Name: evaluation of fertilization state by tracing sperm nuclear morphology in arabidopsis double fertilization
Uploaded: 2019-08-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Japan Society voor de promotie van Science KAKENHI Grant (JP17H05832 to T. I.) en door financiering van het strategisch prioriteits onderzoek promotieprogramma voor fytochemische planten moleculaire wetenschappen, Universiteit van Chiba (Japan).

1. kunstmatige bestuiving
Opmerking: Voor aanvang van het proces is een paar No. 5 Tang nodig.
<ol><li>Kweek a. thaliana (Col-0) bij 22 °c onder een 16-h licht/8-h donkere cyclus in een groei kamer. Opmerking: Snijd en verwijder de eerste ontwikkelde bloemsteel met een schaar ter bevordering van de ontwikkeling van de oksel toppen. Sterk groeiende planten (2-3 weken na het snijden van de eerste Steel; plant hoogte ongeveer 25 cm) zijn geschikt v...

<ol>
	<li>Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+dialogs+in+green+lineages.">Gamete dialogs in green lineages.</a> Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).</li><li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants.">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Current Biology. 26, R125-R139 (2016).</li><li>Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENERATIVE+CELL+SPECIFIC+1+is+essential+for+angiosperm+fertilization.">GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization.</a> Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).</li><li>von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+HAP2+(GCS1)+is+a+sperm-specific+gene+required+for+pollen+tube+guidance+and+fertilization.">Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization.</a> Development. 133, 4761-4769 (2006).</li><li>Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+attachment+requires+GEX2+for+successful+fertilization+in+Arabidopsis.">Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24, 170-175 (2014).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+male+gamete+membrane+protein+DMP9/DAU2+is+required+for+double+fertilization+in+flowering+plants.">The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants.</a> Development. 145, dev170076 (2018).</li><li>Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+dynamics+of+HISTONE3+variants+between+the+two+fertilization+products+in+plants.">Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants.</a> Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+recovery+system+is+dependent+on+the+number+of+pollen+grains+for+efficient+reproduction+in+plants.">Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants.</a> Plant Signaling &amp; Behavior. 8, e23690 (2013).</li><li>Kasahara, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+recovery+after+defective+sperm+cell+release+in+Arabidopsis.">Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis.</a> Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).</li><li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana.">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21, 497-502 (2011).</li><li>Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gamete+membrane+dynamics+during+double+fertilization+of+Arabidopsis.">Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis.</a> Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).</li></ol>

HTR10-mrfp labels vaderlijke chromatine (dat wil zeggen, visualiseert sperma celkernen), en de dynamiek in dubbele bevruchting is gemeld7. Onmiddellijk na het vrijkomen van een stuifmeel buis, HTR10-mRFP-gelabelde sperma kernen zijn nog steeds gecondenseerd. Echter, elk van de zaad kernen is gedegecondenseerd bij het samenvoegen met een bevruchte vrouwelijke gameten Nucleus op karyogamie drie tot vier uur na gameten membraan fusie7. Onbevruchte spermacellen blijven geconden...

