Name: dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution
Uploaded: 2019-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution at JoVE.com

ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة (R01GM111452، Y.W.، S.X.). ي. و. تعترف بالدعم المقدم من مؤسسة ويلش (E-1721).

1. إعداد المجمعات الريبوسم
<ol><li>جعل 1000 مل من TAM10 العازلة، والتي تتكون من 20 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة7.5)، 10 مليون متر ملغ (OAc) 2، 30 مليون متر NH4كل، 70 مل ككل، 5 MM EDTA، 7 MM BME (2-mercaptoethanol)، و 0.05٪ توين20.</li>
	<li>إعداد الخلائط الخمسة المدرجة في الجدول1. ملاحظة: كان ريبوسم م?...

<ol>
	<li>Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structural+dynamics+in+translocation:+yet+another+functional+role+for+ribosomal+RNA.">Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA.</a> Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).</li><li>Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+ribosome+hands+the+A-site+tRNA+to+the+P+site+during+EF-G-catalyzed+translocation.">How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation.</a> Science. 345, 1188-1191 (2014).</li><li>Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual-luciferase+reporter+system+for+studying+recoding+signals.">A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals.</a> RNA. 4, 479-486 (1998).</li><li>Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+-2+frameshifting+by+mammalian+ribosomes+to+synthesize+an+additional+arterivirus+protein.">Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).</li><li>Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+excursions+during+mRNA+translocation+mediate+broad+branching+of+frameshift+pathways.">Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways.</a> Cell. 160, 870-881 (2015).</li><li>Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages.">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pathways+of+-1+translational+frameshifting.">Dynamic pathways of -1 translational frameshifting.</a> Nature. 512, 328-332 (2014).</li><li>De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined+and+sequence-specific+noncovalent+binding+forces+of+DNA.">Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA.</a> Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).</li><li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+DNA+rulers+reveal+an+"mRNA+looping"+intermediate+state+during+ribosome+translocation.">Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation.</a> RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).</li><li>Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+"-1"+and+"-2"+ribosomal+frameshiftings+revealed+by+force+spectroscopy.">High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).</li><li>Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center.">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).</li><li>Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+atomic+magnetometer+at+body+temperature+for+magnetic+particle+imaging+and+nuclear+magnetic+resonance.">Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance.</a> Optics Letters. 35, 661-663 (2010).</li><li>Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range,+high-resolution+magnetic+imaging+of+nanoparticles.">Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).</li><li>Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+structure+controls+and+directs+mRNA+entry,+translocation+and+exit+dynamics.">The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics.</a> Physical Biology. 5, 046005 (2008).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+uses+two+active+mechanisms+to+unwind+messenger+RNA+during+translation.">The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation.</a> Nature. 475, 118-121 (2011).</li><li>Jacks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ribosomal+frameshifting+in+HIV-1+gag-pol+expression.">Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression.</a> Nature. 331, 280-283 (1988).</li><li>Schuwirth, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+bacterial+ribosome+at+3.5+&#197;+resolution.">Structures of the bacterial ribosome at 3.5 &#197; resolution.</a> Science. 310, 827-834 (2005).</li><li>Jia, H., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+force+spectroscopy+reveals+ribosomal+motion+at+sub-nucleotide+steps.">Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps.</a> Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).</li></ol>

في فحص الحاكم المزدوج لدينا، والخرز المغناطيسي تلعب دورين أساسيين. أولا، أنها تعمل بمثابة محولات القوة لأن قوة الطرد المركزي يتناسب مع كتلتهم المزدهرة. ثانيا، الخرز هي ناقلات الإشارات التي تم الكشف عنها بواسطة مقياس مغناطيسي ذري، والذي هو حاليا جهاز الاستشعار المغناطيسي الأكثر دقة. الجم...

