Name: dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution
Uploaded: 2019-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution at JoVE.com

Dette arbejde støttes af de amerikanske National Institutes of Health (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. anerkender støtte fra Welch Foundation (E-1721).

1. klargøring af ribosom komplekser
<ol><li>1.000 mL TAM10 buffer, som består af 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM mg (OAc)2, 30 mm NH4CL, 70 mm KCL, 5 mm EDTA, 7 mm BME (2-mercaptoethanol) og 0,05% Tween20.</li>
	<li>De fem blandinger, der er anført i tabel 1, forberedes. Bemærk: ribosom var fra MRE600 stamme11. EF-Tu: forlængelse af elongations faktoren Thermo unstable. EF-TS: forlængelse faktor Thermo stable. GTP: Guanosintrifosfat. PEP: phospho (e...

<ol>
	<li>Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structural+dynamics+in+translocation:+yet+another+functional+role+for+ribosomal+RNA.">Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA.</a> Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).</li><li>Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+ribosome+hands+the+A-site+tRNA+to+the+P+site+during+EF-G-catalyzed+translocation.">How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation.</a> Science. 345, 1188-1191 (2014).</li><li>Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual-luciferase+reporter+system+for+studying+recoding+signals.">A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals.</a> RNA. 4, 479-486 (1998).</li><li>Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+-2+frameshifting+by+mammalian+ribosomes+to+synthesize+an+additional+arterivirus+protein.">Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).</li><li>Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+excursions+during+mRNA+translocation+mediate+broad+branching+of+frameshift+pathways.">Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways.</a> Cell. 160, 870-881 (2015).</li><li>Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages.">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pathways+of+-1+translational+frameshifting.">Dynamic pathways of -1 translational frameshifting.</a> Nature. 512, 328-332 (2014).</li><li>De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined+and+sequence-specific+noncovalent+binding+forces+of+DNA.">Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA.</a> Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).</li><li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+DNA+rulers+reveal+an+"mRNA+looping"+intermediate+state+during+ribosome+translocation.">Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation.</a> RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).</li><li>Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+"-1"+and+"-2"+ribosomal+frameshiftings+revealed+by+force+spectroscopy.">High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).</li><li>Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center.">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).</li><li>Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+atomic+magnetometer+at+body+temperature+for+magnetic+particle+imaging+and+nuclear+magnetic+resonance.">Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance.</a> Optics Letters. 35, 661-663 (2010).</li><li>Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range,+high-resolution+magnetic+imaging+of+nanoparticles.">Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).</li><li>Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+structure+controls+and+directs+mRNA+entry,+translocation+and+exit+dynamics.">The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics.</a> Physical Biology. 5, 046005 (2008).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+uses+two+active+mechanisms+to+unwind+messenger+RNA+during+translation.">The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation.</a> Nature. 475, 118-121 (2011).</li><li>Jacks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ribosomal+frameshifting+in+HIV-1+gag-pol+expression.">Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression.</a> Nature. 331, 280-283 (1988).</li><li>Schuwirth, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+bacterial+ribosome+at+3.5+&#197;+resolution.">Structures of the bacterial ribosome at 3.5 &#197; resolution.</a> Science. 310, 827-834 (2005).</li><li>Jia, H., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+force+spectroscopy+reveals+ribosomal+motion+at+sub-nucleotide+steps.">Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps.</a> Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).</li></ol>

I vores dobbelte lineal analyse spiller de magnetiske perler to vigtige roller. For det første tjener de som krafttransducere, fordi centrifugal kraften er proportional med deres kraftige masse. For det andet er perlerne signal bærere detekteret af en atomisk magnetometer, som i øjeblikket er den mest nøjagtige magnetiske sensor. Ved at kombinere mekanisk manipulation og magnetisk detektion er virksomhedernes teknik i stand til at løse et stort antal molekylære interaktioner baseret på deres kritiske dissociations...

