Name: evaluation of fertilization state by tracing sperm nuclear morphology in arabidopsis double fertilization
Uploaded: 2019-08-29T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par la subvention kaKENHI de la Japan Society for the Promotion of Science (JP17H05832 à T. I.) et par le financement du Programme de promotion de la recherche prioritaire stratégique sur les sciences moléculaires des plantes phytochimiques de l'Université chiba (Japon).

1. Pollinisation artificielle
REMARQUE: Avant de commencer le processus, une paire de forceps no 5 est nécessaire.
<ol><li>Cultivez A. thaliana (Col-0) à 22 oC sous un cycle sombre de 16 h/8 h dans une chambre de croissance. REMARQUE: Couper et enlever la première tige de fleur développée avec des ciseaux pour favoriser le développement des bourgeons axillaires. Les plantes en croissance vigoureuse (2-3 semaines après la coupe de la premi?...

<ol>
	<li>Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+dialogs+in+green+lineages.">Gamete dialogs in green lineages.</a> Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).</li><li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants.">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Current Biology. 26, R125-R139 (2016).</li><li>Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENERATIVE+CELL+SPECIFIC+1+is+essential+for+angiosperm+fertilization.">GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization.</a> Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).</li><li>von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+HAP2+(GCS1)+is+a+sperm-specific+gene+required+for+pollen+tube+guidance+and+fertilization.">Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization.</a> Development. 133, 4761-4769 (2006).</li><li>Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+attachment+requires+GEX2+for+successful+fertilization+in+Arabidopsis.">Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24, 170-175 (2014).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+male+gamete+membrane+protein+DMP9/DAU2+is+required+for+double+fertilization+in+flowering+plants.">The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants.</a> Development. 145, dev170076 (2018).</li><li>Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+dynamics+of+HISTONE3+variants+between+the+two+fertilization+products+in+plants.">Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants.</a> Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+recovery+system+is+dependent+on+the+number+of+pollen+grains+for+efficient+reproduction+in+plants.">Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants.</a> Plant Signaling &amp; Behavior. 8, e23690 (2013).</li><li>Kasahara, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+recovery+after+defective+sperm+cell+release+in+Arabidopsis.">Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis.</a> Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).</li><li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana.">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21, 497-502 (2011).</li><li>Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gamete+membrane+dynamics+during+double+fertilization+of+Arabidopsis.">Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis.</a> Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).</li></ol>

HTR10-mRFP étiquette la chromatine paternelle (c.-à-d., visualise les noyaux de spermatozoïdes), et la dynamique dans la double fécondation ont été rapportés7. Immédiatement après la libération d'un tube de pollen, les noyaux de sperme HTR10-mFP-étiquetés sont toujours condensés. Cependant, chacun des noyaux de sperme est décondensé en fusionnant avec un noyau de gamète femelle fertilisé à la karyogamy trois à quatre heures après fusion de membrane de gamète7...