الإزاحة الجزيئية الحيوية هي معلمة أساسية في دراسة آلية الوظائف البيولوجية ذات الصلة. مثال واحد معين هو نقل ريبوسوم1،2، خلالها يتحرك ريبوسوم من قبل بالضبط ثلاثة نيوكليوتيدات (NT) على الحمض النووي الريبي رسول (mRNA) عادة، وواحد، اثنين، أو أرقام أخرى من NT باستثناء ثلاثة في حالة تحول الإطار. لذلك، مطلوب نظام مسطرة جزيئية دقة واحدة nt التمييز بين أحجام خطوة مختلفة. والتحدي الأكبر هو التحقيق في حركة ريبوسوم على جانبي المدخل والخروج على حد سواء. وبعبارة أخرى، فقط مع نظام حاكم مزدوج سوف نكون قادرين على الكشف عما إذا كان يتم مترابطة بسلاسة من خلال الريبوسوم، أو هناك خطوات وسيطة فيها الجانبين لديهم أحجام خطوة مختلفة مما يؤدي إلى التشابك مع mRNA المتشابكة أو حلقات داخل الريبوسم.
وقد وضعت عدة طرق لمواجهة التحدي الأول المتمثل في حل خطوات مختلفة على جانب الخروج من الريبوسوم (نهاية 3' من mRNA). والقول المزدوج لوسيفيراز حل إطارات القراءة المختلفة عن طريق قياس نسب البروتينات المختلفة الناتجة3،4. هو فقط قابل للتطبيق ل ال 3' نهاية من ال [مرنا] ولذلك غير كاف أن يزوّد صورة كاملة من [ترنسّس]. قياس الطيف الكتلي يمكن تحليل شظايا الببتيد المختلفة نتيجة لإعادة ترتيب التعليمات البرمجية المقابلة5. ولكن لا يمكن تحديد عدد nt التحركات ريبوسيوم على mRNA. فحص الطباعة باصبع القدم هو طريقة شائعة أخرى تستخدم نسخة عكسية تستعد في نهاية 3'-القاصية لنسخ mRNA نحو ريبوسم6. ومع ذلك، فإنه لا ينطبق على نهاية 5 'من mRNA التي تدخل ريبوسوم. تقنيات أخرى, بما في ذلك نهج جزيءواحد وأساليب الفلورة 7, من الصعب تحقيق قرار واحد NT.
لقد قمنا بتطوير اختبار مسطرة الحمض النووي المزدوج الذي يمكن أن يحدد بشكل فريد كل من مواقع المدخل والخروج من mRNA المكشوفة في مجمعات ريبوسوم-ميرنا.  المسطرة [دنس] [دنا] [دنا] [أوليتغورس] أنّ يشكّل [دوبلكسس] من أرقام مؤكّدة من أزواج أساسيّة ([بب]) مع ال [مرنا] يكشف ب ال [ريبوسم], [رغردلوف] أيّ نهاية من ال [مرنا]. ثم تكشف أرقام BP على وجه التحديد موقف ريبوسم على mRNA أثناء النقل. يتم تحديد أرقام BP من الدوبلكس من قبل قوى التفكك الحرجة التي تم الحصول عليها من مطيافية المغناطيسية بقايا الناجمة عن القوة (FIRMS)8. مع عدم اليقين قوة 2-3 pN، والقوى الحرجة كافية لتقديم قرار واحد NT. من خلال تنفيذ جزيء الرابط على حكام الحمض النووي، يمكن التحقيق في الجانب الذي يعوقه بشكل معقم من mRNA من قبل ريبوسم. وبالتالي يمكن حل الإزاحات الريبوسومية المختلفة بدقة. لقد كشفنا بنجاح عن مطابقة حلقات فريدة من نوعها من mRNA المحاصرين بالمضادات الحيوية خلال نقل9، وحل إطارات القراءة المختلفة التي تتعايش على تسلسل mRNA زلق10. يصف هذا مادة التفاصيل من المزدوجة مسطرة فحص, أيّ يتضمّن تحضير من المجمعات [ريبوسم], سطح وظيفيّة من الشرائح زجاجيّة, يشلّ من المجمعات [ريبوسم] وهبهادهم مع مسطرة [دنا] مسمى مغناطيسيّا الجزيئات، والكشف المغناطيسي، وتحليل الطيف القوة من قبل FIRMS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1412px;" width="1411">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Styrene Strip</td>
			<td style="width:239px;">City of Industry</td>
			<td style="width:161px;">MS-861</td>
			<td style="width:795px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:217px;">Glass slides</td>
			<td style="width:239px;">Evaporated Coatings</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>60.0 &#215; 4.0 &#215; 0.3 mm3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A6283-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
			<td style="width:239px;">UCT specialties</td>
			<td style="width:161px;">21400088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mPEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">154-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Biotin-PEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">152-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Epoxy glue</td>
			<td style="width:239px;">Devcon</td>
			<td style="width:161px;">31345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Fusidic Acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">F0756-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Neomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1458009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Viomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1715000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:239px;">invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Magnesium acetate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M5661-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Ammonium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">EDTA</td>
			<td style="width:239px;">GIBCO</td>
			<td style="width:161px;">774750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M6250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tween20</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">GTP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8877-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">PEP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P7127-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Pyruvate Kinase</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1506-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mRNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">133899727</td>
			<td>5&#8242;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3&#8242;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468630</td>
			<td>3&#697;- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">164845370</td>
			<td>3&#697;-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468628</td>
			<td>3&#697;-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">163472705</td>
			<td>3&#697;-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678130</td>
			<td>3&#697;-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678131</td>
			<td>3&#697;-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678132</td>
			<td>3&#697;-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678133</td>
			<td>3&#697;-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Micro Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Hitachi</td>
			<td style="width:161px;">CS150FNX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">VM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Laser</td>
			<td style="width:239px;">Newport</td>
			<td style="width:161px;">TLB-6918-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Function generator</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">DS345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Photo detectors</td>
			<td style="width:239px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:161px;">DET36A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution

