Name: evaluation of fertilization state by tracing sperm nuclear morphology in arabidopsis double fertilization
Uploaded: 2019-08-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization at JoVE.com

Эта работа была поддержана Японским обществом содействия науке KAKENHI грант (JP17H05832 т. И.) и за счет финансирования из стратегического приоритетного программы содействия исследованиям по фитохимическим растениям молекулярных наук, Университет Тиба (Япония).

1. Искусственное опыление
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом процесса требуется пара щипков No 5.
<ol><li>Выращивайте A. thaliana (Col-0) при 22 градусах Цельсия при 16-h светлом/8-h темном цикле в камере роста. ПРИМЕЧАНИЕ: Вырезать и удалить первый развитый цветок стебель ...

<ol>
	<li>Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+dialogs+in+green+lineages.">Gamete dialogs in green lineages.</a> Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).</li><li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants.">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Current Biology. 26, R125-R139 (2016).</li><li>Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENERATIVE+CELL+SPECIFIC+1+is+essential+for+angiosperm+fertilization.">GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization.</a> Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).</li><li>von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+HAP2+(GCS1)+is+a+sperm-specific+gene+required+for+pollen+tube+guidance+and+fertilization.">Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization.</a> Development. 133, 4761-4769 (2006).</li><li>Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+attachment+requires+GEX2+for+successful+fertilization+in+Arabidopsis.">Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24, 170-175 (2014).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+male+gamete+membrane+protein+DMP9/DAU2+is+required+for+double+fertilization+in+flowering+plants.">The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants.</a> Development. 145, dev170076 (2018).</li><li>Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+dynamics+of+HISTONE3+variants+between+the+two+fertilization+products+in+plants.">Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants.</a> Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+recovery+system+is+dependent+on+the+number+of+pollen+grains+for+efficient+reproduction+in+plants.">Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants.</a> Plant Signaling &amp; Behavior. 8, e23690 (2013).</li><li>Kasahara, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+recovery+after+defective+sperm+cell+release+in+Arabidopsis.">Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis.</a> Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).</li><li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana.">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21, 497-502 (2011).</li><li>Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gamete+membrane+dynamics+during+double+fertilization+of+Arabidopsis.">Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis.</a> Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).</li></ol>

HTR10-mRFP этикетки отцовского хроматина (т.е. визуализирует ядра сперматозоидов), и динамика в двойном оплодотворении были зарегистрированы7. Сразу же после выпуска из пыльцы трубки, HTR10-mRFP помечены ядра спермы по-прежнему конденсируются. Тем не менее, каждый из ядер спермы deconden...

Цветущие растения производят семена путем двойного оплодотворения, процесс, который непосредственно контролируется взаимодействия миноносов, локализованных на гамете плазменной мембраны1,2. Цветущее растение самцов гамет, пара сперматозоидов, развивается в пыльце. Пыльца трубки, которая растет после опыления поставляет пару сперматозоидов для женщин гамет, яйцеклетки и центральной клетки, которые развиваются в эмбриона мешок. После того, как встречаются самцы и женщины- гаметы, белки на поверхности гамет способствуют распознаванию, привязанности и синтезу для полного двойного оплодотворения. В предыдущих исследованиях, мужские гаметовые мембранные белки GENERATIVE CELLSPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2) 3,4 и GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 были определены как регуляторы оплодотворения, участвующие в синтезе гамет и вложения, соответственно. Недавно мы определили мужской гамет-специфический мембранный белок, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), как регулятор оплодотворения, участвующий в взаимодействии гамет. Мы обнаружили, что уменьшение экспрессии DMP9 приводит к значительному ингибированию оплодотворения яйцеклеток во время двойного оплодотворения в A. thaliana6.
Как двойное оплодотворение происходит в эмбриона мешок, который встроен в яйлю, которая дополнительно обернутые с яичников ткани, трудно наблюдать и анализировать состояния двойных процессов оплодотворения. По этой причине до сих пор существует много неясных моментов, которые препятствуют полному пониманию всего механизма контроля за двойным оплодотворением. Создание методов наблюдения для отслеживания поведения гамет во время двойного оплодотворения в условиях in vivo необходимо для функционального анализа потенциальных кандидатов на органы оплодотворения. Недавние исследования дали маркерные линии, где гамет субклеточные структуры помечены флуоресцентными белками. В этой статье мы демонстрируем простой и быстрый протокол для наблюдения за двойным оплодотворением, которое произошло в эмбриональном мешке, полученном из искусственно опыляемых пестики. Использование сперматозоидов ядро маркера линии HTR10-mRFP7, состояние оплодотворения каждой женщины гаметы могут быть дискриминированы на основе спермы ядерной морфологии сигнала. Наш протокол, посвященный такому морфологическому изменению ядер спермы при оплодотворении, может эффективно получить достаточное количество данных для статистического подтверждения. DMP9-нокдаун линии с HTR10-mRFP фон (DMP9KD/HTR10-mRFP) был использован в качестве мужских растений, чтобы показать одну модель оплодотворения. Протокол также подходит для функционального анализа других регуляторов оплодотворения.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BX51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>C018181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP9KD/HTR10-mRFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background 
			Takahashi et al. (2018)6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>NW-15S</td>
			<td>15 mm width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP72</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Degital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Vigor</td>
			<td></td>
			<td>Any No. 5 forceps are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Nihonika</td>
			<td>LPH-411PFQDT-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTR10-mRFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background 
			Ingouff et al. (2007)7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td>27 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>S9443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-MRFPHQ</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPlanFL N 40x</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Objective lens (NA 1.3), oil-immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPlanSApo 20x</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Objective lens (NA0.75), dry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of fertilization state by tracing sperm nuclear morphology in arabidopsis double fertilization

