Name: evaluation of fertilization state by tracing sperm nuclear morphology in arabidopsis double fertilization
Uploaded: 2019-08-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Japan Society for fremme av science KAKENHI stipend (JP17H05832 til T. I.) og ved finansiering fra Strategic priority Research Promotion program på phytochemical Plant Molecular Sciences, Chiba University (Japan).

1. kunstig pollinering
Merk: Før du starter prosessen, er et par av nr 5 tang nødvendig.
<ol><li>Grow A. thaliana (Col-0) ved 22 ° c under en 16-h lys/8-h mørk syklus i en vekst kammer. Merk: Klipp ut og fjern den første utviklede blomsten stengel med saks for å fremme utvikling av aksillær knopper. Kraftig voksende planter (2-3 uker etter klipping av den første stilken, Plant høyde ca 25 cm) er egnet for analyse.</li>
	<li>For å kastre...

<ol>
	<li>Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+dialogs+in+green+lineages.">Gamete dialogs in green lineages.</a> Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).</li><li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants.">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Current Biology. 26, R125-R139 (2016).</li><li>Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENERATIVE+CELL+SPECIFIC+1+is+essential+for+angiosperm+fertilization.">GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization.</a> Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).</li><li>von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+HAP2+(GCS1)+is+a+sperm-specific+gene+required+for+pollen+tube+guidance+and+fertilization.">Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization.</a> Development. 133, 4761-4769 (2006).</li><li>Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+attachment+requires+GEX2+for+successful+fertilization+in+Arabidopsis.">Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24, 170-175 (2014).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+male+gamete+membrane+protein+DMP9/DAU2+is+required+for+double+fertilization+in+flowering+plants.">The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants.</a> Development. 145, dev170076 (2018).</li><li>Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+dynamics+of+HISTONE3+variants+between+the+two+fertilization+products+in+plants.">Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants.</a> Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+recovery+system+is+dependent+on+the+number+of+pollen+grains+for+efficient+reproduction+in+plants.">Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants.</a> Plant Signaling &amp; Behavior. 8, e23690 (2013).</li><li>Kasahara, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+recovery+after+defective+sperm+cell+release+in+Arabidopsis.">Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis.</a> Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).</li><li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana.">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21, 497-502 (2011).</li><li>Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gamete+membrane+dynamics+during+double+fertilization+of+Arabidopsis.">Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis.</a> Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).</li></ol>

HTR10-mRFP etiketter fars kromatin (dvs. visualiserer sperm cellekjerner), og dynamikken i dobbel befruktning har blitt rapportert7. Umiddelbart etter løslatelse fra en pollen tube, HTR10-mRFP-merket sperm kjerner er fortsatt kondensert. Imidlertid er hver av sperm kjerner decondensed ved sammenslåing med en befruktet kvinnelig Kjønnscelle nucleus på karyogamy tre til fire timer etter Kjønnscelle membran Fusion7. Ubefruktede sperm celler forblir kondensert, som vist i ...

