Name: optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry
Uploaded: 2019-07-26T14:30:00
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Los autores quieren agradecer a Ed Stack, anteriormente de Perkin Elmer, por su ayuda con la configuración y optimización de la tinción multiplex original. Los autores también quieren agradecer a Kristen Schmidt de Akoya Biosciences por consejos de uso del software de análisis. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud del Cáncer bajo el Premio Número P30CA046592, K08CA201581(tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. El apoyo adicional fue proporcionado por Jeffery A. Colby Colon Cancer y Tom Liu Memorial Research Funds.

Todo el trabajo ha sido aprobado por la junta de revisión interna de la Universidad de Michigan.
1. Optimización de anticuerpos primarios y preparación de diapositivas
<ol><li>Determinar la concentración ideal de anticuerpos para multiplex utilizando IHC convencional.<ol>
<li>Pruebe los anticuerpos para el multiplex mediante inmunohistoquímica convencional manual (IHC)13.</li>
<li>Utilice tejidos específicos que tengan un tipo de célula abundante para cada anti...

<ol>
	<li>Lazarus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+phenotypic+immune+profiling+of+metastatic+colon+cancer.">Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer.</a> JCI Insight. 3 (22), (2018).</li><li>Barua, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Spatial+Analysis+Platform+for+Discovery+of+Immunological+Interactions+Predictive+of+Low-Grade+to+High-Grade+Transition+of+Pancreatic+Intraductal+Papillary+Mucinous+Neoplasms.">A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms.</a> Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).</li><li>Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+reveals+hyper+active+TGF-beta+signaling+in+colorectal+cancer.">Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).</li><li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer.">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nature Communications. 8, 15095 (2017).</li><li>Steele, K. E., Brown, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Immunohistochemistry+for+Image+Analysis+of+Tertiary+Lymphoid+Structures+in+Cancer.">Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer.</a> Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).</li><li>Gorris, M. A. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li><li>Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+immunofluorescence+procedures+for+protein+analysis.">Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis.</a> Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).</li><li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+basic+principles+and+applications.">Flow cytometry: basic principles and applications.</a> Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+5-plex+fluorescent+immunohistochemistry+with+tyramide+signal+amplification+and+same+species+antibodies.">Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies.</a> Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).</li><li>Phenoptics Research Solutions. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Perkin Elmer Manual. , 32 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2014).</li><li>Carey, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+analysis+reveals+a+PD-L1-associated+microenvironmental+niche+for+Reed-Sternberg+cells+in+Hodgkin+lymphoma.">Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma.</a> Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).</li></ol>

Las muestras de tejido intactas de la biopsia de tumores sólidos y la resección quirúrgica siguen siendo importantes herramientas diagnósticas y predictivas para el análisis de la enfermedad, así como el pronóstico del paciente. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) es una técnica novedosa que combina los beneficios de la inmunohistoquímica (IHC), la inmunofluorescencia (IF) y la citometría de flujo. Los métodos anteriores para sondear las células in situ hanpermitido l...

