Name: visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Chicago Üniversitesi'nden Dr. Vytas Bindokas'ın tavsiye ve rehberliğini kabul etmek istiyoruz. Kafes ışık levhamikroskobunu destekleyip koruduğu için Chicago Üniversitesi'ndeki Entegre Işık Mikroskobu Çekirdek Tesisi'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH Yeni Yenilikçi Ödülü 1DP2AI144245 ve NSF Kariyer Ödülü 1653782 (To J.H.) tarafından desteklenmiştir. J.R. NSF Lisansüstü Araştırma Bursprogramı tarafından desteklenir.

5C'ye kadar. B10'da C7 TCR-transgenik RAG2 nakavt fareler. Chicago Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan bir protokole göre bu çalışmada bir arka plan kullanılmıştır.
1. T Hücrelerinin Hasat ve Aktive
NOT: Protokolün bu bölümü önceki protokolleri temel alınr. Daha fazla ayrıntı için alıntılarbakınız 20,21.
<ol><li>10-12 haftalık 5C ötenazi....

<ol>
	<li>Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physical+Basis+of+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+(TIRF)+Microscopy+and+Its+Cellular+Applications.">The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).</li><li>Shroff, H., White, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+Localization+Microscopy+(PALM)+of+Adhesion+Complexes.">Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes.</a> Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).</li><li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level.">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li><li>Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+speed+and+resolution+of+light+microscopy.">Advances in the speed and resolution of light microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).</li><li>. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: <a target="_blank" href="https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr">https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr</a> (2019)</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. , (2014).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptively+transferred+natural+killer+cells+maintain+long-term+antitumor+activity+by+epigenetic+imprinting+and+CD4++T+cell+help.">Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help.</a> Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).</li><li>Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Binds+to+B7-1+Only+In+Cis+on+the+Same+Cell+Surface.">PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).</li><li>Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly49C-dependent+control+of+MCMV+Infection+by+NK+cells+is+cis-regulated+by+MHC+Class+I+molecules.">Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules.</a> PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).</li><li>Sch&#246;neberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+cell+biology:+big+data+image+analytics+and+lattice+light-sheet+imaging+reveal+dynamics+of+clathrin-mediated+endocytosis+in+stem+cell-derived+intestinal+organoids.">4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids.</a> Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), 8302 (2019).</li><li>Cai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dynamic+microvillar+search+and+stabilization+during+ligand+detection+by+T+cells.">Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells.</a> Science. 356 (6338), 3118 (2017).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+Depletion+Initiates+Events+Leading+to+Granule+Secretion+at+the+Immunological+Synapse.">Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse.</a> Immunity. , (2015).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes.">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Peptide-Major+Histocompatibility+Complex+Ligand+Triggers+Digital+Cytokine+Secretion+in+CD4++T+Cells.">A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells.</a> Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).</li><li>Jansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+framework+for+analyzing+T+cell+receptor+scanning+of+peptides.">A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides.</a> Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).</li><li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart.">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li></ol>

Sunulan protokol 5C'den izole edilen CD4+ T hücrelerinin kullanımı için optimize edilmiştir. Kullanılan LLSM cihazındaki C7 transgenik farelerin ve bu nedenle diğer hücre sistemlerinin ve LLSM'lerin farklı şekilde optimize edilmesi gerekebilir. Ancak, bu protokol 4D görüntülemenin gücünü gösterir, çünkü tüm hücredeki bir yüzey reseptörünün dinamiklerini fizyolojik koşullarda en az bozulmaile ölçmek için kullanılabilir. Bu nedenle, bu tekniğin birçok olası gelecekteki uygulama...

