Name: optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry
Uploaded: 2019-07-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry at JoVE.com

Yazarlar, Perkin Elmer daha önce Ed Stack teşekkür etmek istiyorum, kurulum ve orijinal Multiplex boyama optimizasyonu ile onun yardımı için. Yazarlar da analiz yazılımı kullanarak ipuçları için Akoya Biosciences gelen Kristen Schmidt teşekkür etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen araştırma, Ulusal Kanser Sağlık Enstitüleri tarafından ödül numarası P30CA046592, K08CA201581 (TLF), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (MPM), RSG1417301CSM (MPM), R01CA19807403 (MPM), U01CA22414501 (MPM, HC) altında desteklenmektedir. CA170568 (HC). İçerik sadece yazarlar sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmez. Ek destek Jeffery A. Colby Colon Cancer ve Tom Liu Memorial araştırma fonları tarafından sağlandı.

Tüm çalışmalar Michigan Üniversitesi 'nin iç İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. birincil antikorlar ve slayt hazırlama optimizasyonu
<ol><li>Konvansiyonel ıHC kullanarak Multiplex için antikor ideal konsantrasyonu belirleyin.<ol>
<li>Multiplex için antikorları manuel konvansiyonel immünhistokimya (ıHC)13ile test edin.</li>
<li>Her antikor için bol hücre tipine sahip belirli dokulara, CD3 antikor testi için Bademcik dokusu kullanma gibi t...

<ol>
	<li>Lazarus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+phenotypic+immune+profiling+of+metastatic+colon+cancer.">Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer.</a> JCI Insight. 3 (22), (2018).</li><li>Barua, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Spatial+Analysis+Platform+for+Discovery+of+Immunological+Interactions+Predictive+of+Low-Grade+to+High-Grade+Transition+of+Pancreatic+Intraductal+Papillary+Mucinous+Neoplasms.">A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms.</a> Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).</li><li>Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+reveals+hyper+active+TGF-beta+signaling+in+colorectal+cancer.">Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).</li><li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer.">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nature Communications. 8, 15095 (2017).</li><li>Steele, K. E., Brown, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Immunohistochemistry+for+Image+Analysis+of+Tertiary+Lymphoid+Structures+in+Cancer.">Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer.</a> Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).</li><li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight-Color+Multiplex+Immunohistochemistry+for+Simultaneous+Detection+of+Multiple+Immune+Checkpoint+Molecules+within+the+Tumor+Microenvironment.">Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment.</a> The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li><li>Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+immunofluorescence+procedures+for+protein+analysis.">Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis.</a> Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).</li><li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+basic+principles+and+applications.">Flow cytometry: basic principles and applications.</a> Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+5-plex+fluorescent+immunohistochemistry+with+tyramide+signal+amplification+and+same+species+antibodies.">Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies.</a> Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).</li><li>Phenoptics Research Solutions. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Perkin Elmer Manual. , 32 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2014).</li><li>Carey, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+analysis+reveals+a+PD-L1-associated+microenvironmental+niche+for+Reed-Sternberg+cells+in+Hodgkin+lymphoma.">Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma.</a> Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).</li></ol>

Katı tümör biyopsisi ve cerrahi rezeksiyondan gelen bozulmamış doku örnekleri, hasta prognoz yanı sıra hastalık analizi için önemli tanı ve öngörü araçları olarak kalır. Multiplex floresan immünhistokimya (mfIHC), immünhistokimya (ıHC), immünofluoresesans (IF) ve akış sitometri avantajlarını birleştiren yeni bir tekniktir. Bir doku ortamında hücre-hücre düzenlemeleri değerlendirilmesi için izin var situ hücre prob önceki yöntemleri8, ancak, probed olabilir epite...