Biomolekyler forskydning er en grundlæggende parameter i studiet af mekanismen for de relaterede biologiske funktioner. Et særligt eksempel er ribosom translokation1,2, hvor ribosom bevæger sig med præcis tre nukleotider (NT) på Messenger RNA (mRNA) normalt, og af en, to, eller andre numre af NT undtagen tre i tilfælde af frameshifting. Derfor kræves der et molekyle lineal system med en enkelt NT-opløsning for at skelne mellem de forskellige trinstørrelser. En større udfordring er at afprøve ribosom-bevægelsen på både indgangs-og udgangs siderne. Med andre ord, kun med en dual lineal system vil vi være i stand til at afsløre, om mRNA er jævnt gevind gennem ribosome, eller der er mellemliggende trin, hvor de to sider har forskellige trinstørrelser fører til en knæk eller loopes mRNA konstellation inde i ribosom.
Flere metoder er blevet udviklet for at løse den første udfordring at løse forskellige trin på exit siden af ribosom (den 3 ' ende af mRNA). Den dobbelte der-analyse løser de forskellige læse rammer ved at måle forholdet mellem de resulterende forskellige proteiner3,4. Det gælder kun for den 3 ' ende af mRNA og dermed utilstrækkelig til at give et komplet billede af translokation. Massespektrometri kan analysere de forskellige peptidfragmenter som følge af den tilsvarende kode omarrangementerne5. Men det kan ikke lokalisere, hvor mange NT ribosom bevæger sig på mRNA. Den toe-Printing assay er en anden almindelig metode, der bruger en reverse transkriptase primet på 3 '-distale ende at transskribere mRNA mod ribosom6. Men, det er ikke relevant for 5 ' ende af mRNA, der går ind i ribosome. Andre teknikker, herunder enkelt molekyle tilgange og fluorescens metoder7, er vanskelige at opnå enkelt-NT opløsning.
Vi har udviklet Dual DNA lineal assay, der entydigt kan bestemme både indgangs-og udgangspositionen for den udækkede mRNA i ribosome-mRNA-komplekser.  Linealen DNAs er DNA-oligomerer, der danner duplexer af visse antal basepairs (BP) med mRNA afdækket af ribosome, uanset hvilken ende af mRNA. BP-numrene afslører derefter præcist ribosom-positionen på mRNA under translokation. Antallet af BP-numre på duplexet bestemmes af deres kritiske dissociations kræfter opnået fra kraft-induceret rest magnetiserings spektroskopi (firmaer)8. Med 2-3 pN Force usikkerhed, de kritiske kræfter er tilstrækkelige til at tilbyde single-NT opløsning. Ved at implementere et linker molekyle på DNA-linealerne, kan den sterically hindrede side af mRNA af ribosom være probed. Forskellige ribosomale forskydninger kan således løses nøjagtigt. Vi har med succes afsløret en unik loopes konstellation af mRNA fanget af antibiotika under omplacering9, og løst forskellige læse rammer, der sameksisterede på en glat mRNA sekvens10. Denne artikel beskriver detaljerne i den dobbelte lineal analyse, som omfatter fremstilling af ribosom komplekser, overfladefunktionalisering af glas diasene, immobilisering af ribosom komplekser og deres hybridisering med magnetisk mærket DNA lineal molekyler, magnetisk detektion og Force Spectrum analyse af virksomheder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1412px;" width="1411">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Styrene Strip</td>
			<td style="width:239px;">City of Industry</td>
			<td style="width:161px;">MS-861</td>
			<td style="width:795px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:217px;">Glass slides</td>
			<td style="width:239px;">Evaporated Coatings</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>60.0 &#215; 4.0 &#215; 0.3 mm3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A6283-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
			<td style="width:239px;">UCT specialties</td>
			<td style="width:161px;">21400088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mPEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">154-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Biotin-PEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">152-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Epoxy glue</td>
			<td style="width:239px;">Devcon</td>
			<td style="width:161px;">31345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Fusidic Acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">F0756-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Neomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1458009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Viomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1715000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:239px;">invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Magnesium acetate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M5661-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Ammonium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">EDTA</td>
			<td style="width:239px;">GIBCO</td>
			<td style="width:161px;">774750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M6250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tween20</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">GTP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8877-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">PEP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P7127-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Pyruvate Kinase</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1506-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mRNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">133899727</td>
			<td>5&#8242;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3&#8242;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468630</td>
			<td>3&#697;- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">164845370</td>
			<td>3&#697;-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468628</td>
			<td>3&#697;-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">163472705</td>
			<td>3&#697;-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678130</td>
			<td>3&#697;-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678131</td>
			<td>3&#697;-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678132</td>
			<td>3&#697;-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678133</td>
			<td>3&#697;-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Micro Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Hitachi</td>
			<td style="width:161px;">CS150FNX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">VM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Laser</td>
			<td style="width:239px;">Newport</td>
			<td style="width:161px;">TLB-6918-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Function generator</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">DS345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Photo detectors</td>
			<td style="width:239px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:161px;">DET36A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution

Den ribosom translokation refererer til ribosomale bevægelse på mRNA ved præcis tre nukleotider (NT), som er det centrale skridt i proteinsyntesen. For at undersøge sin mekanisme er der to væsentlige tekniske krav. Først er en enkelt-NT opløsning, der kan løse normal translokation fra frameshifting, hvor ribosom bevæger sig med andre end 3 NT. Den anden er evnen til at sonde både indgangen og exit sider af mRNA for at belyse hele billedet af translokation. Vi rapporterer Dual DNA lineal assay, der er baseret på de kritiske dissociation kræfter af DNA-mRNA duplexer, opnået ved kraft-induceret rest magnetisering spektroskopi (virksomheder).  Med 2-4 pN Force resolution er Dual lineal analysen tilstrækkelig til at skelne mellem forskellige translokation trin. Ved at implementere en lang linker på sondering DNAS, kan de nå mRNA på den modsatte side af ribosome, således at mRNA position kan bestemmes for begge sider. Derfor er Dual lineal assay unikt egnet til at undersøge ribosom translokation, og nukleinsyre bevægelse i almindelighed. Vi viser repræsentative resultater, som indikerede en loopes mRNA-konstellation og løste normal translokation fra frameshifting.

Figur 1 viser detekterings ordningen og fotografier af de vigtigste komponenter. Magnetisk detektion opnås ved et atomisk magnetometer ved hjælp af scannings skemaet (figur 1A)13. Prøven anbringes på en stang monteret på en lineær motor. Motoren transporterer prøven til den atomare sensor inde i et magnetisk skjold, derefter tilbage til det oprindelige sted for losning. Atomic magnetometer detekterer det magnetiske...

Watch this Scientific Journal Video about Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution at JoVE.com

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Dual DNA lineal assay er udviklet til at bestemme mRNA position under ribosom translokation, som bygger på dissociations kræfterne af de dannede DNA-mRNA duplexer. Med single-nucleotid opløsning og evne til at nå begge ender af mRNA, det kan give mekanistisk indsigt for ribosom translokation og sonde andre nukleinsyre fordrivelser.

Dual DNA-linealer til at studere mekanismen af Ribosome translokation med enkelt-nukleotid opløsning