La visualización de un microambiente tumoral intacto (TME) es esencial para evaluar no sólo la infiltración celular en neoplasias malignas sólidas, sino también las interacciones de células a células. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) ha surgido como una herramienta eficaz para el fenotipado multiantígeno de células en el estudio del cáncer y las enfermedades asociadas1,2,3,4, 5,6,7. Esto, en combinación con nuevos programas y software diseñados para analizargrandes conjuntos de datos, permite la observación de interacciones complejas entre las células 1,2,4. El factor limitante de la velocidad en la adquisición de datos es a menudo la calidad del tejido manchado antes del análisis.
Las técnicas anteriores utilizadas para las células fenotipo en el TME incluyen inmunohistoquímica (IHC), inmunofluorescencia (IF) y citometría de flujo, todas las cuales presentan limitaciones significativas. IHC utiliza secciones de tejido de parafina fija incrustada de formalina (FFPE) que se deparan y rehidratan antes de ser manchadas por la mayoría de las veces un anticuerpo. El uso de un anticuerpo secundario ligado a la peroxidasa de rábano picante(HRP) y una reacción química permite la visualización de un solo epítopo antigénico 8. Mientras que IHC es confiable y se realiza en el tejido FFPE que es fácil de trabajar con, limitaciones al espectro de luz visible significa que sólo uno o dos marcadores pueden ser confiables distinguidos y la colocación de antígenos bastante difícil8. Una forma de ampliar los marcadores disponibles y, por lo tanto, los antígenos que se pueden sondear en una sola sección es cambiar a fluorescencia que permite el uso de una gama más amplia del espectro visual. Para IF, el tejido congelado o FFPE se transfiere a diapositivas y anticuerpos utilizados que se conjugan a varios fluoróforos. Si bien esto aumenta el número de antígenos que se pueden sondear, hay varias limitaciones importantes. En primer lugar, debido a que cada anticuerpo normalmente sólo tiene un fluoróforo unido, el brillo a menudo no es lo suficientemente fuerte como para superar la autofluorescencia tisular. Es por esta razón, la mayoría de IF se realiza en tejido congelado que es caro de almacenar y difícil de trabajar con. Un número limitado de etiquetas fluorescentes están disponibles para su uso debido a la superposición espectral y la reactividad de las especies cruzadas, especialmente cuando se utilizan anticuerpos no conjugados. La citometría de flujo, que consiste en el procesamiento de tejido fresco en una suspensión de una solacélula y el etiquetado con anticuerpos fluorescentes ha sido el estándar de oro para el inmunofenotipado durante décadas 9,10. Un beneficio de la citometría de flujo es la capacidad de etiquetar múltiples anticuerpos sin preocupación por la reactividad cruzada de las especies, ya que la mayoría se conjugan. Debido a que las células son "visualizadas" por una máquina y no los ojos humanos, hay muchos más fluoróforos disponibles, pero esto tiene un costo. La compensación debe hacerse manualmente, lo que puede alterar significativamente los resultados produciendo poblaciones falsas positivas y negativas. La limitación más significativa de la citometría de flujo es que la arquitectura tisular y posteriormente toda la información espacial se pierde por la necesidad de la suspensión de células individuales.
La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) utilizando un microscopio fluorescente automatizado en combinación con un software novedoso combina los beneficios de IHC, IF y la citometría de flujo al permitir la tinción de tejido multiantígeno con amplificación de señal y retención de relaciones espaciales sin necesidad de compensación. El tejido FFPE se coloca en diapositivas cargadas que, después de la recuperación del antígeno, se someten a una ronda de aplicación de anticuerpos primarios al antígeno objetivo de interés seguido de un anticuerpo secundario con una etiqueta química HRP, similar a IHC. Después de la colocación del anticuerpo secundario, una reacción específica de HRP da como resultado una unión covalente de fluoróforo al epítopo de interés11. Una vez que el tejido está etiquetado, se completa otra ronda de calentamiento de las diapositivas eliminando el complejo de anticuerpos primarios y secundarios previamente aplicados dejando sólo la etiqueta fluorescente unida al epítopo de tejido11. Esto permite que múltiples anticuerpos de cualquier especie sean reaplicados sin preocupación por la reactividad cruzada11,12. Para minimizar cualquier necesidad de compensación manual de múltiples colorantes fluorescentes, se utiliza una colección de fluoróforos con poca superposición espectral, incluida una mancha de contador nuclear, para completar el mfIHC. Para tener en cuenta la autofluorescencia encontrada con el tejido FFPE, el software resta la autofluorescencia de la imagen final utilizando una imagen de una diapositiva en blanco que es posible debido a la fuerza de fluorescencia específica de antígeno después del fluoróforo amplificación de la señal. Utilizando programas novedosos diseñados para grandes conjuntos de datos, las ubicaciones de celdas se pueden identificar y analizar para el contexto espacial1,2,4. La limitación más significativa de esta técnica es el tiempo de optimización. Una metodología detallada con instrucciones para el diseño experimental y la estrategia de tinción e imagen se encuentra aquí. mfIHC será útil para laboratorios que actualmente no tienen un sistema de tinción automatizado optimizado que le gustaría entender mejor el contexto espacial de las interacciones de célula a célula en el tejido FFPE intacto utilizando la técnica manual.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>HC8001GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>HC10001GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>HC11001GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS135783</td>
			<td>inForm version 2.3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36961</td>
			<td>ProLong Diamond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td>Bloxall</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent diluent</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>ARD1A01EA</td>
			<td>Opal TSA diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 520</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1487001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 540</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1494001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 570</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1488001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 620</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1495001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 650</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1496001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 690</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1497001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore DAPI</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1490</td>
			<td>3 drops in TBST or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat resistant box</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>25608-904</td>
			<td>Plastic slide box-green</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified Chamber</td>
			<td>Ibi Scientific</td>
			<td>AT-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>FisherBiotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>ImmEdge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS140089</td>
			<td>Mantra quantitative pathology workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>NN-A661S</td>
			<td>with inverter technology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 6 antigen retrieval buffer</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>AR600</td>
			<td>AR6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 9 antigen retrieval buffer</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>AR900</td>
			<td>AR9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide box</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>25608-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9070936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-800</td>
			<td>Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody CD163</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>NCL-LCD163</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody CD3</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0452</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody CD8</td>
			<td>Spring Bio</td>
			<td>M5390</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody FOXP3</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M3515</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody pancytokeratin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>12653</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody PD-L1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>13684</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>ARH1001EA</td>
			<td>Opal polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide stain set</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>6254001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-012-CM</td>
			<td>TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical slide rack</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50-294-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry

