Name: evaluation of fertilization state by tracing sperm nuclear morphology in arabidopsis double fertilization
Uploaded: 2019-08-29T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la beca KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JP17H05832 a T. I.) y por la financiación del Programa Estratégico de Promoción de la Investigación Prioritaria sobre Ciencias Moleculares Plantas Fitoquímicas, Universidad de Chiba (Japón).

1. Polinización artificial
NOTA: Antes de iniciar el proceso, se requiere un par de fórceps No. 5.
<ol><li>Crecer A. thaliana (Col-0) a 22oC bajo un ciclo oscuro de 16h de luz/8-h en una cámara de crecimiento. NOTA: Corta y retira el primer tallo de flor desarrollado con tijeras para promover el desarrollo de cogollos axilares. Las plantas de crecimiento vigoroso (2-3 semanas después del corte del primer tallo; altura de la planta alrededor d...

<ol>
	<li>Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+dialogs+in+green+lineages.">Gamete dialogs in green lineages.</a> Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).</li><li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants.">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Current Biology. 26, R125-R139 (2016).</li><li>Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENERATIVE+CELL+SPECIFIC+1+is+essential+for+angiosperm+fertilization.">GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization.</a> Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).</li><li>von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+HAP2+(GCS1)+is+a+sperm-specific+gene+required+for+pollen+tube+guidance+and+fertilization.">Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization.</a> Development. 133, 4761-4769 (2006).</li><li>Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+attachment+requires+GEX2+for+successful+fertilization+in+Arabidopsis.">Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24, 170-175 (2014).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+male+gamete+membrane+protein+DMP9/DAU2+is+required+for+double+fertilization+in+flowering+plants.">The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants.</a> Development. 145, dev170076 (2018).</li><li>Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+dynamics+of+HISTONE3+variants+between+the+two+fertilization+products+in+plants.">Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants.</a> Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+recovery+system+is+dependent+on+the+number+of+pollen+grains+for+efficient+reproduction+in+plants.">Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants.</a> Plant Signaling &amp; Behavior. 8, e23690 (2013).</li><li>Kasahara, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+recovery+after+defective+sperm+cell+release+in+Arabidopsis.">Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis.</a> Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).</li><li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana.">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21, 497-502 (2011).</li><li>Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gamete+membrane+dynamics+during+double+fertilization+of+Arabidopsis.">Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis.</a> Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).</li></ol>

Etiquetas HTR10-mRFP cromatina paterna (es decir, visualiza núcleos de células espermáticas), y la dinámica en la fertilización doble se han reportado7. Inmediatamente después de la liberación de un tubo de polen, los núcleos de espermatozoides con etiqueta HTR10-mRFP todavía se condensan. Sin embargo, cada uno de los núcleos espermáticos se descondensa al fusionarse con un núcleo de gameto femenino fertilizado en karyogamy de tres a cuatro horas después de la fusión de la membrana d...