Bozulmamış bir tümör mikroortamının (TME) görselleştirilmesi, sadece katı malignitelerde hücresel infiltrasyonu değil, hücrenin hücre etkileşimlerini de değerlendirmede esastır. Multiplex floresan immünhistokimya (mfihc) kanser ve ilişkili hastalıklar çalışmada hücrelerin Multi-antijen fenotiplemeyi için etkili bir araç olarak ortaya çıkmıştır1,2,3,4, 5,6,7. Bu, büyük veri setleri analiz etmek için tasarlanmış yeni yazılım ve programlar ile birlikte, hücreler1,2,4arasındaki karmaşık etkileşimlerin gözlem sağlar. Veri toplama faktörü sınırlama oranı genellikle analiz öncesinde lekeli doku kalitesidir.
TME 'deki fenotip hücrelerinde kullanılan önceki teknikler arasında immunohistokimya (IHC), immünofluoresesans (IF) ve akış sitometri bulunmaktadır ve bu da önemli sınırlamalar sunar. IHC, en sık bir antikor tarafından lekelenmeden önce deparafsonize edilmiş ve rehydrated olan formalin sabit parafin gömülü (FFPE) doku bölümlerini kullanır. Bir horserpu peroksidaz (HRP) bağlı ikincil antikor ve kimyasal reaksiyon kullanımı tek bir antijenik epitopu görselleştirme sağlar8. IHC güvenilir ve birlikte çalışması kolay FFPE doku üzerinde gerçekleştirilen, görünür ışık spektrumuna sınırlamalar sadece bir veya iki işaretçileri güvenilir seçkin ve antijenlerin kolokalizasyonu oldukça zor8anlamına gelir. Kullanılabilir işaretçileri genişletmek için bir yol ve bu nedenle tek bir bölümde probed edilebilir antijenler görsel spektrumunun daha geniş bir yelpazede kullanımı için izin floresans değiştirmek için. Eğer, dondurulmuş veya FFPE doku slaytlar üzerine transfer edilir ve çeşitli fluorophores konjuyum kullanılan antikorlar. Bu probed edilebilir antijenler sayısını artırır iken, birkaç önemli sınırlamalar vardır. İlk olarak, her antikor genellikle sadece bir fluorophore bağlı olduğundan, parlaklık genellikle doku autofluorescence aşmak için yeterince güçlü değildir. Bu nedenle, çoğu If saklamak için pahalı ve çalışmak zor dondurulmuş doku üzerinde gerçekleştirilir. Floresan etiketleri sınırlı sayıda spektral örtüşme ve çapraz türler reaktivite özellikle olmayan konjued antikorlar kullanıldığında nedeniyle kullanım için kullanılabilir. Tek hücreli süspansiyon içine taze doku işleme ve floresan antikorlar ile etiketleme oluşan akış sitometri, onlarca yıldır immünofenotipleme için altın standart olmuştur9,10. Akış cytometri bir yararı türleri çapraz reaktivite için endişe olmadan çoklu antikorlar etiket yeteneği en konjut olduğu gibi. Hücreler bir makine ve insan gözleri değil "görselleştirilen" Çünkü, çok daha fazla fluorophores mevcuttur ama bu bir maliyet ile birlikte gelir. Tazminat, yanlış pozitif ve negatif nüfus üreten sonuçları önemli ölçüde değiştirebilir el ile yapılmalıdır. Akış sitometri en önemli sınırlama, doku mimarisi ve daha sonra tüm uzamsal bilgiler tek hücreler süspansiyon gereksinimi ile kaybolur.
Yeni yazılım ile birlikte otomatik bir floresan mikroskop kullanan Multiplex floresan immünhistokimya (mfIHC), ıFC, IF ve akış sitometri avantajlarını, sinyal amplifikasyonu ile çok antijen doku boyama ve tazminat gerek kalmadan uzamsal ilişkilerin saklanması. FFPE doku şarj slaytlar üzerine yerleştirilir, antijen alımı sonra, ıFC benzer bir HRP kimyasal etiketi ile ikincil bir antikor takip faiz hedef antijen birincil antikor uygulama bir yuvarlak geçmesi. İkincil antikor yerleştirdikten sonra, bir HRP spesifik reaksiyon bir fluorophore rastlamak ilgi epitopu için bağlayıcı bir sonuç11. Doku etiketlendikten sonra, slaytlar Isıtma başka bir turda sadece floresan etiketi doku epitopu bağlı bırakarak önceden uygulanan birincil ve ikincil antikor kompleksi kaldırma tamamlandı11. Bu, herhangi bir türün birden fazla antikorlarının Cross-reactivity11,12için endişe olmadan yeniden uygulanması için izin verir. Çoklu floresan boyalar manuel telafisi için herhangi bir ihtiyacı en aza indirmek için, bir nükleer sayaç leke dahil olmak üzere küçük spektral örtüşme ile fluorophores bir koleksiyon mfIHC tamamlamak için kullanılır. Ffpe doku ile karşılaşılan otofloresans dikkate almak için, yazılım, florophore aşağıdaki antijen spesifik floresans gücü nedeniyle mümkün olan boş bir slayttan bir görüntü kullanarak son görüntüden otofloresans çıkarır sinyal amplifikasyon. Büyük veri kümeleri için tasarlanmış yeni programları kullanarak, hücre konumları tespit ve uzamsal bağlam1,2,4için analiz edilebilir. Bu tekniğin en önemli sınırlaması optimizasyon zamanidir. Deneysel tasarım ve boyama ve görüntüleme stratejisi talimatlarını içeren ayrıntılı bir metodoloji burada bulunur. mfIHC Şu anda manuel tekniği kullanarak bozulmamış FFPE doku hücre-hücre etkileşimlerin uzamsal bağlamı daha iyi anlamak istiyorum optimize edilmiş otomatik boyama sistemi yok laboratuvarlar için yararlı olacaktır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>HC8001GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>HC10001GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>HC11001GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS135783</td>
			<td>inForm version 2.3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36961</td>
			<td>ProLong Diamond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td>Bloxall</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent diluent</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>ARD1A01EA</td>
			<td>Opal TSA diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 520</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1487001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 540</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1494001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 570</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1488001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 620</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1495001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 650</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1496001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 690</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1497001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore DAPI</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1490</td>
			<td>3 drops in TBST or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat resistant box</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>25608-904</td>
			<td>Plastic slide box-green</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified Chamber</td>
			<td>Ibi Scientific</td>
			<td>AT-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>FisherBiotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>ImmEdge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS140089</td>
			<td>Mantra quantitative pathology workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>NN-A661S</td>
			<td>with inverter technology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 6 antigen retrieval buffer</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>AR600</td>
			<td>AR6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 9 antigen retrieval buffer</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>AR900</td>
			<td>AR9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide box</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>25608-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9070936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-800</td>
			<td>Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody CD163</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>NCL-LCD163</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody CD3</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0452</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody CD8</td>
			<td>Spring Bio</td>
			<td>M5390</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody FOXP3</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M3515</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody pancytokeratin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>12653</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody PD-L1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>13684</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>ARH1001EA</td>
			<td>Opal polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide stain set</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>6254001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-012-CM</td>
			<td>TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical slide rack</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50-294-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry

Hücre infiltrasyonu ve mekansal organizasyon analizi için bozulmamış doku mikroçevre değerlendirilmesi hastalık süreçlerinin karmaşıklığını anlamakta esastır. Geçmişte kullanılan prensip teknikleri, 1 ile 4 işaretçileri arasında zaman içinde bir anlık görüntü olarak hücrelerin görselleştirilmesini sağlayan immünhistokimya (ıHC) ve immünofluoresesans (IF) içerir. Her iki teknik de kötü antijenik hedefler ve çapraz türler reaktivite ile ilgili sınırlamalar boyama zorluk dahil eksiklikleri var. IHC güvenilir ve reproducible, ancak kimyasal ve görünür ışık spektrumuna güven doğası sadece birkaç işaretçileri kullanılmak üzere sağlar ve Co-yerelleştirme zorlu yapar. If kullanımı potansiyel işaretçileri genişletir, ancak genellikle formalin fikreasyon aşağıdaki geniş doku otofloresans nedeniyle dondurulmuş doku dayanır. Akış cytometri, birden fazla epiton eşzamanlı etiketleme sağlayan bir teknik, IF ve IFC eksiklikleri birçok CPAP, ancak, tek bir hücre süspansiyon olarak hücreleri incelemek için ihtiyaç önemli biyolojik atarak hücrelerin uzamsal bağlamı kaybeder Ilişki. Multiplex floresan immünhistokimya (mfihc) Bu teknolojiler, genel mikroçevre mimarisi ve mekansal koruyarak formalin sabit parafin gömülü (ffpe) doku Multi-epitope hücresel fenotiplemeyi için izin köprüler bozulmamış doku içinde hücrelerin ilişkisi. Yüksek floresan yoğunluğu fluorophores bu kovalently doku epitopu bağ türü belirli çapraz reaktivite ikincil antikorlar endişe etmeden primer antikorların birden fazla uygulama sağlar. Bu teknoloji hastalığın çalışması için güvenilir ve doğru görüntüler üretmek için kanıtlanmış olmasına rağmen, yararlı bir mfIHC boyama stratejisi oluşturma süreci zaman alıcı ve kapsamlı optimizasyon ve tasarım nedeniyle titiz olabilir. Doğru hücresel etkileşimleri temsil eden ve manuel analiz için optimizasyon süresini azaltmak için sağlam görüntüler yapmak amacıyla, burada sunulan slayt hazırlama, antikorlar, Multiplex tasarım yanı sıra hataları optimize etmek için Yöntemler genellikle boyama işlemi sırasında karşılaşılan.