Цветущие растения имеют уникальную систему полового воспроизводства, называемую «двойное оплодотворение», в которой каждая из сперматозоидов точно сливается с яйцеклеткой или центральной клеткой. Таким образом, два независимых события оплодотворения происходят почти одновременно. Оплодотворенная яйцеклетка и центральная клетка развиваются в зиготе и эндосперме, соответственно. Поэтому для последующего развития семян необходим точный контроль за двойным оплодотворением. Двойное оплодотворение происходит в женском гаметофите (эмбрио-мешок), который глубоко скрыт и покрыт толстыми тканями яйчи и яичников. Эта конструкция пестильной ткани затрудняет наблюдение и анализ двойного оплодотворения и создает нынешнюю ситуацию, в которой многие вопросы, касающиеся механизма двойного оплодотворения, остаются без ответа. Для функциональной оценки потенциального кандидата на оплодотворение важен фенотипический анализ оплодотворения. Для того чтобы судить завершение оплодотворения в Arabidopsis thaliana,формы сигналов флуоресценции маркируя ядра спермы использованы как индикаторы. Клетка спермы которая не усваивает показана сжатым сигналом флуоресценции вне женского gametes, тогда как клетка спермы которая успешно оплодотворяет показана decondensed сигналом из-за karyogamy с женским ядром gametes. Описанный здесь метод предоставляет инструмент для определения успешного или неудачного оплодотворения в условиях in vivo.

Овулы из пестика, опыляемые DMP9KD/HTR10-mRFP, были собраны при 7-8 HAP и соблюдены.
Большинство овулей содержали два деконденсированных mRFP-маркированных ядер спермы в яйцеклетки (микропилярной стороне) и центральной клетке (charazal конц?...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization at JoVE.com

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Мы демонстрируем метод определения успешного или неудачного оплодотворения на основе сперматозоиды ядерной морфологии в арабидопсисдвойном двойном оплодотворении с помощью эпифлюоресцентного микроскопа.

Оценка состояния оплодотворения путем отслеживания ядерной морфологии спермы в арабидопсис двойное оплодотворение

