Name: dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution
Uploaded: 2019-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution at JoVE.com

Dit werk wordt gesteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. erkent de steun van de Welch Foundation (E-1721).

1. bereiding van de ribosoom complexen
<ol><li>Maak 1.000 mL TAM10-buffer, die bestaat uit 20 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM mg (OAc)2, 30 mm NH4cl, 70 mm KCl, 5 mm EDTA, 7 mm BME (2-mercaptoethanol) en 0,05% Tween20.</li>
	<li>Bereid de vijf in tabel 1genoemde mengsels voor. Opmerking: het ribosoom was van de MRE600 stam11. EF-TU: rek factor Thermo onstabiel. EF-TS: rek factor Thermo stabiel. GTP: calciumguanosine trifosfaat. PEP: fosho (ENOL) pyruvate.</l...

<ol>
	<li>Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structural+dynamics+in+translocation:+yet+another+functional+role+for+ribosomal+RNA.">Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA.</a> Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).</li><li>Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+ribosome+hands+the+A-site+tRNA+to+the+P+site+during+EF-G-catalyzed+translocation.">How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation.</a> Science. 345, 1188-1191 (2014).</li><li>Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual-luciferase+reporter+system+for+studying+recoding+signals.">A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals.</a> RNA. 4, 479-486 (1998).</li><li>Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+-2+frameshifting+by+mammalian+ribosomes+to+synthesize+an+additional+arterivirus+protein.">Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).</li><li>Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+excursions+during+mRNA+translocation+mediate+broad+branching+of+frameshift+pathways.">Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways.</a> Cell. 160, 870-881 (2015).</li><li>Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages.">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pathways+of+-1+translational+frameshifting.">Dynamic pathways of -1 translational frameshifting.</a> Nature. 512, 328-332 (2014).</li><li>De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined+and+sequence-specific+noncovalent+binding+forces+of+DNA.">Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA.</a> Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).</li><li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+DNA+rulers+reveal+an+"mRNA+looping"+intermediate+state+during+ribosome+translocation.">Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation.</a> RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).</li><li>Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+"-1"+and+"-2"+ribosomal+frameshiftings+revealed+by+force+spectroscopy.">High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).</li><li>Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center.">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).</li><li>Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+atomic+magnetometer+at+body+temperature+for+magnetic+particle+imaging+and+nuclear+magnetic+resonance.">Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance.</a> Optics Letters. 35, 661-663 (2010).</li><li>Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range,+high-resolution+magnetic+imaging+of+nanoparticles.">Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).</li><li>Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+structure+controls+and+directs+mRNA+entry,+translocation+and+exit+dynamics.">The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics.</a> Physical Biology. 5, 046005 (2008).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+uses+two+active+mechanisms+to+unwind+messenger+RNA+during+translation.">The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation.</a> Nature. 475, 118-121 (2011).</li><li>Jacks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ribosomal+frameshifting+in+HIV-1+gag-pol+expression.">Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression.</a> Nature. 331, 280-283 (1988).</li><li>Schuwirth, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+bacterial+ribosome+at+3.5+&#197;+resolution.">Structures of the bacterial ribosome at 3.5 &#197; resolution.</a> Science. 310, 827-834 (2005).</li><li>Jia, H., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+force+spectroscopy+reveals+ribosomal+motion+at+sub-nucleotide+steps.">Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps.</a> Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).</li></ol>

In onze dubbele liniaal testspelen de magnetische kralen twee essentiële rollen. Ten eerste dienen ze als de kracht transducers omdat de centrifugale kracht evenredig is aan hun drijvende massa. Ten tweede, de parels zijn signaal dragers gedetecteerd door een atomaire magnetometer, die momenteel de meest nauwkeurige magnetische sensor. Door mechanische manipulatie en magnetische detectie te combineren, kan de techniek van de FIRMA'S een groot aantal moleculaire interacties oplossen op basis van hun kritische dissociatie...

