Name: evaluation of fertilization state by tracing sperm nuclear morphology in arabidopsis double fertilization
Uploaded: 2019-08-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Japan Society för främjande av vetenskap KAKENHI Grant (JP17H05832 to T. I.) och genom finansiering från den strategiska prioriterade forsknings främjande program om fytokemiska växt molekylära vetenskaper, Chiba University (Japan).

1. artificiell pollinering
Anmärkning: Innan du påbörjar processen, krävs ett par av No. 5 pincett.
<ol><li>Grow a. thaliana (Col-0) vid 22 ° c under en 16-h ljus/8-h mörk cykel i en tillväxt kammare. Anmärkning: Skär och ta bort den första utvecklade Blomstjälken med sax för att främja utvecklingen av axillär knoppar. Kraftigt växande växter (2-3 veckor efter kapning av den första stjälken; Plant höjd ca 25 cm) är lämpliga f...

<ol>
	<li>Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+dialogs+in+green+lineages.">Gamete dialogs in green lineages.</a> Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).</li><li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants.">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Current Biology. 26, R125-R139 (2016).</li><li>Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENERATIVE+CELL+SPECIFIC+1+is+essential+for+angiosperm+fertilization.">GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization.</a> Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).</li><li>von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+HAP2+(GCS1)+is+a+sperm-specific+gene+required+for+pollen+tube+guidance+and+fertilization.">Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization.</a> Development. 133, 4761-4769 (2006).</li><li>Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+attachment+requires+GEX2+for+successful+fertilization+in+Arabidopsis.">Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24, 170-175 (2014).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+male+gamete+membrane+protein+DMP9/DAU2+is+required+for+double+fertilization+in+flowering+plants.">The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants.</a> Development. 145, dev170076 (2018).</li><li>Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+dynamics+of+HISTONE3+variants+between+the+two+fertilization+products+in+plants.">Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants.</a> Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+recovery+system+is+dependent+on+the+number+of+pollen+grains+for+efficient+reproduction+in+plants.">Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants.</a> Plant Signaling &amp; Behavior. 8, e23690 (2013).</li><li>Kasahara, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+recovery+after+defective+sperm+cell+release+in+Arabidopsis.">Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis.</a> Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).</li><li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana.">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21, 497-502 (2011).</li><li>Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gamete+membrane+dynamics+during+double+fertilization+of+Arabidopsis.">Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis.</a> Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).</li></ol>

HTR10-mRFP etiketter faderlig kromatin (dvs, visualiserar spermier cellkärnor), och dynamiken i dubbel befruktning har rapporterats7. Omedelbart efter utsläpp från ett pollen rör, HTR10-mRFP-märkta spermier kärnor är fortfarande kondenserad. Emellertid, var och en av spermiernas kärnor är dekondenseras vid sammanslagning med en befruktad kvinnlig könscell kärna vid karyogamy tre till fyra timmar efter könscell membran fusion7. Obefruktade spermaceller förblir k...