يشير النقل الريبوسوم إلى حركة ريبوسومال على الحمض النووي الريبي من قبل ثلاثة نيوكليوتيدات بالضبط (nt)، والتي هي الخطوة المركزية في تخليق البروتين. وللتحقيق في آليتها، هناك شرطان تقنيان أساسيان. الأول هو دقة واحدة nt التي يمكن حل النقل العادي من frameshifting، خلالها يتحرك ريبوسوم من قبل غير 3 nt. والثاني هو القدرة على التحقيق في كل من مدخل وخروج الجانبين من mRNA من أجل توضيح الصورة الكاملة للتبديل. نقوم بالإبلاغ عن فحص مسطرة الحمض النووي المزدوج الذي يقوم على قوى التفكك الحرجة للثنائيات الحمض النووي-mRNA، التي تم الحصول عليها عن طريق مطيافية مغنطة بقايا الناجمة عن القوة (FIRMS).  مع دقة قوة 2-4 pN، يكفي تحليل المسطرة المزدوجة للتمييز بين خطوات النقل المختلفة. من خلال تنفيذ رابط طويل على DNAs التحقيق، فإنها يمكن أن تصل إلى mRNA على الجانب الآخر من ريبوسم، بحيث يمكن تحديد موقف mRNA لكلا الجانبين. ولذلك، فإن اختبار المسطرة المزدوجة هو مناسبة بشكل فريد للتحقيق في نقل الريبوسوم، وحركة الحمض النووي بشكل عام. نعرض النتائج التمثيلية التي أشارت إلى مطابقة mRNA يحلق وحل النقل الطبيعي من frameshifting.

ويبين الشكل 1 مخطط الكشف والصور الفوتوغرافية للمكونات الرئيسية. يتم الكشف المغناطيسي عن طريق مقياس مغناطيسي ذري باستخدام نظام المسح الضوئي (الشكل1A)13. يتم وضع العينة على قضيب شنت على محرك خطي. ينقل المحرك العينة إلى جهاز الاستشعار الذر...