Üç boyutlu hücre yüzeyinde gerçek zamanlı olarak yayılan ve yayılan moleküllerin hassas dinamikleri çözülmesi gereken bir muamma olmuştur. Mikroskopi her zaman hız, hassasiyet ve çözünürlük dengesi olmuştur; herhangi bir veya iki maksimize edilirse, üçüncü en aza indirilir. Bu nedenle, yüzey reseptörlerinin hareket ettiği küçük boyut ve muazzam hız nedeniyle, dinamiklerinin izlenmesi hücre biyolojisi alanında önemli bir teknolojik zorluk olmaya devam etmiştir. Örneğin, birçok çalışma toplam iç yansıma floresansı kullanılarak yapılmıştır (TIRF) mikroskopi1,2,3, yüksek zamansal çözünürlüğe sahiptir, ancak sadece T-hücre zarının çok ince bir dilimigörüntü olabilir (~100 nm), ve bu nedenle hücrede daha uzakta oluyor olayları özlüyor. Bu TIRF görüntüleri de sadece hücrenin iki boyutlu bir bölümünü gösteriyor. Buna karşılık, süper çözünürlüklü teknikler, örneğin stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (STORM)4, fotoaktive lokalizasyon mikroskopisi (PALM)5, ve uyarılmış emisyon tükenmesi mikroskopisi (STED)6, Abbe kırınım sınırının üstesinden gelebilir. Bu teknikler yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip (~20 nm çözünürlük)4,5,6,7, ama genellikle tam iki boyutlu (2D) veya üç boyutlu (3D) görüntü elde etmek için birkaç dakika sürer, ve bu nedenle zamansal çözünürlük kaybolur. Buna ek olarak, yanıp sönen sinyallere dayanan STORM ve PALM gibi tekniklerde8,9saymada yanlışlıklar olabilir. Elektron mikroskobu açık ara en yüksek çözünürlüğe sahiptir (en fazla 50 pm çözünürlük)10; hatta 3 nm XY ve 500 nm Z çözünürlüğü11'ekadar sonuçlanan odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM) ile üç boyutlu olarak yapılabilir. Ancak, elektron mikroskobu herhangi bir form sert örnek hazırlanması gerektirir ve sadece sabit hücreleri veya dokuları ile yapılabilir, zaman içinde canlı örnekleri görüntüleme olasılığını ortadan kaldırarak.
Gerçek fizyolojik 3D doğacanlı hücrelerde yüzey ve hücre içi moleküllerin dinamiklerini belirlemek için gerekli yüksek spatiotemporal çözünürlük elde etmek için teknikler sadece son zamanlarda geliştirilmiştir. Bu tekniklerden biri kafes Işık-Levha Mikroskobu (LLSM)12, büyük ölçüde daha düşük photobleaching için yapılandırılmış bir ışık levha kullanır. Nobel Ödüllü Eric Betzig tarafından 2014 yılında geliştirilen, yüksek eksenel çözünürlük, düşük fotobeyazrlama ve arka plan gürültüsü, ve aynı anda görüş alanı başına yüzlerce uçak görüntü lls mikroskoplar geniş alan, TIRF ve konfokal mikroskoplar12,13,14,15,16,17,18,19. Bu dört boyutlu (x, y, z ve zaman) görüntüleme tekniği, hala kırınım sınırlı iken (~ 200 nm XYZ çözünürlük), inanılmaz zamansal çözünürlüğe sahiptir (biz yaklaşık 100 fps bir kare hızı elde ettik, çerçeve başına 0.85 saniye ile 3D yeniden hücre görüntüsü sonuçlanan) 3D mekansal edinim için.
LLSM genellikle tek moleküllü ve tek hücre düzeyinde herhangi bir hücre içinde herhangi bir molekülün gerçek zamanlı dinamikleri izlemek için kullanılabilir, bağışıklık hücreleri gibi son derece hareketli hücrelerde özellikle. Örneğin, Burada T-hücre reseptör (TCR) dinamiklerini görselleştirmek için LLSM nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. T hücreleri adaptif bağışıklık sisteminin efektör hücreleridir. TC'ler, bir T hücresinin seçimini, gelişimini, farklılaşmasını, kaderini ve işlevini belirleyen antijen sunan hücrelerin (APC) yüzeyinde görüntülenen peptid-MHC (pMHC) ligandlarını tanımaktan sorumludur. Bu tanıma T hücreleri ve AAP'ler arasındaki arabirimde meydana gelir, immünolojik sinaps denilen oluşturmak için lokalize reseptör kümeleme ile sonuçlanan. İmmünolojik sinapstaki TCR'lerin T-hücre efektörü fonksiyonu için zorunlu olduğu bilinmekle birlikte, sinapsa gerçek zamanlı TCR ticaretinin altında yatan mekanizmalar hala bilinmemektedir. LLSM, ortaya çıkan pMHC-TCR etkileşimi ile sinapsa ticareti öncesi ve sonrası TCR'lerin dinamiklerini gerçek zamanlı olarak görselleştirmemizi sağlamıştır (Şekil 1). LLSM bu nedenle TT'lerin biçimlendirici dinamiklerinin güncel sorularını çözmek ve bir hücrenin benlik ve yabancı antijenleri nasıl ayırt oluşturduğunu anlamak için içgörüler sağlamak için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm round coverslips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>502040</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70um Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7201431</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR &#946; chain Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>109215</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>X&#38;Y Cell Culture</td>
			<td>FBS-500</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>Denisty gradient reagent for T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>For microscope alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lattice Light-Sheet Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope Used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLSpy</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK</td>
			<td>Elimbio</td>
			<td>Custom Synthesis</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penacillin/Streptamycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122_3683884612</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td>For Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse IL-2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0523</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10040CV</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slidebook</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>LLSM imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Dissection Tools</td>
			<td>Nova-Tech International</td>
			<td>DSET10</td>
			<td>For T cell harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flasks</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231710126</td>
			<td>For T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44685</td>
			<td>For preparing Fab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing surface t-cell receptor dynamics four-dimensionally using lattice light-sheet microscopy