Blommande växter producera frön genom dubbel befruktning, en process som styrs direkt av interaktioner mellan proteiner lokaliserade på könscell plasmamembran1,2. Blommande växt manliga könsceller, ett par spermier, utvecklas i pollen. Ett pollen rör som växer efter pollinering levererar ett par spermier till kvinnliga könsceller, en äggcell och en central cell, som utvecklas i ett embryo SAC. Efter de manliga och kvinnliga könsceller möts, proteiner på könscell ytan främja erkännande, kvarstad och fusion att slutföra dubbel befruktning. I tidigare studier, den manliga könscell membranproteiner generativ cell specifik 1 (GCS1)/hapless2 (HAP2)3,4 och könscell uttryckte 2 (GEX2)5 identifierades som fertilisering regulatorer inblandade i könscell fusion och respektive bilaga. Vi identifierade nyligen en manlig könscell-specifika membranprotein, DUF679 domän membranprotein 9 (DMP9), som en befruktning regulator inblandade i könscell interaktion. Vi fann att en minskning av DMP9 uttrycket resulterar i betydande hämning av äggcell befruktning under dubbel befruktning i a. thaliana6.
Som dubbel befruktning sker i ett embryo SAC, som är inbäddad i en fröämnet som ytterligare insvept med äggstock vävnad, är det svårt att observera och analysera de stater av dubbel befruktning processer. Av denna anledning finns det fortfarande många oklara punkter som hindrar en fullständig förståelse av hela mekanismen för dubbel befruktning kontroll. Inrättandet av observationsmetoder för att spåra beteendet hos könsceller under dubbel befruktning under in vivo villkor är oumbärlig för funktionell analys av potentiella kandidater för befruktning regulatorer. Nyligen genomförda studier har gett markör linjer där könscell subcellulära strukturer är märkta med fluorescerande proteiner. I den här artikeln visar vi ett enkelt och snabbt protokoll för att observera dubbel befruktning som har inträffat i ett embryo SAC härrör från artificiellt pollinerade pistiller. Använda spermier cell Nucleus markör linje HTR10-MRFP7, gödsling tillstånd av varje kvinnlig könscell kan diskrimineras på grundval av spermier nukleär signal morfologi. Vårt protokoll med fokus på en sådan morfologisk förändring av spermiernas kärnor vid befruktning kan effektivt få en tillräcklig mängd data för statistiska bevis. En DMP9-knockdown linje med HTR10-MRFP bakgrund (DMP9KD/HTR10-MRFP) användes som manliga växter för att visa en enda befruktning mönster. Protokollet lämpar sig också för funktionell analys av andra gödsling regulatorer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BX51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>C018181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP9KD/HTR10-mRFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background 
			Takahashi et al. (2018)6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>NW-15S</td>
			<td>15 mm width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP72</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Degital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Vigor</td>
			<td></td>
			<td>Any No. 5 forceps are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Nihonika</td>
			<td>LPH-411PFQDT-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTR10-mRFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background 
			Ingouff et al. (2007)7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td>27 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>S9443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-MRFPHQ</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPlanFL N 40x</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Objective lens (NA 1.3), oil-immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPlanSApo 20x</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Objective lens (NA0.75), dry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of fertilization state by tracing sperm nuclear morphology in arabidopsis double fertilization

Blommande växter har ett unikt sexuellt reproduktionssystem som kallas "dubbel befruktning", där var och en av spermacellerna exakt säkringar med en äggcell eller en central cell. Sålunda äger två oberoende fertiliserings händelser rum nästan samtidigt. Den befruktade äggcell och Central cell utvecklas till zygot och Endosperm, respektive. Därför är exakt kontroll av dubbel befruktning viktigt för den efterföljande utsädesutveckling. Dubbel befruktning sker i den kvinnliga gametofyten (embryo SAC), som är djupt gömd och täckt med tjocka fröämnet och äggstock vävnader. Denna pistill vävnad konstruktion gör observation och analys av dubbel befruktning ganska svårt och har skapat den nuvarande situationen där många frågor om mekanismen för dubbel befruktning förbli obesvarade. För funktionell utvärdering av en potentiell kandidat för befruktning regulator, fenotypisk analys av befruktning är viktigt. För att döma slutförandet av befruktning i Arabidopsis thaliana, formerna av fluorescens signaler märkning spermier kärnor används som indikatorer. En spermie cell som misslyckas med att befrukta indikeras av en kondenserad fluorescens signal utanför de kvinnliga könsceller, medan en spermie cell som framgångsrikt befruktas indikeras av en dekondenserad signal på grund av karyogamy med den kvinnliga könsceller kärna. Den metod som beskrivs här ger ett verktyg för att bestämma lyckad eller misslyckad befruktning under in vivo villkor.

Ovules från en pistill pollineras med DMP9KD/HTR10-MRFP samlades in vid 7-8 HAP och observerades.
De flesta fröämnen innehöll två dekondenserade MRFP-märkta spermie kärnor vid äggcell (micropylar sida) och Central cell (charazal end Side) Nucleus positioner, respektive (figur 3a), vilket indikerar framgångsrik dubbel befruktning. Dessutom, fröämnen innehåller en deko...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization at JoVE.com

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Vi visar en metod för att bestämma framgångsrik eller misslyckad befruktning på grundval av spermier nukleär morfologi i Arabidopsis dubbel befruktning med hjälp av en epifluorescens Mikroskop.