La evaluación del microambiente del tejido intacto para el análisis de la infiltración celular y la organización espacial son esenciales para comprender la complejidad de los procesos de la enfermedad. Las técnicas principales utilizadas en el pasado incluyen inmunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia (IF) que permiten la visualización de las células como una instantánea en el tiempo utilizando entre 1 y 4 marcadores. Ambas técnicas tienen deficiencias, incluida la dificultad para manchar objetivos malgénicos y limitaciones relacionadas con la reactividad entre especies. IHC es confiable y reproducible, pero la naturaleza de la química y la dependencia del espectro de luz visible permite utilizar sólo unos pocos marcadores y hace que la colocalización sea un reto. El uso de IF amplía los marcadores potenciales, pero normalmente se basa en el tejido congelado debido a la extensa autofluorescencia del tejido después de la fijación de formalina. La citometría de flujo, una técnica que permite el etiquetado simultáneo de múltiples epítopos, deroga muchas de las deficiencias de IF e IHC, sin embargo, la necesidad de examinar las células como una suspensión de una sola célula pierde el contexto espacial de las células que descartan Relaciones. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) puentes de estas tecnologías que permiten el fenotipado celular multiepitope en tejido de parafina fija inhacina (FFPE) de formalina, preservando al mismo tiempo la arquitectura general del microambiente y el espacio relación de las células dentro del tejido intacto no interrumpido. Los fluoróforos de alta intensidad fluorescente que se unen covalentemente al epítopo tisular permiten múltiples aplicaciones de anticuerpos primarios sin preocuparse de la reactividad cruzada específica de la especie por anticuerpos secundarios. Aunque se ha demostrado que esta tecnología produce imágenes fiables y precisas para el estudio de enfermedades, el proceso de creación de una estrategia de tinción mfIHC útil puede llevar mucho tiempo y ser exigente debido a la amplia optimización y diseño. Con el fin de hacer imágenes robustas que representen interacciones celulares precisas in situ y para mitigar el período de optimización para el análisis manual, presentados aquí son métodos para la preparación de diapositivas, optimización de anticuerpos, diseño multiplex, así como errores, así como errores comúnmente durante el proceso de tinción.

El proceso general de obtención de un ensayo multiplex de 7 colores sigue un patrón repetitivo. La Figura 1 describe el proceso en forma diagramamática. Una vez que los portaobjetos se cortan y secan o se reciben del laboratorio y se hornean en un horno de hibridación a 60 oC durante 1 h, luego proceder a la desfinación y rehidratación, fijar los portaobjetos en formalina de nuevo seguido de recuperación de antígeno. Cada ronda de multiplexación comienza en la recuperación del ant?...

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Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry

La inmunohistoquímica fluorescente multiplex es una tecnología emergente que permite la visualización de múltiples tipos de células dentro del tejido integrado en parafina (FFPE) fijo en formalina. Se presentan pautas para asegurar un multiplex de 7 colores exitoso con instrucciones para optimizar anticuerpos y reactivos, preparar diapositivas, diseño y consejos para evitar problemas comunes.

Optimización, diseño y evitamiento de trampas en la inmunohistoquímica fluorescente multiplexación manual

Microenvironment evaluation of intact tissue for analysis of cell infiltration and spatial organization are essential in understanding the complexity of ...