7-renkli Multiplex assay alma genel süreci tekrarlayan bir desen izler. Şekil 1 , bir grafiksel formunda işlemi açıklar. Bir kez slaytlar kesilmiş ve kurutulur veya laboratuvardan alınır ve 1 h için 60 °c ' de bir hibridizasyon fırında pişmiş, daha sonra deparafinizasyonda ve rehidrasyon devam, yeniden antijen alma tarafından takip formalin slaytlar düzeltin. Her yuvarlak çoğullama antikor kaldırma (Şekil 1) üzerinde antijen alma ve bitirir ...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry at JoVE.com

Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry

Multiplex floresan immünhistokimya, bozulmamış formalin-sabit, parafin katıştırılmış (FFPE) dokusu içinde birden fazla hücre türlerinin görselleştirilmesini sağlayan gelişmekte olan bir teknolojidir. Sunulan başarılı bir 7-renk Multiplex antikor ve reaktifler optimize etmek için talimatlar, slaytlar, tasarım ve ortak sorunları önlemek için ipuçları hazırlanması sağlamak için yönergeler vardır.

Manuel Multiplex floresan Immünhistokimya 'da optimizasyon, tasarım ve kaçınarak tuzaklar

Microenvironment evaluation of intact tissue for analysis of cell infiltration and spatial organization are essential in understanding the complexity of ...