Las plantas con flores producen semillas a través de la doble fertilización, un proceso que se controla directamente mediante interacciones entre proteínas localizadas en la membrana plasmática gameto1,2. La floración de los gametos masculinos de las plantas, un par de espermatozoides, se desarrollan en el polen. Un tubo de polen que crece después de la polinización entrega un par de espermatozoides a gametos femeninos, una célula de óvulo y una célula central, que se desarrollan en un saco embrionario. Después de que los gametos masculinos y femeninos se encuentran, las proteínas en la superficie del gameto promueven el reconocimiento, el apego y la fusión para completar la doble fertilización. En estudios anteriores, las proteínas de membrana de gameto masculino GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 y GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 se identificaron como reguladores de fertilización involucrados en la fusión de gametos y adjunto, respectivamente. Recientemente identificamos una proteína de membrana específica del gameto masculino, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), como un regulador de fertilización involucrado en la interacción de gametos. Encontramos que una disminución de la expresión DMP9 resulta en una inhibición significativa de la fertilización de células de óvulo sin efecto durante la fertilización doble en A. thaliana6.
Como la fertilización doble se produce en un saco embrionario, que está incrustado en un óvulo que se envuelve aún más con tejido ovárizado, es difícil observar y analizar los estados de los procesos de fertilización doble. Por esta razón, todavía hay muchos puntos poco claros que dificultan una comprensión completa de todo el mecanismo de control de doble fertilización. El establecimiento de técnicas de observación para rastrear el comportamiento de los gametos durante la doble fertilización en condiciones in vivo es indispensable para el análisis funcional de los posibles candidatos para los reguladores de fertilización. Estudios recientes han dado lugar a líneas de marcadores donde las estructuras subcelulares gameto están etiquetadas con proteínas fluorescentes. En este artículo, demostramos un protocolo simple y rápido para observar la doble fertilización que se ha producido en un saco embrionario derivado de pistilos polinizados artificialmente. Utilizando la línea de marcador de núcleo de células espermáticas HTR10-mRFP7, el estado de fertilización de cada gameto femenino puede ser discriminado sobre la base de la morfología de la señal nuclear de espermatozoides. Nuestro protocolo centrado en tal cambio morfológico de los núcleos espermáticos en la fertilización puede obtener eficientemente una cantidad suficiente de datos para la prueba estadística. Se utilizó una línea de derribo DMP9con fondo HTR10-mRFP (DMP9KD/HTR10-mRFP) como plantas masculinas para mostrar un único patrón de fertilización. El protocolo también es adecuado para el análisis funcional de otros reguladores de fertilización.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BX51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>C018181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP9KD/HTR10-mRFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background 
			Takahashi et al. (2018)6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>NW-15S</td>
			<td>15 mm width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP72</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Degital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Vigor</td>
			<td></td>
			<td>Any No. 5 forceps are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Nihonika</td>
			<td>LPH-411PFQDT-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTR10-mRFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background 
			Ingouff et al. (2007)7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td>27 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>S9443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-MRFPHQ</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPlanFL N 40x</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Objective lens (NA 1.3), oil-immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPlanSApo 20x</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Objective lens (NA0.75), dry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of fertilization state by tracing sperm nuclear morphology in arabidopsis double fertilization

Las plantas con flores tienen un sistema de reproducción sexual único llamado "doble fertilización", en el que cada una de las células espermáticas se fusiona con precisión con una célula de óvulo o una célula central. Por lo tanto, dos eventos de fertilización independientes tienen lugar casi simultáneamente. La célula fértil del óvulo y la célula central se desarrollan en cigota y endospermo, respectivamente. Por lo tanto, el control preciso de la doble fertilización es esencial para el desarrollo de semillas subsiguientes. La doble fertilización ocurre en el gametofito femenino (sac embrionario), que está profundamente oculto y cubierto con tejidos gruesos de ovulo y ovario. Esta construcción de tejido pistilo hace que la observación y el análisis de la doble fertilización sean bastante difíciles y ha creado la situación actual en la que muchas preguntas sobre el mecanismo de doble fertilización permanecen sin respuesta. Para la evaluación funcional de un candidato potencial para el regulador de la fertilización, el análisis fenotípico de la fertilización es importante. Para juzgar la realización de la fertilización en Arabidopsis thaliana, las formas de señales de fluorescencia que etiquetan núcleos espermáticos se utilizan como indicadores. Una célula espermática que no fertiliza se indica mediante una señal de fluorescencia condensada fuera de los gametos femeninos, mientras que una célula espermática que fertiliza con éxito está indicada por una señal decondensada debido a la karyogamía con el núcleo de los gametos femeninos. El método descrito aquí proporciona una herramienta para determinar la fertilización exitosa o fallida en condiciones in vivo.

Los ovules de un pistilo polinizado con DMP9KD/HTR10-mRFP fueron recogidos a 7-8 HAP y observados.
La mayoría de los óvulos contenían dos núcleos de espermatozoides descondensados etiquetados con mRFP en las posiciones del núcleo de la célula del óvulo (lado micropylar) y de la célula central (lado final del carácter), respectivamente (Figura3A),lo que indica una fertil...

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Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Demostramos un método para determinar la fertilización exitosa o fallida sobre la base de la morfología nuclear espermática en la fertilización doble de Arabidopsis utilizando un microscopio de epifluorescencia.

