skrivits in, tryck på Utför för att samla in data. I denna studie, primära mus 5CC7 T-celler är isolerade och beredda och sedan avbildas med hjälp av ett gitter ljus-ark mikroskop. Visas här är rätt strålbana och stråljustering när den avbildas med fluorescein.Målsökningen ska visa en stor X-form i XZ- och YZ-projektionerna som är så symmetrisk som möjligt. De bör också justeras så att de är så små som möjligt av ett X. Z galvo-skanningen ska visa en oval i XZ och XY med en enda punkt på vardera sidan.Slutligen bör både Z plus objektiv skanning och provskanning visa punkter som ser så runda som möjligt. Med hjälp av detta protokoll, den fyrdimensionella dynamiken i T-cellsreceptorer på en T-cell yta kunde ses. Den största fördelen med detta mikroskop ligger i förmågan att spåra de visualiserade ytenheterna hos T-cellsreceptorerna och att få kvantifierade data från deras storlek, rörelse, signalintensitet och utsöndring.Det viktigaste att komma ihåg är kvaliteten på din anpassning. Gittern ljusbladet måste vara inriktade dagligen och inte göra detta på rätt sätt kommer att resultera i förvrängd bildbehandling. På samma sätt påverkar kvaliteten på polyesterstapel polyesterstapeln som samlas in direkt kvaliteten på de-faltningen vilket i slutändan resulterar i kvaliteten på din slutliga bild.En av anledningarna till denna metod är så kraftfull är att varje cell och etikett kan ersättas för att visualisera många celltyper och molekyler. Därför kan denna metod användas för att svara på alla frågor som rör fyrdimensionell spårning av molekyler. Vi tror att denna teknik kommer att bana väg för forskare att utforska nya frågor inom området för molekylär handel.Det är ännu inte används i stor utsträckning på grund av det komplicerade systemet så vi hoppas att denna Jove video kommer att förbättra tillgängligheten till tekniken. De lasrar som används på systemet är klass fyra så absolut försiktighet måste vidtas för att säkerställa lasersäkerhet. Vänligen ta nödvändig lasersäkerhetsutbildning innan du använder denna metod.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellulära Protein Mikroarrayteknik för hög genomströmning upptäckt av låg affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondera strukturen och dynamiken i Nucleosomes med hjälp av Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantifiering av proteininteraktion Nätverksdynamik med hjälp av multiplexerade Co-immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening för fytoöstrogener med hjälp av en cellbaserad östrogenreceptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Övervakning av protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo vid hög tidsupplösning med χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisera diffusionell dynamik av guldnanroder på cellmembran med hjälp av en nanopartikel Darkfield Mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Kvantifiering av subcellulär glykogenfördelning i skelettmuskelfibrer med hjälp av transmissionselektronmikroskopi

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Samtidig visualisering av dynamiken i tvärbundna och enskilda mikrotubuli in vitro med TIRF-mikroskopi

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Använda mikrofluidik och fluorescensmikroskopi för att studera monteringsdynamiken hos enstaka aktinfilament och buntar

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...