Name: evaluation of fertilization state by tracing sperm nuclear morphology in arabidopsis double fertilization
Uploaded: 2019-08-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Japan Society for fremme af Science KAKENHI Grant (JP17H05832 til T. I.) og ved finansiering fra det strategiske prioriterede forsknings fremmende program på fytokemiske plante molekyle videnskaber, Chiba University (Japan).

1. kunstig bestøvning
Bemærk: Før du starter processen, kræves et par 5-pincet.
<ol><li>Vokse en. thaliana (Col-0) ved 22 °c under en 16-h lys/8-h mørk cyklus i et vækstkammer. Bemærk: Skær og fjern den første udviklede blomst stilk med en saks for at fremme udviklingen af axillær knopper. Kraftigt voksende planter (2-3 uger efter opskæring af den første stilk; Plant højde ca. 25 cm) er egnet til analyse.</li>
	<li>Til emasculate, F...

<ol>
	<li>Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+dialogs+in+green+lineages.">Gamete dialogs in green lineages.</a> Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).</li><li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants.">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Current Biology. 26, R125-R139 (2016).</li><li>Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENERATIVE+CELL+SPECIFIC+1+is+essential+for+angiosperm+fertilization.">GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization.</a> Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).</li><li>von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+HAP2+(GCS1)+is+a+sperm-specific+gene+required+for+pollen+tube+guidance+and+fertilization.">Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization.</a> Development. 133, 4761-4769 (2006).</li><li>Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+attachment+requires+GEX2+for+successful+fertilization+in+Arabidopsis.">Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24, 170-175 (2014).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+male+gamete+membrane+protein+DMP9/DAU2+is+required+for+double+fertilization+in+flowering+plants.">The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants.</a> Development. 145, dev170076 (2018).</li><li>Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+dynamics+of+HISTONE3+variants+between+the+two+fertilization+products+in+plants.">Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants.</a> Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+recovery+system+is+dependent+on+the+number+of+pollen+grains+for+efficient+reproduction+in+plants.">Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants.</a> Plant Signaling &amp; Behavior. 8, e23690 (2013).</li><li>Kasahara, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+recovery+after+defective+sperm+cell+release+in+Arabidopsis.">Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis.</a> Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).</li><li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana.">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21, 497-502 (2011).</li><li>Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gamete+membrane+dynamics+during+double+fertilization+of+Arabidopsis.">Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis.</a> Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).</li></ol>

HTR10-mrfp-etiketter faderlige kromatin (dvs. visualiserer sædcelle kerner), og dynamikken i dobbelt befrugtning er blevet rapporteret7. Umiddelbart efter frigivelse fra et pollen rør, er HTR10-mRFP-mærket sædkerner stadig kondenseret. Men hver af sædkerner er dekomprimeret ved sammenlægning med en befrugtet kvindelig gamet kerne i efter tre til fire timer efter gamet membran fusion7. Ikke-befrugtede sædceller forbliver kondenserede, som vist i et embryon, hvor g...