Biomoleculaire verplaatsing is een fundamentele parameter bij het bestuderen van het mechanisme van de verwante biologische functies. Een specifiek voorbeeld is de ribosoom translocatie1,2, waarbij het ribosoom beweegt door exact drie nucleotiden (NT) op het boodschapper-RNA (mRNA) normaal, en door één, twee of andere nummers van NT behalve drie in het geval van frameshifting. Daarom is een moleculaire liniaal systeem single-NT-resolutie vereist om onderscheid te maken tussen de verschillende stapgroottes. Een grotere uitdaging is om de ribosoom beweging op zowel de ingangs-als de uitgangszijde te sonde. Met andere woorden, alleen met een dubbele liniaal systeem zullen we in staat zijn om te onthullen of de mRNA soepel door het ribosome is verbonden, of er zijn tussenliggende stappen waarbij de twee zijden verschillende stap maten hebben die leiden tot een knikte of lus mRNA-conformatie in de ribosoom.
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om de eerste uitdaging aan te pakken bij het oplossen van verschillende stappen aan de uitgang van het ribosoom (het 3 ' uiteinde van de mRNA). De dubbele plaats-assay lost de verschillende Lees frames op door de verhoudingen van de resulterende verschillende eiwitten3,4te meten. Het is alleen van toepassing voor het 3 ' einde van de mRNA en dus onvoldoende om een volledig beeld van translocatie te bieden. Massaspectrometrie kan de verschillende peptide fragmenten analyseren als gevolg van de overeenkomstige code herschikkingen5. Maar het kan niet aangeven hoeveel NT het ribosoom beweegt op de mRNA. De toe-Printing test is een andere veelgebruikte methode die een reverse transcriptase gebruikt die op het 3 '-distale uiteinde wordt geprimeerd om de mRNA in de richting van het ribosoom6te transcriberen. Het is echter niet van toepassing op het 5 ' einde van mRNA dat het ribosome binnenkomt. Andere technieken, waaronder enkelvoudige molecuul benaderingen en fluorescentie methoden7, zijn moeilijk te bereiken met een enkele NT-resolutie.
We hebben de dubbele DNA-liniaal test ontwikkeld die op unieke wijze zowel de ingangs-als uitgangsposities van de ongedekte mRNA in ribosome-mRNA-complexen kan bepalen.  De liniaal-Dna's zijn DNA-oligomeren die duplexen vormen van bepaalde aantallen baseparen (BP) met de mRNA die door het ribosome worden blootgelegd, ongeacht welk uiteinde van de mRNA. De BP-nummers onthullen dan precies de ribosoom positie op de mRNA tijdens translocatie. De BP-nummers van de Duplexen worden bepaald door hun kritische dissociatie krachten verkregen uit door kracht geïnduceerde overblijfsel magnetisatie spectroscopie (firma's)8. Met 2-3 pN-kracht onzekerheid zijn de kritische krachten voldoende om single-NT-resolutie aan te bieden. Door het implementeren van een linker molecuul op de DNA-linialen, kan de sterisch-belemmerde zijde van de mRNA door het ribosoom worden geprobed. Verschillende ribosomale verplaatsingen kunnen dus nauwkeurig worden opgelost. We hebben met succes onthuld een unieke lus conformatie van mRNA gevangen door antibiotica tijdens translocatie9, en opgelost verschillende Lees kaders die naast elkaar bestonden op een gladde mRNA sequentie10. Dit artikel beschrijft de details van de dubbele liniaal Assay, waaronder de voorbereiding van de ribosoom complexen, oppervlakte functionalisatie van de glasplaten, immobilisatie van de ribosoom complexen en hun hybridisatie met magnetisch gelabelde DNA-liniaal moleculen, magnetische detectie en kracht spectrum analyse door bedrijven.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1412px;" width="1411">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Styrene Strip</td>
			<td style="width:239px;">City of Industry</td>
			<td style="width:161px;">MS-861</td>
			<td style="width:795px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:217px;">Glass slides</td>
			<td style="width:239px;">Evaporated Coatings</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>60.0 &#215; 4.0 &#215; 0.3 mm3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A6283-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
			<td style="width:239px;">UCT specialties</td>
			<td style="width:161px;">21400088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mPEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">154-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Biotin-PEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">152-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Epoxy glue</td>
			<td style="width:239px;">Devcon</td>
			<td style="width:161px;">31345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Fusidic Acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">F0756-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Neomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1458009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Viomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1715000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:239px;">invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Magnesium acetate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M5661-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Ammonium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">EDTA</td>
			<td style="width:239px;">GIBCO</td>
			<td style="width:161px;">774750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M6250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tween20</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">GTP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8877-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">PEP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P7127-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Pyruvate Kinase</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1506-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mRNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">133899727</td>
			<td>5&#8242;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3&#8242;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468630</td>
			<td>3&#697;- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">164845370</td>
			<td>3&#697;-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468628</td>
			<td>3&#697;-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">163472705</td>
			<td>3&#697;-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678130</td>
			<td>3&#697;-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678131</td>
			<td>3&#697;-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678132</td>
			<td>3&#697;-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678133</td>
			<td>3&#697;-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Micro Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Hitachi</td>
			<td style="width:161px;">CS150FNX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">VM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Laser</td>
			<td style="width:239px;">Newport</td>
			<td style="width:161px;">TLB-6918-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Function generator</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">DS345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Photo detectors</td>
			<td style="width:239px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:161px;">DET36A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution

De ribosoom translocatie verwijst naar de ribosomale beweging op de mRNA door exact drie nucleotiden (NT), wat de centrale stap is in de eiwitsynthese. Om het mechanisme te onderzoeken zijn er twee essentiële technische vereisten. Ten eerste is een single-NT-resolutie die normale translocatie van frameshifting kan oplossen, waarbij het ribosoom met andere dan 3 NT beweegt. De tweede is de mogelijkheid om te sonde zowel de ingang en de uitgang van de zijden van mRNA om het hele beeld van translocatie te verhelderdateren. We rapporteren de dubbele DNA-liniaal test die is gebaseerd op de kritische dissociatie krachten van DNA-mRNA-duplexen, verkregen door kracht-geïnduceerde overblijfsel magnetisatie spectroscopie (firma's).  Met 2-4 pN Force Resolution is de dubbele liniaal test voldoende om verschillende translocatie stappen te onderscheiden. Door een lange linker op de indringende dna's te implementeren, kunnen ze de mRNA aan de andere kant van het ribosome bereiken, zodat de mRNA-positie voor beide zijden kan worden bepaald. Daarom is de dubbele liniaal test uniek geschikt om de ribosoom translocatie en nucleïnezuur beweging in het algemeen te onderzoeken. We tonen representatieve resultaten die een lus mRNA-conformatie en een opgeloste normale translocatie van frameshifting hebben aangegeven.

Figuur 1 toont het detectie schema en de foto's van de belangrijkste componenten. Magnetische detectie wordt bereikt door een atomische magnetometer met behulp van het scanschema (Figuur 1A)13. Het monster wordt geplaatst op een staaf gemonteerd op een lineaire motor. De motor vervoert het monster naar de atoom sensor in een magnetisch schild en vervolgens terug naar de oorspronkelijke locatie voor het lossen. De atomisch...

Watch this Scientific Journal Video about Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution at JoVE.com

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Dubbele DNA-liniaal assay is ontwikkeld om de mRNA-positie tijdens ribosoom translocatie te bepalen, die afhankelijk is van de dissociatie krachten van de gevormde DNA-mRNA-duplexen. Met single-nucleotide resolutie en mogelijkheid van het bereiken van beide uiteinden van mRNA, het kan mechanistische inzichten bieden voor ribosoom translocatie en sonde andere nucleïnezuur verplaatsingen.

Dubbele DNA-linialen om het mechanisme van ribosome translocatie te bestuderen met single-nucleotide-resolutie