Blomstrende planter produsere frø gjennom dobbel befruktning, en prosess som er direkte styrt av interaksjoner mellom proteiner lokalisert på Kjønnscelle plasma membran1,2. Blomstrende plante mannlige kjønnscellene, et par sperm celler, utvikle seg i pollen. Et pollen rør som vokser etter pollinering leverer et par sperm celler til kvinnelige kjønnscellene, en egg celle og en sentral celle, som utvikler seg i et embryo SAC. Etter at den mannlige og kvinnelige kjønnscellene møtes, proteiner på Kjønnscelle overflaten fremme anerkjennelse, vedlegg og fusjon for å fullføre dobbel befruktning. I tidligere studier, den mannlige Kjønnscelle membran proteiner GENERATIVE celle spesifikke 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 og Kjønnscelle uttrykt 2 (GEX2)5 ble identifisert som befruktning regulatorer involvert i Kjønnscelle Fusion og vedlegg, henholdsvis. Vi har nylig identifisert en mannlig Kjønnscelle-spesifikt membran protein, DUF679 DOMAIN MEMBRAN PROTEIN 9 (DMP9), som en befruktning regulator involvert i Kjønnscelle interaksjon. Vi fant at en reduksjon på DMP9 uttrykk resulterer i betydelig hemming av egg celle befruktning under dobbel befruktning i a. thaliana6.
Som dobbel befruktning oppstår i et embryo SAC, som er innebygd i en ovule som er videre innpakket med eggstokk vev, er det vanskelig å observere og analysere statene dobbelt befruktning prosesser. Av denne grunn er det fortsatt mange uklare punkter som hindrer en fullstendig forståelse av hele mekanismen av dobbel befruktning kontroll. Etablering av observasjon teknikker for å spore atferden til kjønnscellene under dobbel befruktning under in vivo forhold er uunnværlig for funksjonell analyse av potensielle kandidater til befruktning regulatorer. Nyere studier har gitt markør linjer der Kjønnscelle subcellulære strukturer er merket med fluorescerende proteiner. I denne artikkelen viser vi en enkel og rask protokoll for å observere dobbel befruktning som har skjedd i et embryo SAC avledet fra kunstig pollinated pistils. Ved hjelp av sperm cellekjernen markør linje HTR10-mRFP7, befruktning tilstand av hver kvinnelige Kjønnscelle kan bli diskriminert på grunnlag av sperm kjernefysisk signal morfologi. Vår protokoll med fokus på en slik morfologiske endring av sperm kjerner ved befruktning kan effektivt få en tilstrekkelig mengde data for statistisk bevis. En DMP9-knockdown linje med HTR10-mRFP bakgrunn (DMP9KD/HTR10-mRFP) ble brukt som mannlige planter for å vise en enkelt befruktning mønster. Protokollen er også egnet for funksjonell analyse av andre befruktning regulatorer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BX51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>C018181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP9KD/HTR10-mRFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background 
			Takahashi et al. (2018)6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>NW-15S</td>
			<td>15 mm width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP72</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Degital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Vigor</td>
			<td></td>
			<td>Any No. 5 forceps are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Nihonika</td>
			<td>LPH-411PFQDT-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTR10-mRFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background 
			Ingouff et al. (2007)7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td>27 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>S9443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-MRFPHQ</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPlanFL N 40x</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Objective lens (NA 1.3), oil-immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPlanSApo 20x</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Objective lens (NA0.75), dry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of fertilization state by tracing sperm nuclear morphology in arabidopsis double fertilization

Blomstrende planter har en unik seksuell reproduksjon system kalt "dobbel befruktning", der hver av sperm cellene nøyaktig sikringer med en egg celle eller en sentral celle. Dermed vil to uavhengige befruktning hendelser skje nesten samtidig. Den befruktet egg celle og sentral celle utvikle seg til zygote og endosperm, henholdsvis. Derfor er presis kontroll av dobbel befruktning viktig for den påfølgende frø utvikling. Dobbel befruktning oppstår i den kvinnelige Gametofytt (embryo SAC), som er dypt skjult og dekket med tykt ovule og eggstokk vev. Dette pistil vev konstruksjonen gjør observasjon og analyse av dobbel befruktning ganske vanskelig og har skapt den nåværende situasjonen der mange spørsmål om mekanismen av dobbel befruktning forbli ubesvart. For funksjonell evaluering av en potensiell kandidat for befruktning regulator, er fenotypiske analyse av befruktning viktig. Å bedømme fullføringen av befruktning i Arabidopsis thaliana, formene av fluorescens signaler merking sperm kjerner brukes som indikatorer. En sperm cellen det svikter å gjødsle er indikert av en kondensert fluorescens signal ytterside av det kvinner kjønnscellene, mens derimot en sperm cellen det med hell fertilizes er angitt av en decondensed signal på grunn av karyogamy med det kvinner kjønnscellene ' kjernen. Metoden beskrevet her gir et verktøy for å fastslå vellykket eller mislykket befruktning under in vivo forhold.

Ovules fra en pistil pollinated med DMP9KD/HTR10-mRFP ble samlet ved 7-8 Hap og observert.
De fleste ovules inneholdt to decondensed mRFP-merket sperm kjerner på egg cellen (micropylar side) og sentral celle (charazal ende side) nucleus posisjoner, henholdsvis (figur 3a), indikerer vellykket dobbel befruktning. I tillegg, ovules inneholder en decondensed mRFP-merket sperm kjern...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization at JoVE.com

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Vi viser en metode for å fastslå vellykket eller mislykket befruktning på grunnlag av sperm kjernefysisk morfologi i Arabidopsis dobbel befruktning ved hjelp av en epifluorescence mikroskop.