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Этот протокол дает возможность оценить причастность определенного фактора к двойному оплодотворению арабидопсиса. О состоянии оплодотворения можно судить по морфологии ядер спермы с первого взгляда, поэтому быстрое получение данных для статистического анализа возможно. Этот метод специфичен для оценки фенотипа оплодотворения в арабидопсисе.Есть еще неизвестные регуляторы оплодотворения, даже если в Arabidopsis. Этот метод был бы полезен для функционального анализа будущих неизвестных факторов оплодотворения. Для успеха этого анализа важно овладеть навыками быстрой и нетронутой обработки овул.Для начала выращивайте арабидопсис талиану при 22 градусах Цельсия при 16-часовом свете и восьмичасовом темном цикле в камере роста. Вырезать и удалить первый разработанный цветок стебель с ножницами для содействия развитию подмыслие почки. Через две-три недели после отсеив первый стебель, измерьте высоту растения.Растения высотой свыше 25 сантиметров считаются активно растущими растениями и пригодны для анализа. Чтобы выхолощенный, ищите почки на стадии 11 с кусочками лепестков видели в верхней части. Используйте пять типсов, чтобы удалить сепар, лепестки и стамен цветочных почек.Через 15-18 часов после выхолощения возьмите стамен линии DMP9-knockdown на фоне цветка HTR10-mRFP на стадии 13, ущипнув нить щипцом. Чтобы опылять, осторожно погладить клеймо выхолощенный pistil несколько раз с dehiscent пыль. Через семь-восемь часов после опыления соберите пестил и поместите его на двустороннюю ленту.Затем осторожно нажмите типсами, чтобы зафиксировать pistil на ленте. Под расчленяющий микроскоп, отрезать верхний и нижний концы яичника с помощью иглы инъекции. Перемести кончик иглы для перерезания стенки яичников по обе стороны от реблума.Вырезать тщательно, чтобы не отделить funiculus и передачи тракта. Эверт яичников стены. Ущипните основание перегородки, к которой соединены овулы, и аккуратно поднимите ее щипцы.Перенесите овулы в каплю воды на слайд-стакан и аккуратно накройте стеклом для наблюдения под флуоресцентный микроскоп. На эпифлюоресцентном микроскопе, оснащенном кубом фильтра флуоресценции, отрегулируйте объектив до 20x или 40x. Приобретайте изображения овул, содержащих ядра спермы, помеченные mRFP.Подтвердите количество ядер спермы с маркировкой mRFP в зародыше мешка. Подтвердите форму и положение каждого ядра спермы с маркировкой mRFP в мешке эмбриона. В этом исследовании фенотипы оплодотворения были судимы по морфологии ядерного сигнала спермы в яйцеклетке.Большинство яйцеклеток содержали два деконденсированного ядра спермы с маркировкой mRFP на стороне микропилара яйцеклетки и центральную сторону конца клетки charazal. Это означает успешное двойное оплодотворение. Кроме того, были обнаружены яйцеклетки, содержащие ядро спермы с маркировкой mRFP в центральном ядре клетки плюс сжатое ядро спермы с маркировкой mRFP за пределами яйцеклетки, что указывает на одно оплодотворение.В случае неудачного двойного оплодотворения на границе яйцеклетки и центральной клетки наблюдались два ядра спермы с сжатой меткой mRFP. При анализе с использованием линии DMP9-knockdown с фоном пыльцы HTR10-mRFP, яйцеклетки, содержащие одно сжатое ядро спермы с маркировкой mRFP или три или более ядер спермы с маркировкой mRFP, редко наблюдались. В сочетании с использованием женских маркерных линий можно проанализировать более точный статус оплодотворения.Например, можно судить о статусе оплодотворения после слияния гогета и до кариогамии. Да, процесс оплодотворения делится на несколько этапов. Вопросы, которые каждый регулятор оплодотворения участвует в которых шаги могут быть даны ответы с помощью этого улучшенного метода.Это даст более глубокое представление о сексуальном воспроизводстве растения.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Манипуляция и<em&gt; In Vitro</em&gt; Созревание<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; ооциты, а затем внутриклеточное инъекции сперматозоида в целях изучения эмбрионального развития

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Живой конфокальной визуализации Развития Arabidopsis Цветы

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Афалин (Tursiops truncatus) Дельфин сперматозоидов: сбор, криоконсервация и гетерологичных В экстракорпорального оплодотворения

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

Анализ сегрегации хромосом, ацетилирование гистонов и морфология веретена в ооцитах лошадей

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Метод для характеризующие эмбриогенеза в проростках Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Живые клетки изображений сегрегации хромосом в процессе митоза

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Трассировка экспрессии генов путем обнаружения активности β-галактозидазы в целом мыши эмбрионов

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Флуориметрическое методы для оценки мембран сперматозоидов

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Слойный монтаж Метод для расширенного времени Lapse Конфокальная микроскопия целых эмбрионов зебрафиш

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Клональная генетическая трассировка с помощью мыши Confetti для изучения минерализованных тканей

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...