Watch this Scientific Journal Video about Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution at JoVE.com

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

تم تطوير فحص حاكم الحمض النووي المزدوج لتحديد موقف mRNA أثناء نقل الريبوسوم، والذي يعتمد على قوى التفكك من الدوبلكس الحمض النووي-mRNA شكلت. مع قرار النيوكليوتيد واحد والقدرة على الوصول إلى طرفي mRNA، فإنه يمكن أن توفر رؤى ميكانيكية لنقل الريبوسوم والتحقيق في غيرها من الإزاحات حمض نووي.

حكام الحمض النووي المزدوج لدراسة آلية نقل ريبوسم مع قرار النيوكليوتيد واحد

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

يمكن أن يوفر مقايسة مسطرة الحمض النووي المزدوج رؤى ميكانيكية لإعادة توزيع الريبوسوم وتحقيق عمليات تهجير أخرى من حمض النوويات. لدينا اختبار حاكم الحمض النووي المزدوج حاليا هو الطريقة الوحيدة التي يمكن أن تحقق موضوعيا على حد سواء الجانبين مدخل والخروج من مرنا في مجمعات الريبوسوم مع قرار أحادي النيوكليوتيد. كما يتم تطبيق أساليب مماثلة لقياس قوة الحمض النووي الملزمة وانتقائية الأدوية العلاجية الكيميائية.عرض مرئي للأسلوب هو فرصة جيدة بالنسبة لنا لإظهار مزايا حدسي لدينا تقنية ومساعدة الباحثين الآخرين على مزيد من تطويرها إلى مزيد من التطبيقات. للبدء، جعل عينة بلاستيكية جيدا مع شريط الستايرين عن طريق حفر مكعب في المركز مع أبعاد أربعة ملليمترات من ثلاثة ملليمترات من مليمترين. ثم، باستخدام الايبوكسي، الغراء قطعة من الزجاج المغلفة البيوتين، من حوالي خمسة ملليمترات طويلة، إلى السطح السفلي.إضافة 20 ميكرولترات من 0.25 ملليغرام لكل ملليلتر streptavidin محلول مائي في العينة جيدا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. ثم شطف العينة جيدا مرتين مع المخزن المؤقت TAM10. لشل حركة مجمعات الريبوسوم دون المضادات الحيوية، أولا إزالة العازلة من العينة جيدا، وإضافة 20 ميكرولترات من 0.1 ميكرومولر MF-Pre أو MF-Post مجمع الريبوسوم في العينة جيدا.احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، ثم شطف مرة واحدة مع المخزن المؤقت TAM10. يرتبط مجمع الريبوسوم الآن مع streptavidin على السطح عبر البيوتين نهاية خمسة رئيس على مرنا. للتجربة باستخدام المضادات الحيوية، احتضان تسعة ميكرولترات من مجمع MF-Pre مع ميكرولتر واحد من أربعة ملليمولار نيوميكيسين، 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.ثم الجمع في أنبوب 0.6 ميكرولترات من 60 EFG micromolar، 0.8 ميكرولترات من 100 GTP micromolar, 0.8 ميكرولترات من 100 ملليمتر PEP, 0.3 ميكرولترات من 1.3 ملليغرام لكل ملليلتر بيروفات كيناز, 6.43 microliters TAM10 العازلة, وميكرة واحدة من حمض fusidic 5 ملليمتر. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم الجمع بين خليط اثنين، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق إضافية.إجراء تجارب المضادات الحيوية الأخرى بالمثل، مع تركيزات 0.2 ملليمولار فيوميسين، 0.4 ميليمولار هيغروميوسين B، و 0.25 حمض fusidic ميليمولار. بالنسبة لدراسة تغيير الإطار، كرر حضانة مجمعات MFNF-Pre التي تتضمن الزلق، U6A. وتشمل المضادات الحيوية من حمض fusidic بالإضافة إلى النيومايسين.ويلزم وقت كاف لضمان إتمام عملية التهجين. وينصح أيضا لاستخدام العازلة TAM10 مع كلوريد الصوديوم الخلد واحد الفعلية للحفاظ على نظام homosteady. بعد الحضانة، وإزالة العازلة من العينة جيدا.إضافة 20 ميكرولترات من واحد micromolar biotinylated الغوص الحمض النووي حبلا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. في الصباح، شطف شكلت الحمض النووي / مرنا المزدوج مرة واحدة مع المخزن المؤقت TAM10. إزالة المخزن المؤقت من نموذج جيداً.ثم إضافة 20 ميكرولترات من 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر streptavidin المغلفة الخرز المغناطيسي في العينة جيدا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد ذلك، قم بإدخال العينة بعناية في حامل، ووضعها في جهاز طرد مركزي لإزالة الجسيمات المغناطيسية الحرة من السطح بمعدل 84 مرة ز لمدة خمس دقائق. تشغيل الليزر.