Bir hücrenin sinyalizasyonu ve işlevi, yüzey reseptörlerinin dinamik yapıları ve etkileşimleri tarafından belirlenir. Bu reseptörlerin yerinde ki yapı-fonksiyon ilişkisini gerçekten anlamak için, onları canlı hücre yüzeyinde yeterli spatiotemporal çözünürlükle görselleştirmemiz ve izlememiz gerekir. Burada nasıl görüntü T-hücre reseptörleri (TDR) dört boyutlu (4D, uzay ve zaman) canlı hücre zarında son zamanlarda geliştirilen Kafes Işık-Sheet Mikroskobu (LLSM) nasıl kullanılacağını göstermektedir. T hücreleri adaptif bağışıklık sisteminin ana efektör hücrelerinden biridir, ve burada bu hücrelerin sinyalve fonksiyonu Tcr dinamikleri ve etkileşimleri tarafından tahrik olduğunu göstermek için bir örnek olarak T hücrelerikullanılır. LLSM, benzeri görülmemiş spatiotemporal çözünürlükte 4D görüntülemeye olanak tanır. Bu nedenle bu mikroskopi tekniği genellikle biyolojide farklı hücrelerden çok çeşitli yüzey veya hücre içi moleküllere uygulanabilir.

Burada, birincil fare 5C'nin izolasyon, hazırlık ve görüntülemesini açıklıyoruz. Kafes ışık sayfası mikroskobu kullanan C7 T hücreleri. Bölüm 3 sırasında, mikroskobu doğru hizalamak ve toplama dan sonra verileri deconvolve hangi ile PSF günlük toplamak için zorunludur. Şekil2'de, mikroskobu hizalarken görülecek doğru hizalama görüntülerini gösteririz. Şekil 2A ve Şekil 2B,</str...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy at JoVE.com

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Bu protokolün amacı, canlı hücrelerdeki yüzey reseptör dinamiklerini dört boyutlu olarak görselleştirmek için Kafes Işık Sayfası Mikroskobu'nun nasıl kullanılacağını göstermektir. Burada CD4+ primer T hücrelerindeki T hücre reseptörleri gösterilmiştir.