Les plantes à fleurs produisent des graines par double fécondation, un processus qui est directement contrôlé par les interactions entre les protéines localisées sur la membrane plasmatique gamète1,2. Les gamètes mâles de plante de floraison, une paire de spermatozoïdes, se développent dans le pollen. Un tube de pollen qui se développe après la pollinisation fournit une paire de spermatozoïdes aux gamètes femelles, un ovule et une cellule centrale, qui se développent dans un sac d'embryon. Après la rencontre des gamètes mâles et femelles, les protéines sur la surface du gamète favorisent la reconnaissance, l'attachement et la fusion pour compléter la double fécondation. Dans des études antérieures, les protéines mâles de membrane de gamètegenerative CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 et GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 ont été identifiées comme régulateurs de fertilisation impliqués dans la fusion de gamètes et attachement, respectivement. Nous avons récemment identifié une protéine membranaire spécifique au gamète mâle, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), en tant que régulateur de fertilisation impliqué dans l'interaction gamète. Nous avons constaté qu'une diminution de l'expression de DMP9 a comme conséquence l'inhibition significative de la fertilisation de cellules d'oeuf pendant la double fertilisation dans A. thaliana6.
Comme la double fécondation se produit dans un sac d'embryon, qui est incorporé dans un ovule qui est encore enveloppé avec le tissu d'ovaire, il est difficile d'observer et d'analyser les états des processus de double fécondation. Pour cette raison, il y a encore beaucoup de points peu clairs qui entravent une compréhension complète du mécanisme entier de contrôle de double fertilisation. La mise en place de techniques d'observation pour retracer le comportement des gamètes lors de la double fécondation dans des conditions in vivo est indispensable à l'analyse fonctionnelle des candidats potentiels pour les régulateurs de fécondation. Des études récentes ont donné des lignes de marqueur où les structures sous-cellulaires gamètes sont étiquetées avec des protéines fluorescentes. Dans cet article, nous démontrons un protocole simple et rapide pour observer la double fertilisation qui s'est produite dans un sac d'embryon dérivé des pistils artificiellement pollinisés. L'utilisation de la ligne de marqueurde noyau de cellules de sperme HTR10-mRFP 7, l'état de fertilisation de chaque gamète femelle peut être discriminé sur la base de la morphologie nucléaire de signal de sperme. Notre protocole se concentrant sur un tel changement morphologique des noyaux de sperme à la fertilisation peut obtenir efficacement une quantité suffisante de données pour la preuve statistique. Une ligne DMP9-knockdownavec hTR10-mRFP fond (DMP9KD/HTR10-mRFP) a été utilisé comme plantes mâles pour montrer un modèle de fertilisation unique. Le protocole convient également à l'analyse fonctionnelle d'autres organismes de réglementation de la fertilisation.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BX51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>C018181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP9KD/HTR10-mRFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background 
			Takahashi et al. (2018)6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>NW-15S</td>
			<td>15 mm width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP72</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Degital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Vigor</td>
			<td></td>
			<td>Any No. 5 forceps are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Nihonika</td>
			<td>LPH-411PFQDT-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTR10-mRFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background 
			Ingouff et al. (2007)7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td>27 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>S9443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-MRFPHQ</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPlanFL N 40x</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Objective lens (NA 1.3), oil-immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPlanSApo 20x</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Objective lens (NA0.75), dry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of fertilization state by tracing sperm nuclear morphology in arabidopsis double fertilization

Les plantes à fleurs ont un système unique de reproduction sexuelle appelé « double fécondation », dans lequel chacun des spermatozoïdes fusionne précisément avec un ovule ou une cellule centrale. Ainsi, deux événements de fécondation indépendants ont lieu presque simultanément. L'ovule fécondé et la cellule centrale se développent en zygote et endosperme, respectivement. Par conséquent, un contrôle précis de la double fécondation est essentiel pour le développement des semences qui s'ensuit. La double fécondation se produit dans le gamétophyte femelle (sac d'embryon), qui est profondément caché et couvert de tissus épais d'ovule et d'ovaire. Cette construction de tissu de pistil rend l'observation et l'analyse de la double fertilisation tout à fait difficile et a créé la situation actuelle dans laquelle beaucoup de questions concernant le mécanisme de double fertilisation restent sans réponse. Pour l'évaluation fonctionnelle d'un candidat potentiel pour l'organisme de réglementation de la fécondation, l'analyse phénotypique de la fécondation est importante. Pour juger de l'achèvement de la fécondation dans Arabidopsis thaliana, les formes des signaux de fluorescence étiquetant les noyaux de sperme sont utilisés comme indicateurs. Un spermatozoïde qui ne parvient pas à féconder est indiqué par un signal de fluorescence condensé à l'extérieur des gamètes femelles, tandis qu'un spermatozoïde qui féconde avec succès est indiqué par un signal décondensé dû à la karyogamy avec le noyau des gamètes femelles. La méthode décrite ici fournit un outil pour déterminer la fécondation réussie ou échouée dans des conditions in vivo.

Des ovules d'un pistil pollinisé avec DMP9KD/HTR10-mRFP ont été rassemblés à 7-8 HAP et observés.
La plupart des ovules contenaient deux noyaux de sperme décondensés étiquetés mRFP à l'ovule (côté micropylar) et à la cellule centrale (côté de l'extrémité charazal) positions du noyau, respectivement (Figure 3A), indiquant une double fécondation réussie. En out...

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Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Nous démontrons une méthode pour déterminer la fertilisation réussie ou échouée sur la base de la morphologie nucléaire de sperme dans la double fertilisation d'Arabidopsis utilisant un microscope d'épifluorescence.