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Den dobbelte DNA lineal assay kan give mekanistisk indsigt for ribosom translokation og sonde andre nukleinsyre forskydninger. Vores dobbelte DNA lineal analyse er i øjeblikket den eneste metode, der objektivt kan sonde både indgangen og udgangen sider af mRNA i ribosom komplekser med enkelt-nukleotid opløsning. Lignende metoder anvendes også til at måle DNA-bindende styrke og selektivitet af kemoterapieutiske lægemidler.Visuel demonstration af metoden er en god chance for os til intuitivt at vise fordelene ved vores teknik og hjælpe andre forskere til yderligere at udvikle det til flere applikationer. Til at begynde, lave en plastik prøve godt med en styren strimmel ved at bore en terning i midten med dimensioner på fire millimeter med tre millimeter med to millimeter. Derefter ved hjælp af epoxy, lim et stykke biotin-belagt glas, på cirka fem millimeter lang, til den nederste overflade.Der tilsættes 20 mikroliter på 0,25 mg pr. milliliter streptavidin vandig opløsning i prøvebrønden, og inkuberes ved stuetemperatur i 40 minutter. Skyl derefter prøven godt to gange med TAM10 buffer. For at immobilisere ribosom komplekser uden antibiotika, først fjerne bufferen fra prøven godt, og tilsæt 20 mikroliter af 0,1 mikromolar MF-Pre eller MF-Post ribosom kompleks i prøven godt.Inkuber ved 37 grader Celsius i en time, og skyl derefter én gang med TAM10 buffer. Ribosomkomplekset binder nu med streptavidin på overfladen via den fem-prime ende biotin på mRNA. Til forsøget med antibiotika inkuberes ni mikroliter af MF-Pre-komplekset med en mikroliter på fire millimolar neomycin, 37 grader Celsius i 10 minutter.Derefter kombineres i et rør 0,6 mikroliter af 60 mikromolar EFG, 0,8 mikroliter af 100 mikromolar GTP, 0,8 mikroliter af 100 millimolar PEP, 0,3 mikroliter på 1,3 milligram pr. milliliter pyruvatkinase, 6,43 mikroliter TAM10 buffer og en mikroliter på fem millimolar fusidinsyre. Inkubere ved 37 grader Celsius i 20 minutter. Derefter kombinere de to blandinger, og inkubere ved 37 grader Celsius i yderligere fem minutter.De andre antibiotikaforsøg udføres på samme måde med koncentrationer på 0,2 millimolar viomycin, 0,4 millimolar hygromycin B og 0,25 millimolar fusidinsyre. For rammeskiftende undersøgelse gentages inkubationen for MFNF-Pre-komplekserne, der involverer det glatte motiv, U6A. Medtag antibiotika af fusidinsyre plus neomycin.Der er tilstrækkelig tid til at sikre, at hybridiseringsprocessen er afsluttet. Det anbefales også at bruge TAM10 buffer med faktiske en muldvarp natriumchlorid til at opretholde en homosteady system. Efter inkubation fjernes bufferen fra prøveblyt.Tilføj 20 mikroliter af en mikromolar biotinyleret sondering DNA streng, og inkubere ved stuetemperatur natten over. Om morgenen skylles den dannede DNA/mRNA-duplex én gang med TAM10-buffer. Fjern bufferen fra prøvebuffeten.Derefter tilsættes 20 mikroliter på 0,5 milligram pr. milliliter streptavidin-belagte magnetiske perler i prøven godt, og inkuberes ved stuetemperatur i to timer. Derefter anbringes prøven forsigtigt godt i en holder, og den anbringes i en centrifuge for at fjerne de frie magnetiske partikler fra overfladen ved 84 gange g i fem minutter. Tænd for laseren.Tryk derefter på tænd/sluk-knappen. Juster følsomheden til 500 millivolt, og vent i ca. to timer for at varme op og stabilisere atommagnetometeret. Hvis du vil konfigurere atommagnetometeret, skal du køre instrumentkontrolsoftwaren og indstille tilstanden Motors bevægelige tilstand til Støj og standardposition til nul.Tryk på Lås på frontpanelet. Juster følsomheden tilbage til 200 millivolt. Juster laserens strøm og spænding, og find den korrekte resonanstop og signal-støj-niveau for at opnå den bedste signalopløsning.Tryk på Oprydning på frontpanelet. Sørg for, at amplitude-til-bredde-forholdet er over 0,5, og at faseværdien er mindre end fem grader med bredde på mindre end 170 hertz. Tilslut udgangen af en anden SR530 lock-in forstærker til feedback af laseren til at låse sin frekvens.Tilslut funktion generator ATF20B til input en firkantet bølge af 500 millivolts peak til top, 100 millihertz som referencesignal for at konvertere strøm til magnetisk signal. Tag derefter funktionsgeneratoren ud. Konfigurer tilstanden Motor moving til Tovejs- og standardposition til 260 millimeter.Kontroller temperaturregulatorens status for at sikre, at temperaturen er på ca. 37 grader Celsius, af atomsensoren. Kontroller hele systemets stabilitet