La inmunohistoquímica fluorescente múltiple identifica múltiples tipos de células y sus ubicaciones en tejido integrado de parafina fijada en formalina, lo que permite no sólo la identificación celular, sino también el análisis espacial de célula a célula. La principal ventaja de esta técnica manual es el uso de múltiples anticuerpos de la misma especie sin reactividad cruzada. Esta técnica permite una visión en profundidad de las interacciones de las células inmunes y cancerosas en el microambiente tumoral.Al probar esta técnica por primera vez, permita aproximadamente tres a cuatro días de tinción y realice un seguimiento de cada paso completamente durante el proceso. Un método más débil del proceso de tinción y el diseño multiplex es fundamental para disminuir los escollos comunes y esperados. Comience desparafinando y rehidratando las diapositivas.Colóquelos en el horno de hibridación con el lado del tejido hacia arriba y hornéelos a 60 grados Centígrados durante una hora. Saque las diapositivas del horno y déjelas enfriar durante cinco a 10 minutos en un portaobjetos vertical. A continuación, utilice un conjunto de tinción deslizante para tratar las diapositivas tres veces con xileno y una vez con 100%etanol, 95% etanol y 70% etanol durante 10 minutos cada uno.Lave el estante de los portaobjetos con agua desionizada y luego fije las diapositivas sumergiéndolas en formalina tamponada neutra durante 30 minutos. Lave los toboganes con agua durante dos minutos y proceda con la recuperación de antígenos. Coloque el bastidor de los portaobjetos en una caja resistente al calor llena de pH 6.0 o pH 9.0 antigen buffer.Cubra la caja con una envoltura de plástico y fíjela con una banda de goma. Coloque la caja en un microondas equipado con inversor en el borde de la placa giratoria y caliente los portaobjetos durante 45 segundos a una potencia del 100%, seguido de 15 minutos a una potencia del 20%. Deje que las diapositivas se enfríen durante 15 a 20 minutos después de la microwaving.Mientras tanto, preparar soluciones de trabajo de anticuerpos y fluoróforos. Preparar el diluyente de anticuerpos primario disolviendo 0,5 gramos de gránulos de albúmina sérica bovina en 50 mililitros de TBST o 1X PBS. Diluir cada solución de trabajo de anticuerpos primarios a una concentración optimizada previamente determinada.Diluir cada fluoróforo en el diluyente de fluoróforo a una concentración de uno a 100. En el último día de tinción, prepare la solución de trabajo DAPI agregando tres gotas de DAPI a un mililitro de TBST. Una vez que los portaobjetos se enfríen, retírelos del microondas y quítelos de la envoltura de plástico.Lávelos con agua desionizada durante dos minutos seguido de un lavado de dos minutos con TBST. Después del lavado, seque el portaobjetos alrededor del tejido con una delicada limpieza de la tarea y trace alrededor del exterior del tejido con una pluma de barrera hidrófoba, teniendo cuidado de no tocar el tejido o dejar que se seque. Coloque cada diapositiva en la cámara del humidificador y agregue aproximadamente cuatro gotas de solución de bloqueo al tejido.A continuación, incubar los portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente y proceder con la aplicación primaria de anticuerpos. Retire la solución de bloqueo de cada diapositiva tocando el lado de la diapositiva en una pila de toallas de papel y utilice una delicada toallita de tarea para eliminar la solución restante. Coloque el portaobjetos de nuevo en la cámara humidificada, agregue aproximadamente 200 microlitros del anticuerpo primario de trabajo e incubar durante una hora.Después de la incubación, lave los portaobjetos tres veces sumergiéndolos en TBST durante dos minutos por lavado. Apague el TBST restante de cada diapositiva y aplique aproximadamente de tres a cuatro gotas de anticuerpo secundario. Incubar los portaobjetos en la cámara humidificada durante 10 minutos.Lave los portaobjetos de nuevo con TBST y aplique aproximadamente 100 microlitros de la solución de trabajo de fluoróforo. Vuelva a colocar los portaobjetos en la cámara humidificada e incubar durante 10 minutos. Repita el lavado TBST y luego microonda los portaobjetos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito para eliminar los anticuerpos.Una cosa importante a recordar durante este proceso de tinción de varios días es detenerse después del paso de microwaving y dejar las diapositivas en el tampón de recuperación de antígenos durante la noche, asegurando la integridad del tejido y las manchas. Retire la última aplicación de anticuerpos con la solución de recuperación de antígenos y lave los portaobjetos con agua desionizada seguida de TBST durante dos minutos por lavado. Repita los pasos de tinción para el resto de los pares de fluroforos de anticuerpos y, a continuación, proceda con la aplicación DAPI.Aplique aproximadamente 150 microlitros de solución DAPI de trabajo a cada tobogán e incubarlos en la cámara humidificada durante 10 minutos. Después de la incubación, lave los portaobjetos con TBST durante aproximadamente 30 segundos y monte los resbalones de la cubierta. Una vez que el medio de montaje se haya secado, aplique un esmalte de uñas transparente en las cuatro esquinas del resbalón de la cubierta para fijarlo.Para analizar el monoplex, imagine las diapositivas en el microscopio con una exposición de 250 milisegundos utilizando DAPI para enfocar. Evalúe cada diapositiva monoplex observando la intensidad de fluorescencia del marcador teñido y compare esta intensidad con el fondo. Utilice la posición de deslizamiento en el multiplexor final si la intensidad del marcador teñido es al menos cinco veces mayor que el fondo.Al manchar el multiplex, elija el orden adecuado para cada anticuerpo y asigne cada fluoróforo a un anticuerpo. Proceda con la tinción del multiplex como se describió anteriormente y prepare una diapositiva en blanco que reciba diluyente de anticuerpos, diluyente de fluoróforo y TBST en lugar de anticuerpo primario, fluoróforo o DAPI. Cuando esté listo para crear una imagen del multiplex en el microscopio, establezca la exposición en 250 milisegundos para todos los canales y capture cada imagen utilizando DAPI para enfocar.A continuación, utilice el software de análisis para evaluar cada multiplex por color fluorescente falso y por vista de patología, que confirmará la especificidad de cada marcador. Para asegurar el éxito del ensayo multiplex, se debe realizar un ensayo monoplex para determinar el orden de cada anticuerpo. Por ejemplo, cuando Foxp3 está en la tercera posición de la matriz, se demuestra la tinción y colocación específicas y robustas con CD3.Por el contrario, cuando Foxp3 está en la primera posición, se produce una tinción inespecífica de Foxp3. Las áreas de color rojo y granulado están presentes en la mayor parte del portaobjetos, y la intensidad fluorescente de estas áreas es baja. Otro paso importante en este ensayo es la contramancha DEPI, que es la base para la identificación celular y el análisis posterior.Se puede ver un contraste claro entre las imágenes con DAPI que trabajan y no funcionan. Para el ensayo multiplex, las hermosas imágenes compuestas no siempre reflejan una mancha precisa. Mientras que CD3 se visualiza y muestra tinción específica, la vista de campo brillante patológica de CD163 demuestra que el anticuerpo es inespecífico.Una imagen multiplex óptima muestra una tinción específica en una imagen compuesta, y la especificidad CD3 y CD163 se confirma con la vista de campo brillante de patología. Después de este procedimiento, se pueden realizar cálculos de autoopotipado y análisis espacial para analizar más a fondo las interacciones de celda a célula. Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores exploren el patrón espacial de las células y el tejido intacto, mejorando nuestra comprensión del microambiente inmune tumoral.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses para inmunomodulación Tumor objetivo: diseño y evaluación Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Manual Construction of a Tissue Microarray using the Tape Method and a Handheld Microarrayer