Bloeiende planten produceren zaden door dubbele bevruchting, een proces dat rechtstreeks wordt beheerst door interacties tussen eiwitten gelokaliseerd op gameten plasma membraan1,2. Bloeiende plant mannelijke gameten, een paar spermacellen, Ontwikkelen in pollen. Een pollen buis die groeit na bestuiving levert een paar spermacellen aan vrouwelijke gameten, een eicel en een centrale cel, die in een embryo-zak ontwikkelen. Nadat de mannelijke en vrouwelijke gameten elkaar ontmoeten, bevorderen eiwitten op het gameten-oppervlak herkenning, gehechtheid en fusie om dubbele bevruchting te voltooien. In eerdere studies werden de mannelijke gameten membraan eiwitten generatieve celspecifieke 1 (GCS1)/hapless2 (HAP2)3,4 en gameten uitgedrukt 2 (GEX2)5 geïdentificeerd als bevruchting regulatoren die betrokken zijn bij gameten fusie en bijlage, respectievelijk. Onlangs identificeerden we een mannelijk gameten-specifiek membraan proteïne, DUF679 DOMAIN membraan PROTEIN 9 (DMP9), als een bemesting regulator die betrokken is bij gameten interactie. We constateerden dat een afname van DMP9 expressie resulteert in significante remming van de bemesting van eicellen tijdens dubbele bevruchting in a. thaliana6.
Aangezien dubbele bevruchting optreedt in een embryo-zak, die is ingebed in een eicel die verder is verpakt met ovariumweefsel, is het moeilijk om de toestanden van dubbele bevruchting processen te observeren en te analyseren. Om deze reden zijn er nog steeds veel onduidelijke punten die een volledig begrip van het hele mechanisme van dubbele bevruchting controle belemmeren. De vaststelling van observatie technieken om het gedrag van gameten te traceren tijdens dubbele bevruchting onder in vivo omstandigheden is onmisbaar voor de functionele analyse van potentiële kandidaten voor bemesting regulatoren. Recente studies hebben markeringslijnen opgeleverd waar gameten subcellulaire structuren gelabeld zijn met fluorescerende eiwitten. In dit artikel tonen we een eenvoudig en snel protocol voor het observeren van dubbele bevruchting die heeft plaatsgevonden in een embryo-zak die is afgeleid van kunstmatig bestuikte stampers. Met behulp van sperma Cell Nucleus marker lijn HTR10-mRFP7, de bevruchting staat van elke vrouwelijke gameten kan worden gediscrimineerd op basis van sperma nucleaire signaal morfologie. Ons protocol gericht op een dergelijke morfologische verandering van de sperma kernen bij bevruchting kan efficiënt een voldoende hoeveelheid gegevens verkrijgen voor statistisch bewijs. Een DMP9-knockdown lijn met HTR10-mrfp achtergrond (DMP9KD/HTR10-mrfp) werd gebruikt als mannelijke planten om een enkele bevruchting patroon tonen. Het protocol is ook geschikt voor de functionele analyse van andere bemesting regulatoren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BX51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>C018181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP9KD/HTR10-mRFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background 
			Takahashi et al. (2018)6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>NW-15S</td>
			<td>15 mm width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP72</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Degital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Vigor</td>
			<td></td>
			<td>Any No. 5 forceps are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Nihonika</td>
			<td>LPH-411PFQDT-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTR10-mRFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background 
			Ingouff et al. (2007)7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td>27 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>S9443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-MRFPHQ</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPlanFL N 40x</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Objective lens (NA 1.3), oil-immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPlanSApo 20x</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Objective lens (NA0.75), dry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of fertilization state by tracing sperm nuclear morphology in arabidopsis double fertilization

Bloeiende planten hebben een uniek seksueel reproductie systeem dat ' dubbele bevruchting ' wordt genoemd, waarbij elk van de spermacellen nauwkeurig met een eicel of een centrale cel smelt. Zo vinden er bijna gelijktijdig twee onafhankelijke bevruchting gebeurtenissen plaats. De bevruchte eicel en de centrale cel ontwikkelen respectievelijk zygote en endosperm. Daarom is nauwkeurige controle van dubbele bevruchting essentieel voor de daaruit voortvloeiende ontwikkeling van zaaizaad. Dubbele bemesting treedt op in de vrouwelijke gametofyt (embryo SAC), die diep verborgen is en bedekt is met dikke ovalen en Eier weefsels. Deze stamper weefsel constructie maakt observatie en analyse van dubbele bevruchting heel moeilijk en heeft de huidige situatie gecreëerd waarin veel vragen over het mechanisme van dubbele bevruchting onbeantwoord blijven. Voor de functionele evaluatie van een potentiële kandidaat voor bevruchting regulator is fenotypische analyse van bemesting belangrijk. Om te oordelen over de voltooiing van de bevruchting in Arabidopsis thaliana, de vormen van fluorescentie signalen labelen van sperma kernen worden gebruikt als indicatoren. Een zaadcel die niet bevruchten wordt, wordt aangegeven door een gecondenseerd fluorescentie signaal buiten de vrouwelijke gameten, terwijl een zaadcel die met succes bemesten wordt aangegeven door een gedegecondenseerd signaal als gevolg van karyogamie met de Nucleus van de vrouwelijke gameten. De hier beschreven methode biedt een hulpmiddel om de succesvolle of mislukte bevruchting onder in vivo condities te bepalen.

Ovules van een stamper bestuikte met DMP9KD/HTR10-mrfp werden verzameld op 7-8 hap en waargenomen.
De meeste zaadknoppen bevatten twee degecondenseerde mrfp-gelabelde sperma kernen in de eicel (micropylar Side) en de centrale cel (charazal end Side) Nucleus posities (Figuur 3a), wat duidt op een geslaagde dubbele bevruchting. Bovendien werden zaadknoppen met een degecondenseerde...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization at JoVE.com

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

We demonstreren een methode om de succesvolle of mislukte bevruchting te bepalen op basis van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting met behulp van een epifluorescentie Microscoop.