Multipleks floresan immünohistokimya birden fazla hücre tipini ve konumlarını bozulmamış formalin-sabit parafin gömülü dokuda tanımlar, bu da sadece hücre tanımlaması için değil, hücreden hücremekansal analize de olanak sağlar. Bu manuel tekniğin en büyük avantajı çapraz reaktivite olmadan aynı türün birden fazla antikor kullanımıdır. Bu teknik tümör mikroortamında bağışıklık ve kanser hücrelerinin etkileşimleri içine derinlemesine bir görünüm sağlar.Bu tekniği ilk kez denerken, yaklaşık 3-4 gün boyama ya da işlem sırasında her adımı tamamen takip edin. Boyama işlemi ve multipleks tasarımı nın daha zayıf bir yöntemi, yaygın ve beklenen tuzakları azaltmak için çok önemlidir. Slaytları ayırarak ve yeniden sudinerek başlayın.Doku yan ile hibridizasyon fırında onları lay ve bir saat boyunca 60 derece santigrat onları pişirin. Slaytları fırından alın ve dikey bir kaydırakta 5 ila 10 dakika soğumasını bekleyin. Daha sonra slaytları üç kez ksilen ve bir kez %100 etanol, %95 etanol ve %70 etanol ile 10'şar dakika boyunca tedavi etmek için bir slayt boyama seti kullanın.Slaytrafını deiyonize suyla yıkayın ve daha sonra 30 dakika boyunca nötr arabelleğe aldanarak slaytları düzeltin. İki dakika su ile slaytlar yıkayın ve antijen alma ile devam edin. Slayt rafını pH 6.0 veya pH 9.0 antijen alma tamponu yla dolu ısıya dayanıklı bir kutuya yerleştirin.Kutunun üzerini plastik ambalajla kapatın ve lastik bantla sabitleyin. Kutuyu dönen plakanın kenarına bir inverter donanımlı mikrodalgaya yerleştirin ve slaytları %100 güçte 45 saniye ısıtın ve ardından %20 güçte 15 dakika. Slaytlar microwaving sonra 15-20 dakika soğumasını bekleyin.Bu arada, antikorlar ve floroforların çalışma çözümlerini hazırlayın. TBST veya 1X PBS 50 mililitre sığır serum albumen granül0 0,5 gram eriterek birincil antikor dilüent hazırlayın. Her birincil antikor çalışma çözeltisini önceden belirlenmiş bir konsantrasyona seyreltin.Florofor seyreltici her florofor seyreltmek bir ila 100 konsantrasyonda. Boyama nın son gününde, bir mililitre TBST'ye üç damla DAPI ekleyerek DAPI çalışma çözümünü hazırlayın. Slaytlar soğuduktan sonra mikrodalgadan çıkarın ve plastik ambalajı çıkarın.İki dakika deiyonize su ile yıkayın ve ardından TBST ile iki dakikalık bir yıkama. Yıkamadan sonra, hassas bir görev sil ve hidrofobik bariyer kalem ile doku dışında iz ile doku etrafında slayt kuru, doku dokunmamaya dikkat veya kurumasını bekleyin. Her slaytı nemlendirici haznesine yerleştirin ve dokuya yaklaşık dört damla bloklama çözeltisi ekleyin.Daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca slaytlar kuluçka ve birincil antikor uygulaması ile devam edin. Kağıt havlu yığınının üzerindeki slaydın yan tarafına dokunarak her slayttan engelleme çözümünün çıkarılmasını ve kalan çözümü kaldırmak için hassas bir görev silme kullanın. Kaydırağı nemlendirilmiş odaya geri yerleştirin, çalışan birincil antikor yaklaşık 200 mikrolitre ekleyin ve bir saat kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, slaytları tbst'ye iki dakika boyunca batırarak üç kez yıkayın. Her slayttan kalan TBST kapalı Dab ve ikincil antikor yaklaşık üç ila dört damla uygulayın. 10 dakika boyunca nemlendirilmiş odada slaytlar kuluçka.Slaytları TBST ile tekrar yıkayın ve florofor çalışma çözeltisinin yaklaşık 100 mikrolitresini uygulayın. Slaytları nemli odaya geri verin ve 10 dakika kuluçkaya yatırın. TBST yıkama tekrarlayın ve daha sonra antikorları kaldırmak için el yazması yönergelerine göre slaytlar mikrodalga.Bu çok günlük boyama işlemi sırasında hatırlanması gereken önemli bir şey microwaving adım sonra durdurma ve antijen alma tampon gecede slaytlar bırakarak, doku ve leke bütünlüğünü sağlamak. Antijen alma solüsyonu ile son antikor uygulamasını çıkarın ve kayma başına iki dakika boyunca TBST ardından deiyonize su ile slaytları yıkayın. Antikor flurophore çiftleri geri kalanı için boyama