Utvärdering av fertilisering staten genom att spåra spermier nukleär morfologi i Arabidopsis dubbel befruktning

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Detta protokoll ger ett sätt att bedöma inblandning av en viss faktor i dubbel befruktning av Arabidopsis. Befruktningsstatusen kan bedömas efter morfologin av spermakärnorna på en blick, så den snabba erhållandet av datan för statistisk analys är möjligheten. Denna metod är specifik för bedömning för befruktning fenotyp i Arabidopsis.Det finns fortfarande okända gödsling regulatorer, även om i Arabidopsis. Denna metod skulle vara användbart för funktionell analys av framtida okända befruktning faktorer. Att behärska skicklighet snabb och intakt hantering av äggulerna är viktiga för framgången med denna analys.Till att börja med växa Arabidopsis thaliana vid 22 grader Celsius under en 16-timmars ljus och åtta timmars mörk cykel i en tillväxtkammare. Klipp och ta bort den första utvecklade blomstjälken med sax för att främja utvecklingen av axillära knoppar. Två till tre veckor efter att skära av den första stjälken, mäta anläggningen höjd.Växter med höjd över 25 centimeter anses kraftigt växande växter och är lämpliga för analys. För att emasculate, leta efter knoppar i steg 11 med bitar av kronblad sett på toppen. Använd en siffra fem tyntor för att ta bort foderblad, kronblad, och ståndare av blomknoppar.15 till 18 timmar efter emasculation, ta stamen av en DMP9-knockdown linje med bakgrund av HTR10-mRFP blomma i steg 13 genom att nypa glödtråden med tlyckor. För att pollinera, försiktigt klappa stigmat av en emasculated pistill flera gånger med en dehiscent anther. Sju till åtta timmar efter pollinering, samla in pistill och placera den på dubbelsidig tejp.Tryck sedan försiktigt med pinps för att fixera pistillen på tejpen. Under en dissekera mikroskop, skär av övre och nedre ändarna av äggstocken med hjälp av en injektion nål. Flytta injektionsnålens spets för att skära äggstocksväggen längs båda sidor av replum.Skär försiktigt för att inte separera funiculus och den sändande tarmkanalen. Evert äggstocken väggen. Nyp basen av septum som ägglossning är anslutna, och lyft upp den försiktigt med tämjs.Överför äggulorna i en droppe vatten på ett rutglas och täck försiktigt med ett täckglas för observation under ett fluorescensmikroskop. På ett epifluorescensmikroskop utrustad med en fluorescensfilterkub, justera objektivet till 20x eller 40x. Förvärva bilder av äggulorna som innehåller spermier kärnor märkt med mRFP.Bekräfta antalet mRFP-märkta spermakärnor i en embryosäck. Bekräfta form och position för varje mRFP-märkt spermiekärna i en embryosäck. I denna studie, befruktning fenotyper bedömdes av spermier nukleära signal morfologi i äggule.De flesta äggstockarna innehöll två decondensed mRFP-märkt spermier atomkärnor på äggcellen micropylar sidan och centrala cellen charazal slutet sidan. Detta indikerar framgångsrik dubbelbefruktning. Dessutom observerades äggstockar som innehåller en decondensed mRFP-märkt spermier kärnan vid den centrala cellkärnan plus en kondenserad mRFP-märkt spermier kärna utanför äggcellen, vilket tyder på enkelbefruktning.Vid misslyckade dubbla befruktning, två kondenserade mRFP-märkt spermier atomkärnor observerades vid gränsen för äggcellen och den centrala cellen. I analysen med hjälp av DMP9-knockdown linje med bakgrund av HTR10-mRFP pollen, äggule som innehåller en enda kondenserad mRFP-märkt spermier kärnan eller tre eller fler mRFP-märkt spermier kärnor observerades sällan. Kombinera med användning av kvinnliga markör linjer, mer exakt befruktning status kan analyseras.Till exempel kan befruktningsstatusen vid efter gametefusion och innan karyogamy bedömas. Ja, gödslingsprocessen är uppdelad i flera steg. De frågor som varje gödsling regulator inblandade i vilka steg kan besvaras med denna förbättrade metod.Det skulle ge djupare insikt i den sexuella reproduktion av anläggningen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulering och<em&gt; In Vitro</em&gt; Mognad av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oocyter, följt av intracytoplasmatisk spermieinjektion, att studera embryonal utveckling

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Live Confocal Imaging för att utveckla Arabidopsis blommor

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) spermier: insamling, frysförvaring och heterologa In Vitro fertilisering

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

Analys av kromosomsegregation, histonacetylering och spindelmorfologi i hästocyter

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

En metod för att karaktärisera embryogenes i Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levande cellen avbildning av kromosomsegregering under Mitos

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Spåra genuttryck genom påvisande av β-galaktosidas aktivitet i hela musembryon

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Fluorimetriskt tekniker för bedömning av spermier membran

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

En skiktad monteringsmetod för utökad tidsfördröjning konfokalmikroskopi av hela Zebrafish embryon

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonala genetiska spårning använda Confetti musen för att studera mineraliserade vävnader

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...