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Kafes ışık sayfası mikroskobu güçlü bir görüntüleme teknolojisidir, ancak dünyadaki çok az laboratuvar bunu kullanabiliyor. Bu protokol, ticari olarak kullanılabilen kafes ışık sayfası mikroskobunun nasıl kullanılacağına ayrıntılı bir genel bakış sağlar. Moleküllerin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak tanıyan tek tek hücrelerin veya embriyoların dört boyutlu görüntüleme yeteneğine sahip son derece güçlü bir sistemdir.Bu tekniğin en büyük avantajı, yüksek spatiotemporal çözünürlüğü ve minimal fotoğraf ağartma ile tek canlı hücreleri veya organları üç boyutlu olarak görüntülemesidir. Işık tabakasının kafes deseni, yüksek hızlı görüntü örneklerine ulaşmamızı ve diğer tekniklerin elde edemediği moleküler ayrıntılarla üç boyutlu canlı hücre ve organların gerçek zamanlı videolarını almamızı sağlar. Bu ilk video protokolü bize kafes ışık sayfası mikroskopi dört boyutlu görüntü tek hücreli nasıl gösteren.Bu hizalama ve örnek hazırlama nedeniyle çok karmaşık bir tekniktir. Ve görsel gösterinin, daha fazla bilim adamının biyolojideki birçok farklı molekül, hücre ve organı görüntülemesine izin vererek erişilebilirliği artıracağına inanıyoruz. Bu prosedüre başlamak için, beş milimetrelik yuvarlak kapakları oda sıcaklığında %0,1 poli-L-l-lizin ile 10 dakika kuluçkaya yatırın.Sıvıyı aspire edin ve kapakların havasının doğal olarak kurumasına izin verin. Daha sonra, 15 mililitrelik konik bir tüpe üç mililitre yoğunluk degradesi ekleyin. Dikkatlice hücre tüp kenarına damla akıllıca ekleyin.Santrifüj 930 kez g ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede. Bundan sonra, tüm ortam ile yoğunluk gradyan reaktifi arasındaki ince orta hücre tabakasını dikkatlice çıkarın ve her hücre türünü ayrı bir konik tüpe koyduğunuzdan emin olun. Hücreleri yıkamak için 5 dakika boyunca 300 kez g santrifüj.Supernatant atın ve T-hücreleri ve CH27 hücrelerinin tüpleri rpmi beş mililitre ekleyin. Üç toplam yıkayılmış olana kadar taze RPMI ile yıkamayı tekrarlayın. Daha sonra, tam RPMI bir mililitre ile her tüp hücreleri resuspend ve bir hemositometre ile hücreleri saymak.Tam RPMI 500 mikrolitre bir milyon antijen sunan hücreleri resuspend ve 10 mikromolar MM ekleyin. 37 derecede %5 karbondioksitle üç saat kuluçkaya yat. Bundan sonra, tam RPMI 500 mikrolitre bir milyon T-hücreleri resuspend.Anti-TCR beta Alexa 488 FAB etiketli iki mikrogram ekleyin ve 30 dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece inkübat. Daha sonra, her iki hücreyi de 5 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Tam RPMI 500 mikrolitre ekleyin ve hücreleri yıkamak için santrifüj tekrarlayın.Her yıkamadan sonra süpernatantı atarak toplam üç yıkama yapılana kadar taze RPMI ile yıkayın. Bundan sonra, görüntüleme medya 500 mikrolitre her iki hücre türünü resuspend. İlk olarak, LLSM banyosu için su ve floresan 30 mikrolitre 10 mililitre ekleyin.Nesneyi görüntü konumuna taşımak ve tek bir Bessel lazer ışını desenine bakmak için Resim Evi'ne basın. Lazer ışınını kılavuz ve önceden ayarlanmış ilgi bölgesini kullanarak hizalayın ve ışını her yönde dengelenmiş ince bir desen haline getirin. Işın da bulucu kamera odaklanmış görünmelidir.Kirişi ayarlamak için iki ayna eğim ayarlayıcısını, üst odak mikrometresini ve nesnel rengi kullanın. Sonra, banyo ve tamamen herhangi bir floresan kaldırmak için su en az 200 mililitre ile hedefleri yıkayın. Standart floresan boncukları görüntülemek için, Xgalvo aralık kutusunda üçe ayarlayarak ayarlayıcıyı açın ve geçerli alanı görüntülemek için Live tuşuna basın.En yüksek gri değerler için eğim aynasını, nesnel rengi ve odak mikrometresini el ile ayarlayın. Daha sonra, nesnel tetkik, Z galvo, Z artı hedef ve örnek tetkik yakalama modları için uygun desenleri elde etmek için gerektiği gibi ayarlayın. Bundan sonra, de-skewing ve de-convolution