Evaluación del Estado de Fertilización mediante el seguimiento de la morfología nuclear de los espermatozoides en la doble fertilización de Arabidopsis

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Este protocolo proporciona una manera de evaluar la participación de un determinado factor en la doble fertilización de Arabidopsis. El estado de fertilización se puede juzgar por la morfología de los núcleos esperma de un vistazo, por lo que la rápida obtención de los datos para el análisis estadístico es posible. Este método es específico para la evaluación del fenotipo de fertilización en Arabidopsis.Todavía hay reguladores de fertilización desconocidos, incluso si en Arabidopsis. Este método sería útil para el análisis funcional de futuros factores de fertilización desconocidos. Dominar la habilidad de manejo rápido e intacto de los ovules son importantes para el éxito de este análisis.Para empezar, crece Arabidopsis thaliana a 22 grados celsius bajo un ciclo de 16 horas de luz y ocho horas de oscuridad en una cámara de crecimiento. Cortar y eliminar el primer tallo de flores desarrollado con tijeras para promover el desarrollo de cogollos axilares. Dos a tres semanas después de cortar el primer tallo, medir la altura de la planta.Las plantas con una altura superior a 25 centímetros se consideran plantas de crecimiento vigoroso y son adecuadas para el análisis. Para emascular, busca cogollos en la etapa 11 con trozos de pétalos vistos en la parte superior. Usa un número cinco fórceps para eliminar el sépalo, el pétalo y el estambre de los brotes florales.15 a 18 horas después de la emasculación, tome el estambre de una línea de derribo DMP9 con fondo de la flor HTR10-mRFP en la etapa 13 pellizcando el filamento con fórceps. Para polinizar, acaricia suavemente el estigma de un pistilo emasculado varias veces con una anteratera dehiscente. Siete a ocho horas después de la polinización, recoger el pistilo y colocarlo en la cinta de doble cara.A continuación, presione suavemente con fórceps para fijar el pistilo en la cinta. Bajo un microscopio de disección, corte los extremos superior e inferior del ovario con una aguja de inyección. Mueva la punta de la aguja de inyección para cortar la pared del ovario a ambos lados del replio.Cortar cuidadosamente para no separar el funiculus y el tracto transmisor. Evert la pared del ovario. Pinche la base del tabique al que están conectados los óvulos y levántelo cuidadosamente con fórceps.Transfiera los óvulos en una gota de agua en un vaso deslizante y cúbralos suavemente con una cubierta para la observación bajo un microscopio de fluorescencia. En un microscopio de epifluorescencia equipado con un cubo de filtro de fluorescencia, ajuste la lente objetivo a 20x o 40x. Adquirir imágenes de los óvulos que contienen núcleos esperma etiquetados con mRFP.Confirme el número de núcleos de espermatozoides con etiqueta mRFP en un saco embrionario. Confirme la forma y la posición de cada núcleo espermático con etiqueta mRFP en un saco embrionario. En este estudio, los fenotipos de fertilización fueron juzgados por morfología de la señal nuclear de espermatozoides en el óvulo.La mayoría de los óvulos contenían dos núcleos de espermatozoides con etiqueta mRFP descondensados en el lado micropilar de células de óvulo y el lado final del charazal de la célula central. Esto indica una doble fertilización exitosa. Además, se observaron óvulos que contenían un núcleo espermático descondensado con mRFP en el núcleo celular central más un núcleo de espermatozoides con mRFP condensado fuera de la célula del óvulo, lo que indica una sola fertilización.En el caso de la doble fertilización fallida, se observaron dos núcleos de espermatozoides con etiqueta mRFP condensada en el límite de la célula de óvulo y la célula central. En el análisis utilizando la línea DMP9-knockdown con fondo de polen HTR10-mRFP, rara vez se observaron óvulos que contenían un solo núcleo de espermatozoides con etiqueta mRFP condensada o tres o más núcleos de espermatozoides con etiqueta mRFP. Combinando con el uso de líneas de marcador femeninas, se puede analizar un estado de fertilización más preciso.Por ejemplo, el estado de fertilización después de la fusión gameto y antes de la cariogamia puede ser juzgado. Sí, el proceso de fertilización se divide en varios pasos. Las preguntas que cada regulador de fertilización implica en qué pasos se pueden responder con este método mejorado.Proporcionaría una visión más profunda de la reproducción sexual de la planta.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

La manipulación y<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los ovocitos, seguido de inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para estudiar el desarrollo embrionario

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Investigación

Biología del Desarrollo

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Vivir Imagen confocal de desarrollo de Arabidopsis Flores

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Tonina Delfín (Tursiops truncatus) espermatozoides: recolección, criopreservación y fecundación In Vitro heteróloga

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