to gange ved at køre programmet direkte uden at lægge prøverne til at måle signalerne fra den tomme prøveholder. For at magnetisere prøverne, forsigtigt bruge pincet til at tage prøven ud af holderen, og sted på magnetisering fase i to minutter.Prøven anbringes derefter tilbage i prøveholderen og centrifugeres ved 335,4 gange g i 20 minutter. Fjern de uspecifikke bundne magnetiske partikler. Prøven læsses derefter på motoren med en pincet.Klik på Lås på frontpanelet for at køre programmet. Brug i mellemtiden en pincet til at lægge en anden prøve i holderen og placere den i centrifugen. Gør den belagte glas side vender midten af centrifugen, og start centrifugering på 335,4 gange g i fire minutter.Når motoren kommer tilbage til nul, efter cirka fem minutter, skal du klikke på Gem på frontpanelet. Brug forsigtigt en pincet til at overføre en prøve fra motoren til centrifugeholderen. Påfør en stærkere kraft ved at øge centrifugalhastigheden med 100 omdr./min. eller en lignende trinstørrelse.Udbyr prøven til centrifugen. Proces skiftevis for gradvist at øge kraften hver gang. Et komplet kraftspektrum opnås efter 10 til 12 datapunkter.Når alle planlagte eksperimenter er færdige, skal du slukke for udstyret og fortsætte i den modsatte rækkefølge, som det blev slået til. Fjern prøverne fra holderen, og nedsænkes i ethanol til rengøring og fremtidig brug. Rengør prøveholderen med acetone i tilfælde af magnetisk perleforurening.I denne protokol blev ribosomkomplekset immobiliseret på overfladen via den fem-prime ende af mRNA, og gjorde både de fem-prime og tre-prime side let tilgængelige for sonderende DNA linealer. Når linker til de fem-prime side var længere end 50 thymin, et stærkt magnetisk signal blev opdaget, hvilket indikerer en vellykket dannelse af DNA / mRNA duplexes. Ved at variere antallet af nukleotider på DNA, blev korrelationen af dissociation kraft til duplex længde opnået for de tre-prime og fem-prime sider, henholdsvis.Resultaterne af normal translokation fra MF-Pre til MF-Post, i mangel af antibiotika, viser, at ribosom flyttet af tre nukleotider mod de tre-prime ende på begge sider. MF-Pre bar en vagrant fMet-tRNA og phenylalanin-tRNA på henholdsvis P og A-stederne, mens MF-Post bar fMet-tRNA og phenylalanin-tRNA på henholdsvis E- og P-stederne med en ledig A-plads. Men når både fusidinsyre og adiomycin antibiotika var til stede, ribosom flyttet af kun én nukleotid på fem-prime side, men to nukleotider på tre-prime side.Efter vask væk antibiotika, normal translokation opstod, som det fremgår af tre nukleotid bevægelser fra både de fem-prime og tre-prime sider. Når prøven magnetiseres, skal den belagte overflade nærme sig og lade magneten være lodret. Og fjernelse af de uspecifikke bundne magnetiske partikler er meget vigtigt for data nøjagtighed og kvalitet.Vores teknik giver en høj opløsning og en generelt anvendelig måde at undersøge molekylær forskydning af nukleinsyre, som er almindeligt stødt på i molekylærbiologi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Single-molekyle Super-resolution Imaging af Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat i plasmamembranen med Novel fluorescerende prober

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide kvantificering af oversættelse i spirende gær af ribosomet profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Bestemmelse, hvis DNA farves med en Cyanine farvestof kan fordøjes med restriktionsenzymer

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Små kolorimetriske Assays af intracellulære laktat og pyruvat i at ødelægge Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlæsning og DNA reparation analyse ved hjælp af Single Nucleotide udvidelse og MALDI-TOF-massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Oversættelse af Ribosome affinitets rensning (TRAP) for RNA-isolation fra endotelceller in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sekvens genkendelse af DNA Primase ved hjælp af Primase profilering med høj gennemløb

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enkeltmolekyle fluorescens energioverførsel undersøgelse af ribosom proteinsyntese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Dual-Color Fluorescens Krydskorrelation Spektroskopi til undersøgelse protein-protein interaktion og protein dynamik i levende celler

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

CD-spektroskopi til undersøgelse af DNA-proteininteraktioner

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...