Évaluation de l'état de fertilisation par la recherche de la morphologie nucléaire du sperme dans la double fécondation de l'arabidopsise

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Ce protocole fournit un moyen d’évaluer la participation d’un certain facteur à la double fécondation de l’arabidopsie. Le statut de fécondation peut être jugé par la morphologie des noyaux de sperme en un coup d’œil, de sorte que l’obtention rapide des données pour l’analyse statistique est possible. Cette méthode est spécifique à l’évaluation du phénotype de fécondation dans Arabidopsis.Il existe encore des régulateurs de fécondation inconnus, même si dans Arabidopsis. Cette méthode serait utile pour l’analyse fonctionnelle des futurs facteurs de fécondation inconnus. Maîtriser l’habileté d’une manipulation rapide et intacte des ovules est important pour le succès de cette analyse.Pour commencer, cultivez Arabidopsis thaliana à 22 degrés Celsius sous une lumière de 16 heures et un cycle sombre de huit heures dans une chambre de croissance. Couper et enlever la première tige de fleur développée avec des ciseaux pour favoriser le développement des bourgeons axillaires. Deux à trois semaines après avoir coupé la première tige, mesurez la hauteur de la plante.Les plantes dont la hauteur est supérieure à 25 centimètres sont considérées comme des plantes en croissance vigoureuse et conviennent à l’analyse. Pour émasculer, recherchez les bourgeons à l’étape 11 avec des morceaux de pétales vus au sommet. Utilisez un nombre cinq forceps pour enlever le sépale, le pétale et l’étamine des boutons floraux.15 à 18 heures après l’émasculation, prendre l’étamine d’une ligne de knockdown DMP9 avec fond de fleur HTR10-mRFP au stade 13 en pinçant le filament avec des forceps. Pour polliniser, tapoter doucement la stigmatisation d’un pistil émasculé à plusieurs reprises avec une anthère déhiscente. Sept à huit heures après la pollinisation, recueillir le pistil et le placer sur le ruban adhésif à double face.Ensuite, appuyez doucement avec des forceps pour fixer le pistil sur la bande. Sous un microscope disséquant, couper les extrémités supérieure et inférieure de l’ovaire à l’aide d’une aiguille d’injection. Déplacez la pointe de l’aiguille d’injection pour trancher la paroi de l’ovaire le long des deux côtés du replum.Couper soigneusement afin de ne pas séparer le funiculus et le tractus de transmission. Evert le mur de l’ovaire. Pincez la base du septum à laquelle les ovules sont reliés, et soulevez-la soigneusement avec des forceps.Transférer les ovules dans une goutte d’eau sur un verre à glissière, et couvrir délicatement d’un verre de couverture pour observation au microscope à fluorescence. Sur un microscope d’épifluorescence équipé d’un cube de filtre à fluorescence, réglez la lentille objective à 20x ou 40x. Acquérir des images des ovules contenant des noyaux de sperme étiquetés avec mRFP.Confirmer le nombre de noyaux de sperme étiquetés mRFP dans un sac embryonnaire. Confirmer la forme et la position de chaque noyau de sperme étiqueté mRFP dans un sac embryonnaire. Dans cette étude, les phénotypes de fertilisation ont été jugés par morphologie nucléaire de signal de sperme dans l’ovule.La plupart des ovules contenaient deux noyaux de sperme décondensés étiquetés mRFP du côté micropylaire des ovocytes et du côté central de l’extrémité charazale des cellules. Cela indique une double fécondation réussie. En outre, des ovules contenant un noyau de sperme décondensé étiqueté mRFP au noyau central de cellules plus un noyau condensé de sperme mRFP-étiqueté à l’extérieur du cellule d’oeuf ont été observés, indiquant la fertilisation simple.Dans le cas d’une double fécondation infructueuse, deux noyaux de sperme condensés étiquetés mRFP ont été observés à la limite de l’ovule et de la cellule centrale. Dans l’analyse utilisant la ligne de knockdown de DMP9 avec l’arrière-plan du pollen de HTR10-mRFP, des ovules contenant un noyau condensé de sperme mRFP-étiqueté ou trois noyaux de sperme mRFP-étiquetés ou plus ont été rarement observés. En combinaison avec l’utilisation de lignées de marqueurs femelles, l’état de fécondation plus précis peut être analysé.Par exemple, le statut de fécondation après la fusion des gamete et avant la karyogamie peut être jugé. Oui, le processus de fécondation est divisé en plusieurs étapes. Les questions auxquelles chaque organisme de réglementation de la fécondation a participé et à quelles étapes peut être répondue grâce à cette méthode améliorée.Il fournirait un aperçu plus approfondi de la reproduction sexuelle de la plante.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

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Manipulation et<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturation du<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; ovocytes, Suivi par injection intracytoplasmique de spermatozoïdes, pour étudier le développement embryonnaire

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Biologie du développement

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