için örnek nokta yayma işlevini toplamak için örnek tetkik modunda Yürüt'e basın.Lazerleri üç renk moduna geçin ve tekrar Çalıştır'a basın. Başlamak için, hazırlanan beş milimetre çapında dairesel kapak için 100, 000 anti-sunum hücreleri ekleyin ve onları 10 dakika yerleşmek için izin. Numune tutucuyu yağlayın ve kapak kaymasını hücre tarafına yukarı ekleyin.Ardından, kapağın arkasına bir damla görüntüleme ortamı ekleyin. Örnek tutucuyu Piezo'ya vidala ve Image Home tuşuna basın. Görüntü için bir antijen sunan hücre bulun ve LLSM ve görüntüleme yazılımıdüzgün çalıştığından emin olun.Geçerli görüntüyü görüntülemek için Canlı'ya basın. Kapak ve hücreleri bulmak için Z boyunca hareket edin. Z yönünde hareket ederek bir antijen sunan hücrenin merkezini bulun, sonra lazeri duraklatmak için Dur tuşuna basın.3D'yi kontrol edin ve istediğiniz ayarları girin. Verileri toplamak için Center tuşuna basın ve ardından Yürüt'e basın. Aşamayı yük konumuna indirin ve 50 mikrolitre T-hücresi ve görüntüleme ortamını doğrudan kapağın üzerine bırakın.Bu pipet ucu ucunda bir damla formu izin ve daha sonra banyo sıvı ucu dokunmak en iyisidir. Resim İadesi'ni tıklatarak sahneyi geri yükseltin. Görüntülemeye başla.İstediğiniz Z yığınını ve timelapse uzunluğunu ayarladığından emin olun. Örneğin, resim 60 Z 0,4 mikrometre adım boyutunda yığınlar ve giriş 500 zaman dilimi. Fotoğraf beyazlatma önlemek için 500 kare ulaşılmadan önce kayıt durdurun.Hücre çiftleri aramak için canlı modu kullanın ve hazır ve istenen ayarlar girildiğinde veri toplamak için Yürüt'e basın. Bu çalışmada, birincil fare 5CC7 T-hücreleri izole edilip hazırlanır ve daha sonra bir kafes ışık sayfası mikroskobu kullanılarak görüntülenir. Burada gösterilen doğru ışın yolu ve floresan ile görüntülendiğinde ışın hizalaması vardır.Objektif talan, XZ ve YZ projeksiyonlarında mümkün olduğunca simetrik büyük bir X şekli göstermelidir. Ayrıca mümkün olduğunca küçük bir X olarak ayarlanmalıdır. Z galvo scan xz ve XY her iki tarafta tek bir nokta ile bir oval göstermelidir.Son olarak, hem Z artı nesnel taramak hem de örnek taramak mümkün olduğunca yuvarlak görünen noktagöstermelidir. Bu protokol kullanılarak T-hücre yüzeyindeki T-hücre reseptörlerinin dört boyutlu dinamiği görülebilir. Bu mikroskobun en büyük avantajı, T-hücre reseptörlerinin görselleştirilmiş yüzey birimlerini takip edebilme ve boyutları, hareketleri, sinyal yoğunluğu ve dışkılarından sayısal laştırılmış veriler elde edebilme yeteneğidir.Hatırlanması gereken en önemli şey hizalama kalitesidir. Kafes ışık sayfası günlük olarak hizalanmalıdır ve bunu düzgün yapmamak çarpık görüntülemeye neden olur. Benzer şekilde, psf'nin kalitesi doğrudan son görüntünün kalitesini sağlayan de-convolution kalitesini etkiler.Bu yöntemin bu kadar güçlü olmasının nedenlerinden biri, her hücre nin ve etiketin birçok hücre tipini ve molekülü görselleştirmek için değiştirilebilmeleridir. Bu nedenle, bu yöntem moleküllerin dört boyutlu izleme ile ilgili herhangi bir soruyu cevaplamak için kullanılabilir. Bu tekniğin araştırmacıların moleküler kaçakçılık alanında yeni sorular keşfetmelerinin önünü açacağını düşünüyoruz.Biz bu Jove video tekniğierişilebilirlik artıracak umuyoruz bu yüzden henüz yaygın olarak karmaşık sistem nedeniyle kullanılan değildir. Sistemde kullanılan lazerler sınıf 4 bu yüzden mutlak dikkatli lazer güvenliğini sağlamak için alınmalıdır. Lütfen bu yöntemi kullanmadan önce gerekli lazer güvenlik eğitimini alın.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Tek Nanopartikül Darkfield Mikroskopisi Kullanarak Hücre Zarında Altın Nanorodların Difüzyonel Dinamiklerini Görselleştirme

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

İskelet Kas Liflerinde Subsellüler Glikojen Dağılımının İletim Elektron Mikroskobu Kullanılarak Ölçülmesi

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...