Blomstrende planter producerer frø gennem dobbelt befrugtning, en proces, der er direkte kontrolleret af interaktioner mellem proteiner lokaliseret på gamet plasma membran1,2. Blomstrende plante mandlige gameter, et par sædceller, udvikle i pollen. Et pollen rør, der vokser efter bestøvning leverer et par sædceller til kvindelige gameter, en ægcelle og en central celle, der udvikler sig i en embryo SAC. Efter det mandlige og kvindelige mælke herfra mødes, fremmer proteiner på gamet overfladen genkendelse, fastgørelse og fusion for at fuldføre dobbelt befrugtning. I tidligere undersøgelser blev de mandlige gamet membran proteiner generative celle specifikke 1 (GCS1)/hapless2 (HAP2)3,4 og gamet udtrykt 2 (GEX2)5 identificeret som befrugtning regulatorer involveret i gamet fusion og vedhæftet fil. Vi har for nylig identificeret en mandlig gamet-specifikke membran protein, DUF679 Domain membran protein 9 (DMP9), som en befrugtning regulator involveret i gamet interaktion. Vi konstaterede, at et fald i DMP9 ekspression resulterer i signifikant hæmning af ægcelle befrugtning under dobbelt befrugtning i en. thaliana6.
Som dobbelt gødskning forekommer i en embryo SAC, som er indlejret i en ovule, der er yderligere pakket med ovarie væv, er det vanskeligt at observere og analysere de stater, dobbelt gødskning processer. Af denne grund er der stadig mange uklare punkter, der hindrer en fuldstændig forståelse af hele mekanismen for dobbelt befrugtning kontrol. Etableringen af observations teknikker til at spore mælke herfra opførsel under dobbelt befrugtning under in vivo-betingelser er uundværlig for den funktionelle analyse af potentielle kandidater til gødskning regulerende myndigheder. Nylige undersøgelser har givet markør linjer, hvor gamet subcellulære strukturer er mærket med fluorescerende proteiner. I denne artikel viser vi en enkel og hurtig protokol til observation af dobbelt befrugtning, som er forekommet i et embryon, der er afledt af kunstigt bestøverede pisken. Brug sædcelle Nucleus markør linje HTR10-mrfp7, gødskning tilstand af hver kvindelig gamet kan blive diskrimineret på grundlag af sædceller nukleare signal morfologi. Vores protokol med fokus på en sådan morfologisk ændring af sædkerner ved befrugtning kan effektivt opnå en tilstrækkelig mængde data til statistisk bevis. En DMP9-Knockdown-linje med HTR10-mrfp-baggrund (DMP9Kd/HTR10-mrfp) blev brugt som mandlige planter til at vise et enkelt befrugtnings mønster. Protokollen er også velegnet til funktionel analyse af andre gødskning regulerende myndigheder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BX51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>C018181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP9KD/HTR10-mRFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background 
			Takahashi et al. (2018)6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>NW-15S</td>
			<td>15 mm width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP72</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Degital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Vigor</td>
			<td></td>
			<td>Any No. 5 forceps are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Nihonika</td>
			<td>LPH-411PFQDT-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTR10-mRFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background 
			Ingouff et al. (2007)7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td>27 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>S9443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-MRFPHQ</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPlanFL N 40x</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Objective lens (NA 1.3), oil-immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPlanSApo 20x</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Objective lens (NA0.75), dry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of fertilization state by tracing sperm nuclear morphology in arabidopsis double fertilization

Blomstrende planter har en unik seksuel reproduktion system kaldet ' dobbelt befrugtning ', hvor hver af sædcellerne præcist sikringer med en ægcelle eller en central celle. Således to uafhængige befrugtning begivenheder finder sted næsten samtidig. Den befrugtede ægcelle og central cellen udvikler sig til henholdsvis zygote og endosperm. Derfor er præcis kontrol af dobbelt befrugtning afgørende for den efterfølgende frøudvikling. Dobbelt befrugtning forekommer i den kvindelige gametofhyte (embryo SAC), som er dybt skjult og dækket med tyk ovule og ovarie væv. Dette tissuevæv konstruktion gør observation og analyse af dobbelt befrugtning ganske vanskeligt og har skabt den nuværende situation, hvor mange spørgsmål vedrørende mekanismen for dobbelt befrugtning forbliver ubesvarede. For den funktionelle evaluering af en potentiel kandidat til befrugtning regulator, fænotypiske analyse af befrugtning er vigtig. At bedømme færdiggørelsen af befrugtning i Arabidopsis thaliana, formerne af fluorescens signaler mærkning sædkerner anvendes som indikatorer. En sædcelle, der undlader at gøde, er indikeret med et kondenseret fluorescens signal uden for de kvindelige kønsceller, hvorimod en sædcelle, der med held befrugte, er indikeret af et dekoncentreret signal på grund af efter med de kvindelige gameter ' Nucleus. Den beskrevne metode giver et værktøj til at bestemme vellykket eller mislykket befrugtning under in vivo betingelser.

Ægler fra en fisk, der er pollineret med DMP9Kd/HTR10-mrfp , blev indsamlet ved 7-8 Hap og observeret.
De fleste æganlæggene indeholdt to dekomprimeret mrfp-mærkede sædkerner ved ægcellen (micropylar side) og central celle (charazal end side) Nucleus positioner (figur 3a), hvilket indikerer vellykket dobbelt befrugtning. Desuden blev der observeret ægler indeholdende en d...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization at JoVE.com

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Vi demonstrerer en metode til at bestemme vellykket eller mislykket befrugtning på grundlag af sædcelle morfologi i Arabidopsis dobbelt befrugtning ved hjælp af et epifluorescens mikroskop.