Construcción manual de un microarray de tejido utilizando el método de cinta y un microarrayer de mano

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Detección simultánea basada en imágenes y citometría de flujo de múltiples marcadores de senescencia fluorescente en células cancerosas senescentes inducidas por terapia

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

Optimización ATAC-SEQ para la investigación epigenética del cáncer

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

Optimización de los parámetros de rendimiento del ensayo de longitud de telómeros TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

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Multiplex Immunofluorescence and Spatial Image Analysis of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE 

Inmunofluorescencia múltiple combinada con análisis de imágenes espaciales para la evaluación clínica y biológica del microambiente tumoral

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending ...

Deciphering Tumor Microenvironment Using mIHC in Lung Squamous Carcinoma

Multiplex Immunohistochemistry Staining for Paraffin-embedded Lung Cancer Tissue

Author Spotlight: Enhancing Multicolor Fluorescence Localization in Lung Carcinoma Sample

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been ...

In Situ Immunohistochemical Detection of Immune Cell Markers in Cancer Tissues

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry

Author Spotlight: Efficient Detection of Immune Cell-Infiltration in Cancer Tissues Using Fluorescent Immunohistochemistry

Inmunohistoquímica fluorescente cíclica multiplex

The tumor microenvironment involves interactions between host cells, tumor cells, immune cells, stromal cells, and vasculature. Characterizing and ...

Optimizing Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Staining for Lung Cancer Tissue Samples to Address Autofluorescence Issues

Optimización de la tinción de inmunohistoquímica múltiple (mIHC) para muestras de tejido de cáncer de pulmón para abordar problemas de autofluorescencia