ثم اضغط على زر الطاقة. ضبط حساسية ل 500 millivolts، وانتظر لمدة ساعتين تقريبا لتسخين وتثبيت المغنطيسية الذرية. لإعداد مقياس المغنطيسية الذري، قم بتشغيل برنامج التحكم في الجهاز، وإعداد وضع نقل المحرك إلى Noise والوضع الافتراضي إلى الصفر.اضغط على قفل على اللوحة الأمامية. ضبط حساسية مرة أخرى إلى 200 ميليفولت. ضبط التيار والجهد من الليزر، والعثور على ذروة الرنين المناسبة ومستوى إشارة إلى الضوضاء للحصول على أفضل دقة إشارة.اضغط على اكتساح على اللوحة الأمامية. تأكد من أن نسبة السعة إلى العرض فوق 0.5 وقيمة المرحلة أصغر من خمس درجات مع عرض أقل من 170 هرتز. سد العجز في إخراج آخر SR530 قفل في مكبر للصوت لردود الفعل من الليزر لقفل تردده.سد العجز في مولد الدالة ATF20B لإدخال موجة مربعة من 500 ميليفولت الذروة إلى الذروة، 100 millihertz كإشارة مرجعية لتحويل التيار إلى إشارة مغناطيسية. ثم افصل مولد الدالة. قم بإعداد وضع نقل المحرك إلى الوضع في الاتجاهين والوضع الافتراضي إلى 260 ملليمتر.تحقق من حالة وحدة تحكم درجة الحرارة، لضمان درجة الحرارة في حوالي 37 درجة مئوية، من جهاز الاستشعار الذري. تحقق من استقرار النظام بأكمله مرتين عن طريق تشغيل البرنامج مباشرة دون تحميل عينات لقياس إشارات حامل العينة الفارغة. لمغنطة العينات، واستخدام بلطف ملاقط لإخراج العينة من حامل، ووضع على مرحلة مغنطة لمدة دقيقتين.ثم ضع العينة مرة أخرى في حامل العينة، والطرد المركزي في 335.4 مرات ز لمدة 20 دقيقة. إزالة الجسيمات المغناطيسية غير محددة. قم بتحميل العينة التالية على المحرك مع ملاقط.انقر فوق قفل على اللوحة الأمامية لتشغيل البرنامج. وفي الوقت نفسه استخدام ملاقط لتحميل عينة أخرى في حامل، ووضعها في جهاز الطرد المركزي. جعل الجانب الزجاجي المطلي في مركز جهاز الطرد المركزي، وبدء الطرد المركزي في 335.4 مرات ز لمدة أربع دقائق.عندما يعود المحرك إلى الصفر، بعد خمس دقائق تقريبًا، انقر فوق حفظ على اللوحة الأمامية. استخدم ملاقط بعناية لنقل عينة واحدة من المحرك إلى حامل جهاز الطرد المركزي. تطبيق قوة أقوى عن طريق زيادة سرعة الطرد المركزي من قبل 100 دورة في الدقيقة أو حجم خطوة مماثلة.تبادل العينة للطرد المركزي. عملية بالتناوب لزيادة القوة تدريجيا في كل مرة. يتم الحصول على طيف قوة كاملة بعد 10 إلى 12 نقطة بيانات.عند الانتهاء من جميع التجارب المخطط لها، قم بإيقاف تشغيل المعدات، والإجراءات في ترتيب عكسي كما تم تشغيلها. إزالة العينات من حامل، وتزج بها في الإيثانول لتنظيف واستخدامها في المستقبل. تنظيف حامل العينة مع الأسيتون في حالة التلوث حبة المغناطيسي.في هذا البروتوكول، تم شل عمل مجمع الريبوسوم على السطح، عبر نهاية الخمسة وزراء من مرنا، وجعل كلا من خمسة prime و ثلاثة prime الجانب يسهل الوصول إليه لحكام الحمض النووي التحقيق. عندما كان الرابط للجانب خمسة prime أطول من 50 thymine ، تم الكشف عن إشارة مغناطيسية قوية ، مما يشير إلى تكوين ناجح للحمض النووي / مرنا دوبليكس. من خلال تغيير عدد النيوكليوتيدات على الحمض النووي، تم تحقيق ارتباط قوة الانفصام بطول مزدوج لالجوانب الثلاثة الرئيسية وخمسة رؤساء، على التوالي.تظهر نتائج النقل الطبيعي من MF-Pre إلى MF-Post ، في غياب المضادات الحيوية ، أن الريبوسوم تحرك بواسطة ثلاث نيوكليوتيدات باتجاه الطرف الثلاثي على كلا الجانبين. MF-Pre حمل متشرد fMet-tRNA والفينيلالانين-رن في موقع P و A, على التوالي, في حين نفذت MF-Post fMet-tRNA والفينيلالانين-رن في موقع E و P, على التوالي, مع موقع شاغر A. ومع ذلك، عندما كانت كل من حمض الفوسيد والمضادات الحيوية adiomycin موجودة، انتقلت الريبوسوم بواسطة نوكليوتيد واحد فقط في الجانب خمسة رئيس ولكن اثنين من النيوكليوتيدات في الجانب ثلاثة رئيس.بعد غسل المضادات الحيوية ، حدث النقل الطبيعي ، كما يتضح من ثلاث حركات نووكليوتيد من كل من الجانبين الخمسة وثلاثة رؤساء الوزراء. عند مغنطة العينة، يجب أن يقترب السطح المطلي ويترك المغناطيس عمودياً. وإزالة الجسيمات المغناطيسية غير محددة محددة جداً مهمة لدقة البيانات وجودتها.توفر تقنيتنا دقة عالية وطريقة قابلة للتطبيق بشكل عام للتحقيق في النزوح الجزيئي للحمض النووي الذي يصادف على نطاق واسع في البيولوجيا الجزيئية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