Evaluering av befruktning stat ved tracing sperm kjernefysisk morfologi i Arabidopsis dobbel befruktning

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Denne protokollen gir en måte å vurdere involvering av en viss faktor i dobbel befruktning av Arabidopsis. Befruktningsstatusen kan dømmes av morfologien til spermkjernene på et øyeblikk, slik at rask innhenting av dataene for statistisk analyse er mulig. Denne metoden er spesifikk for vurdering for befruktning fenotype i Arabidopsis.Det er fortsatt ukjent befruktning regulatorer, selv om i Arabidopsis. Denne metoden vil være nyttig for funksjonell analyse av fremtidige ukjente befruktningsfaktorer. Å mestre ferdighetene til rask og intakt håndtering av eggløsningene er viktig for suksessen til denne analysen.Til å begynne, vokse Arabidopsis thaliana på 22 grader Celsius under en 16-timers lys og åtte timers mørk syklus i et vekstkammer. Klipp og fjern den første utviklede blomsterstilken med saks for å fremme utvikling av aksillære knopper. To til tre uker etter å ha kuttet av den første stilken, måle plantehøyden.Planter med høyde over 25 centimeter anses kraftig voksende planter og er egnet for analyse. For å emasculate, se etter knopper på trinn 11 med biter av kronblad sett på toppen. Bruk en nummer fem tang for å fjerne sepal, petal, og pollenbær av blomsterknopper.15 til 18 timer etter emasculation, ta pollenbær av en DMP9-knockdown linje med bakgrunn av HTR10-mRFP blomst på trinn 13 ved å klemme filamentet med tang. For å pollinere, klapp forsiktig stigmaet til en emasculated pistil flere ganger med en dehiscent anther. Syv til åtte timer etter pollinering, samle støvbærer og plassere den på dobbeltsidig tape.Trykk deretter forsiktig med tang for å feste støvbæreren på båndet. Under et dissekerende mikroskop, kutt av de øvre og nedre endene av eggstokken ved hjelp av en injeksjonsnål. Flytt spissen av injeksjonsnålen for å kutte eggstokkveggen langs begge sider av replumen.Klipp forsiktig for ikke å skille funiculus og sendekanalen. Evert eggstokkveggen. Klyp bunnen av septumet som eggløsning er koblet til, og løft den forsiktig opp med tang.Overfør eggløsningene til en dråpe vann på et lysbildeglass, og dekk forsiktig med et dekkglass for observasjon under et fluorescensmikroskop. På et epifluorescensmikroskop utstyrt med en fluorescensfilterkube, juster objektivet til 20x eller 40x. Få bilder av eggløsningene som inneholder spermkjerner merket med mRFP.Bekreft antall mRFP-merkede spermkjerner i en embryosec. Bekreft formen og posisjonen til hver mRFP-merkede sædkjerne i en embryosec. I denne studien ble befruktning fenotyper dømt av sperm kjernefysisk signal morfologi i eggløsning.De fleste eggløsning inneholdt to decondensed mRFP-merkede spermkjerner på eggcellen micropylar side og sentral celle charazal end side. Dette indikerer vellykket dobbel befruktning. I tillegg ble eggløsning som inneholder en decondensed mRFP-merket spermkjerne ved den sentrale cellekjernen pluss en kondensert mRFP-merket sædkjerne utenfor eggcellen observert, noe som indikerer enkelt befruktning.Ved mislykket dobbeltbefruktning ble to kondenserte mRFP-merkede spermkjerner observert ved grensen av eggcellen og den sentrale cellen. I analysen ved hjelp av DMP9-knockdown linje med bakgrunn av HTR10-mRFP pollen, ovler som inneholder en enkelt kondensert mRFP-merket sperm kjerne eller tre eller flere mRFP-merkede spermkjerner ble sjelden observert. Kombinere med bruk av kvinnelige markørlinjer, kan mer nøyaktig befruktning status analyseres.For eksempel kan befruktningsstatusen etter gamete fusion og før karyogamien dømmes. Ja, befruktningsprosessen er delt inn i flere trinn. Spørsmålene som hver befruktning regulator involvert i hvilke skritt kan besvares med denne forbedrede metoden.Det ville gi dypere innsikt i den seksuelle reproduksjonen av planten.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulasjon og<em&gt; In Vitro</em&gt; Modning av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oocytter, etterfulgt av Intracytoplasmatisk Sperm Injection, for å studere embryoutvikling

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Lev Confocal Imaging av Developing Arabidopsis blomster

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Dolphin (bred snute truncatus) Spermatozoa: innsamling, kryonisk bevaring og Heterologous I Vitro fertilisering

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

Analyse av kromosomsegregasjon, histonacetylering og spindelmorfologi i hesteokocytter

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

En metode for å karakterisere Embryogenesis i Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle Imaging av kromosom segregering under mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Sporing genuttrykk gjennom påvisning av β-galactosidase aktivitet i hele Mouse embryoer

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Fluorimetric teknikker for vurdering av Sperm membraner

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

En lagdelt montering metode for utvidet tidsforløp Konfokalmikroskopi mikroskopi av hele sebrafisk embryo

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonal genetisk tracing bruke konfetti musen til å studere Mineralisert vev

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...