adımları tekrarlayın ve sonra DAPI uygulaması ile devam edin.Her slayta yaklaşık 150 mikrolitre çalışan DAPI çözeltisi uygulayın ve nemli haznede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, slaytları TBST ile yaklaşık 30 saniye yıkayın ve kapak fişlerini monte edin. Montaj ortamı kuruduktan sonra, emniyete almak için kapağın dört köşesine açık tırnak cilası uygulayın.Monopleksi analiz etmek için, mikroskoptaki slaytları, odaklanmak için DAPI kullanarak 250 milisaniyelik pozlama ile görüntüleyin. Lekeli işaretleyicinin floresan yoğunluğuna bakarak her monopleks slaytı değerlendirin ve bu yoğunluğu arka planla karşılaştırın. Lekeli işaretçi yoğunluğu arka plandan en az beş kat daha yüksekse son multipleksteki slayt konumunu kullanın.Multipleks boyama, her antikor için uygun sırayı seçin ve bir antikor için her florofor atayın. Daha önce açıklandığı gibi multipleks boyama ile devam edin ve primer antikor, florofor veya DAPI yerine antikor dilüent, florofor dilüent ve TBST alır boş bir slayt hazırlamak. Mikroskopüzerindeki çoklayıcıyı görüntülenmeye hazır olduğunuzda, pozlamayı tüm kanallar için 250 milisaniyeye ayarlayın ve odaklanmak için DAPI kullanarak her görüntüyü yakalayın.Daha sonra her çokluk floresan yanlış renk ve patoloji görünümü ile her belirteç özgüllüğünü teyit edecek değerlendirmek için analiz yazılımı kullanın. Multipleks testin inbaşarısını sağlamak için, her antikor un sırasını belirlemek için monopleks bir test yapılmalıdır. Örneğin, Foxp3 dizinin üçüncü konumundayken, CD3 ile spesifik ve sağlam boyama ve kolokalizasyon gösterilmiştir.Buna karşılık, Foxp3 ilk konumda olduğunda, Foxp3 nonspesifik boyama oluşur. Kaydırakların çoğunda kırmızının grenli ve verimli alanları bulunur ve bu alanların floresan yoğunluğu düşüktür. Bu tahlilde bir diğer önemli adım hücre tanımlama ve daha fazla analiz için temel olan DEPI karşı boyama vardır.Çalışma ve çalışmayan DAPI ile görüntüler arasında net bir kontrast görülebilir. Multipleks tarar için, güzel kompozit görüntüler her zaman doğru bir leke yansıtmaz. CD3 görselleştirilmiş ve spesifik boyama gösterirken, CD163'ün patoloji parlak alan görünümü antikorun spesifik olmadığını kanıtlamaktadır.Optimal multipleks görüntü kompozit görüntüde belirli boyama gösterir ve CD3 ve CD163 özgüllüğü patoloji brightfield görünümü ile doğrulanır. Bu yordamı takiben hücre ile hücre etkileşimlerini daha fazla analiz etmek için kendi kendini fenotipleme ve mekansal analiz hesaplamaları yapılabilir. Bu teknik, araştırmacıların hücrelerin ve bozulmamış dokunun mekansal desenlerini keşfetmelerinin önünü açarak tümör immün mikroçevresini daha iyi anlamamızı sağladı.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirusler Immunomodulation tümör hedefli için: tasarım ve değerlendirme Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Manual Construction of a Tissue Microarray using the Tape Method and a Handheld Microarrayer

Bant Yöntemi ve El Tipi Mikrodizileyici Kullanılarak Doku Mikrodizisinin Manuel Yapımı

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

Kanser Epigenetiği Araştırmaları için ATAC-Seq Optimizasyonu

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay (Video) | JoVE 

TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

Multiplex Immunofluorescence and Spatial Image Analysis of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE 

Multipleks İmmünofloresan, Tümör Mikroçevresinin Klinik ve Biyolojik Değerlendirmesi için Uzamsal Görüntü Analizi ile Kombine Edildi

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending ...

Deciphering Tumor Microenvironment Using mIHC in Lung Squamous Carcinoma

Multiplex Immunohistochemistry Staining for Paraffin-embedded Lung Cancer Tissue

Author Spotlight: Enhancing Multicolor Fluorescence Localization in Lung Carcinoma Sample

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been ...