Evaluatie van de bemesting staat door het traceren van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Dit protocol biedt een manier om de betrokkenheid van een bepaalde factor in dubbele bevruchting van Arabidopsis te beoordelen. De bevruchtingsstatus kan in één oogopslag worden beoordeeld aan de morfologie van de spermakernen, zodat het snel verkrijgen van de gegevens voor statistische analyse mogelijk is. Deze methode is specifiek voor de beoordeling van bevruchting fenotype in Arabidopsis.Er zijn nog onbekende bevruchtingsregelaars, zelfs als in Arabidopsis. Deze methode zou nuttig zijn voor functionele analyse van toekomstige onbekende bemestingsfactoren. Om de vaardigheid van een snelle en intacte behandeling van de ovules onder de knie te krijgen zijn belangrijk voor het succes van deze analyse.Om te beginnen, groeien Arabidopsis thaliana op 22 graden Celsius onder een 16-uurs licht en acht uur donkere cyclus in een groeikamer. Knip en verwijder de eerste ontwikkelde bloemstengel met een schaar om de ontwikkeling van bijkomende knoppen te bevorderen. Twee tot drie weken na het afsnijden van de eerste stengel, meet de plant hoogte.Planten met een hoogte van meer dan 25 centimeter worden beschouwd als krachtig groeiende planten en zijn geschikt voor analyse. Om te ontlasten, kijk voor knoppen in fase 11 met stukjes bloemblaadjes gezien aan de bovenkant. Gebruik een nummer vijf tangen om sepal, bloemblaadje, en meeldraden van bloemknoppen te verwijderen.15 tot 18 uur na emasculatie, neem de meeldraden van een DMP9-knockdown lijn met achtergrond van HTR10-mRFP bloem in fase 13 door knijpen de gloeidraad met tangen. Om te bestuiven, voorzichtig dep het stigma van een ontlaste stamper meerdere malen met een dehiscent anther. Zeven tot acht uur na bestuiving, verzamel de stamper en plaats het op de dubbelzijdige tape.Druk vervolgens voorzichtig met tangen om de stamper op de tape vast te stellen. Snijd onder een ontledenmicroscoop de boven- en onderzijde van de eierstok af met behulp van een injectienaald. Verplaats de punt van de injectienaald om de eierstokwand langs beide zijden van het represaille door te snijden.Snijd voorzichtig om de funiculus en het zendkanaal niet te scheiden. Evert de eierstokwand. Knijp de basis van het septum waarmee ovules zijn aangesloten, en til het voorzichtig op met tangen.Breng de ovules in een druppel water op een diaglas, en bedek voorzichtig met een coverglass voor observatie onder een fluorescentiemicroscoop. Op een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een fluorescentiefilterkubus, pas de objectieve lens aan op 20x of 40x. Verwerf afbeeldingen van de eicellen met spermakernen met een mRFP.Bevestig het aantal mRFP-gelabelde spermakernen in een embryozak. Bevestig de vorm en positie van elke mRFP-gelabelde spermakern in een embryozak. In deze studie werden bevruchtingsfenotypes beoordeeld door sperma nuclear signaal morfologie in de ovule.De meeste eicellen bevatten twee gedecondenseerde mRFP-gelabelde spermakernen aan de eicel micropylar kant en centrale cel charazal einde kant. Dit duidt op een succesvolle dubbele bemesting. Bovendien werden oules met een gedecondenseerde spermakern met het mRFP-label in de centrale celkern plus een gecondenseerde spermakern met het mRFP-label buiten de eicel waargenomen, wat wijst op enkele bevruchting.In het geval van mislukte dubbele bevruchting werden twee gecondenseerde spermakernen met mRFP-label waargenomen op de grens van de eicel en de centrale cel. In de analyse met behulp van DMP9-knockdown lijn met achtergrond van HTR10-mRFP pollen, eicellen met een enkele gecondenseerde mRFP-gelabelde spermakern of drie of meer mRFP-gelabelde spermakernen werden zelden waargenomen. In combinatie met het gebruik van vrouwelijke markerlijnen kan een nauwkeurigere bevruchtingsstatus worden geanalyseerd.Bijvoorbeeld, de bevruchting status bij na gamete fusie en vóór de karyogamie kan worden beoordeeld. Ja, het bevruchtingsproces is verdeeld in verschillende stappen. De vragen die elke bemestingsregelaar met deze verbeterde methode kan beantwoorden.Het zou dieper inzicht geven in de seksuele voortplanting van de plant.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulatie en<em&gt; In Vitro</em&gt; Rijping van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eicellen, Gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie, om embryonale ontwikkeling

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Live confocale Imaging van de ontwikkelingslanden Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose dolfijn (Tursiops truncatus) Spermatozoa: collectie, cryopreservatie en heterologe In Vitro bevruchting

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

Analyse van Chromosoom Segregatie, Histon Acetylatie, En Spindel Morfologie In Paard Oocyten

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende cel beeldvorming van chromosoom segregatie tijdens de mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Traceren van genexpressie door detectie van β-galactosidase-activiteit in hele muis embryo 's

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Fluorimetrische technieken voor de beoordeling van sperma membranen

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Een gelaagde montagemethode voor de uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravis embryo's

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonale genetische tracing met de confetti muis om gemineraliseerde weefsels te bestuderen

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...