جزيء واحدة سوبر قرار تصوير فوسفتيدلينوستول 4،5-bisphosphate في غشاء البلازما مع رواية المسابر نيون

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

على نطاق الجينوم الكمي للترجمة في مهدها الخميرة بالتنميط الريبوسوم

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

تحديد إذا كان الحمض النووي ملطخة "سينين صبغ يمكن هضمها" مع إنزيمات التقييد

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

قياس الألوان فحوصات من داخل الخلايا لاكتات الصغيرة وبيروفات في السلكية ايليجانس كاينورهابديتيس

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

تصحيح التجارب المطبعية ومقايسة إصلاح الحمض النووي باستخدام ملحق النوكليوتيدات واحدة واستخدام TOF تحليل الطيف الكتلي

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا البطانية في الجسم الحي

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

الحمض النووي الاعتراف تسلسل بواسطة الحمض النووي البدائي باستخدام عاليه الانتاجيه البدائية التنميط

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

جزيء واحد فلورسينس دراسة نقل الطاقة من تخليق البروتين ريبوسوم

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

التحليل الطيفي المزدوج اللون للفلورسين المترابط لدراسة التفاعل بين البروتين والبروتين وديناميكيات البروتين في الخلايا الحية

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

التحليل الطيفي للقرص المضغوط لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي والبروتين

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...