Evaluering af gødskning tilstand ved at spore sperm nuklear morfologi i Arabidopsis dobbelt befrugtning

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Denne protokol giver mulighed for at vurdere inddragelsen af en bestemt faktor i dobbelt befrugtning af Arabidopsis. Befrugtning status kan bedømmes ved morfologi af sædkerner et overblik, så hurtig opnåelse af data til statistisk analyse er mulig. Denne metode er specifik for vurdering for befrugtning fænotype i Arabidopsis.Der er stadig ukendt befrugtning regulatorer, selv om i Arabidopsis. Denne metode vil være nyttig til funktionel analyse af fremtidige ukendte befrugtningsfaktorer. At mestre dygtighed hurtig og intakt håndtering af æg er vigtige for succesen af denne analyse.Til at begynde, vokse Arabidopsis thaliana ved 22 grader Celsius under en 16-timers lys og otte-timers mørk cyklus i et vækstkammer. Skær og fjern den første udviklede blomst stilk med en saks til at fremme udviklingen af aksillære knopper. To til tre uger efter afskæring af den første stilk, måle anlæggets højde.Planter med højde over 25 centimeter betragtes som kraftigt voksende planter og er egnet til analyse. At kastrere, kigge efter knopper på trin 11 med stumper af kronblade set øverst. Brug en nummer fem kraftbefædre til at fjerne sepal, kronblad, og støvdrager af blomsterknopper.15 til 18 timer efter emasculation, tage støvdragen af en DMP9-knockdown linje med baggrund af HTR10-mRFP blomst på trin 13 ved at klemme glødetråden med snævring. At bestøve, forsigtigt klappe stigmatisering af en kastreret pistil flere gange med en dehiscent anther. Syv til otte timer efter bestøvning, indsamle støvveje og placere den på dobbeltsidet tape.Tryk derefter forsigtigt med pincet for at fastgøre støvveje på båndet. Under et dissekerende mikroskop afskæres æggestokkenes øvre og nedre ende ved hjælp af en injektionsnål. Bevæg spidsen af injektionsnålen for at skære æggestokkene gennem begge sider af replummen.Skær forsigtigt for ikke at adskille funiculus og sendekanalen. Evert æggestokkene væggen. Klem bunden af den skillevæg, som æg er tilsluttet, og løft den forsigtigt op med scener.Overfør æggerøret i en dråbe vand på et glasglas, og dæk forsigtigt med et dækglas til observation under et fluorescensmikroskop. På et epifluorescensmikroskop udstyret med en fluorescensfilterterning skal objektivet justeres til 20x eller 40x. Anskaf billeder af æg, der indeholder sædkerner mærket med mRFP.Bekræft antallet af mRFP-mærkede sædkerner i en fostersæk. Bekræft formen og placeringen af hver mRFP-mærket sædkerne i en fostersæk. I denne undersøgelse, befrugtning fænotyper blev bedømt af sperm nukleare signal morfologi i ægløsning.De fleste æggevarier indeholdt to dekondenserede mRFP-mærkede sædkerner på ægcellen micropylar side og centrale celle charazal endeside. Dette indikerer vellykket dobbelt befrugtning. Desuden blev der observeret ægbægere, der indeholder en dekondenseret mRFP-mærket sædkerne ved den centrale cellekerne plus en kondenseret mRFP-mærket sædkerne uden for ægcellen, hvilket indikerer enkelt befrugtning.I tilfælde af mislykket dobbeltbefrugtning blev to kondenserede mRFP-mærkede sædkerner observeret ved ægcellens og den centrale celles grænse. I analysen ved hjælp af DMP9-knockdown linje med baggrund af HTR10-mRFP pollen, æg, der indeholder en enkelt kondenseret mRFP-mærket sædkerne eller tre eller flere mRFP-mærket sædkerner blev sjældent observeret. Kombinere med brugen af kvindelige markør linjer, mere præcis befrugtning status kan analyseres.For eksempel kan befrugtning status på efter gamete fusion og før karyogamy bedømmes. Ja, befrugtningsprocessen er opdelt i flere trin. De spørgsmål, som hver befrugtning regulator involveret i, hvor trin kan besvares med denne forbedrede metode.Det ville give dybere indsigt i den seksuelle reproduktion af planten.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation og<em&gt; In vitro</em&gt; Modning af<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oocytter, efterfulgt af ICSI, for at studere fosterudviklingen

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Lev Konfokal Imaging af Udvikling Arabidopsis Blomster

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Øresvinet delfiner (Tursiops truncatus) sædcellerne: indsamling, kryopræservering og heterolog In Vitro fertilisering

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

Analyse af kromosomsegregation, histonacetylering og spindelmorfologi i hesteococytter

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

En metode til kendetegner embryogenese i Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle billeddannelse af kromosom Segregation under mitosen

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Sporing genekspression gennem påvisning af β-galactosidase aktivitet i hele musen embryoner

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Fluorimetri teknikker til vurdering af Sperm membraner

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

En lagdelt monteringsmetode til forlænget tidsforskudt Konfokal mikroskopi af hele Zebrafish-embryoner

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonal genetisk sporing ved hjælp af Confetti-musen til at studere mineraliseret væv

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...