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

De dubbele DNA-liniaaltest kan mechanistische inzichten bieden voor ribosoomtranslocatie en andere nucleïnezuurverplaatsingen sonde. Onze dubbele DNA-liniaaltest is momenteel de enige methode die objectief zowel de in- als uitgangszijden van mRNA in de ribosoomcomplexen met single-nucleotideresolutie kan onderzoeken. Soortgelijke methoden worden ook toegepast om DNA-bindingssterkte en selectiviteit van chemotherapeutische geneesmiddelen te meten.Visuele demonstratie van de methode is een goede kans voor ons om intuïtief de voordelen van onze techniek te laten zien en andere onderzoekers te helpen om deze verder te ontwikkelen tot meer toepassingen. Om te beginnen, maak een plastic monster goed met een styreen strip door het boren van een kubus in het midden met afmetingen van vier millimeter door drie millimeter door twee millimeter. Dan, met behulp van epoxy, lijm een stuk biotine gecoate glas, van ongeveer vijf millimeter lang, aan de onderkant.Voeg 20 microliter van 0,25 milligram per milliliter streptavidin waterige oplossing in het monster goed, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten. Spoel het monster vervolgens twee keer goed af met TAM10 buffer. Om de ribosoomcomplexen zonder antibiotica te immobiliseren, moet u eerst de buffer goed uit het monster verwijderen en 20 microliter van 0,1 micromolar MF-Pre of MF-Post ribosoomcomplex in de monsterput toevoegen.Incubeer op 37 graden Celsius gedurende een uur, en spoel dan een keer met TAM10 buffer. Het ribosoom complex bindt nu met de streptavidin op het oppervlak via de vijf-prime end biotine op het mRNA. Voor het experiment met behulp van antibiotica, incubeer negen microliters van de MF-Pre complex met een microliter van vier millimolar neomycine, 37 graden Celsius gedurende 10 minuten.Combineer vervolgens in een buis 0,6 microliter van 60 micromolar EFG, 0,8 microliter van 100 micromolar GTP, 0,8 microliter van 100 millimolar PEP, 0,3 microliter van 1,3 milligram per milliliter pyruvate kinase, 6,43 microliter TAM10 buffer, en een microliter van vijf millimolar fusidic zuur. Incubeer op 37 graden Celsius gedurende 20 minuten. Combineer vervolgens de twee mengsels, en incubeer op 37 graden Celsius voor een extra vijf minuten.Voer de andere antibiotica-experimenten op dezelfde manier uit, met concentraties van 0,2 millimolar viomycine, 0,4 millimolar hygromycine B en 0,25 millimolar fusidic acid. Voor frame shifting studie, herhaal de incubatie voor de MFNF-Pre complexen waarbij het gladde motief, U6A. Inclusief antibiotica van fusidic zuur plus neomycine.Er is voldoende tijd nodig om het hybridisatieproces te voltooien. Het wordt ook aangeraden om de TAM10 buffer te gebruiken met de werkelijke een mol natriumchloride om een homosteady systeem te handhaven. Verwijder na incubatie de buffer goed uit het monster.Voeg 20 microliter van een micromolar biotinylated indringende DNA-streng, en incubeer bij kamertemperatuur 's nachts. Spoel 's ochtends de gevormde DNA/mRNA duplex één keer met TAM10 buffer. Verwijder de buffer goed uit het monster.Voeg vervolgens 20 microliter van 0,5 milligram per milliliter met streptavidin gecoate magnetische kralen toe aan het monster goed, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Steek het monster daarna voorzichtig goed in een houder en plaats het in een centrifuge om de vrije magnetische deeltjes gedurende vijf minuten op 84 keer g van het oppervlak te verwijderen. Zet de laser aan.Druk dan op de aan/uit-knop. Pas de gevoeligheid aan op 500 millivolt en wacht ongeveer twee uur om de atoommagneetometer op te warmen en te stabiliseren. Als u de atoommagneetometer wilt instellen, voert u de instrumentbesturingssoftware uit en stelt u de bewegingsmodus Van de motor in op Ruis en standaardstand op nul.Druk op Slot op het voorpaneel. Pas de gevoeligheid terug naar 200 millivolt. Pas de stroom en spanning van de laser aan en zoek de juiste resonantiepiek en signaal-naar-ruisniveau voor de beste signaalresolutie.Druk op Sweep op het voorpaneel. Zorg ervoor dat de amplitude-breedteverhouding hoger is dan 0,5 en dat de fasewaarde kleiner is dan vijf graden met een breedte van minder dan 170 hertz. Sluit de output van een andere SR530 lock-in versterker aan op de feedback van de laser om de frequentie te vergrendelen.Plug in functie generator ATF20B om een vierkante golf van 500 millivolt piek in te voeren tot piek, 100 millihertz als referentiesignaal voor het omzetten van stroom naar magnetisch signaal. Trek vervolgens de stekker uit de functiegenerator. Stel de beweegmodus Motor in op tweerichtings- en standaardstand op 260 millimeter.Controleer de status van de temperatuurregelaar, om ervoor te zorgen dat de temperatuur ongeveer 37 graden Celsius is, van de atoomsensor. Controleer twee maal de stabiliteit van het hele systeem door het programma rechtstreeks uit te voeren zonder monsters te laden om de signalen van de lege monsterhouder te meten. Om de monsters te magnetiseren, gebruik voorzichtig een pincet om het monster uit de houder te halen en twee minuten op het magnetisatiestadium te plaatsen.Zet het monster vervolgens terug in de monsterhouder en vercentrifuge gedurende 20 minuten op 335,4 keer g. Verwijder de niet-specifiek gebonden magnetische deeltjes. Laad vervolgens het monster op de motor met een pincet.Klik op Vergrendelen op het voorpaneel om het programma uit te voeren. Gebruik ondertussen een pincet om een ander monster in de houder te laden en in de centrifuge te plaatsen. Maak de gecoate glazen kant naar het midden van de centrifuge, en start de centrifugatie op 335,4 keer g gedurende vier minuten.Wanneer de motor na ongeveer vijf minuten op Opslaan op het voorpaneel komt. Gebruik voorzichtig een pincet om één monster van de motor naar de centrifugehouder over te brengen. Breng een sterkere kracht aan door de middelpuntvliedende snelheid met 100 tpm of een vergelijkbare stapgrootte te verhogen.Ruil het monster in voor de centrifuge. Proces afwisselend om geleidelijk verhogen van de kracht elke keer. Een volledig krachtspectrum wordt verkregen na 10 tot 12 gegevenspunten.Wanneer alle geplande experimenten zijn voltooid, schakelt u de apparatuur uit en gaat u in de tegenovergestelde volgorde te werk terwijl deze is ingeschakeld. Verwijder de monsters van de houder en dompel ze onder in ethanol voor reiniging en toekomstig gebruik. Reinig de monsterhouder met aceton in geval van magnetische kraalbesmetting.In dit protocol werd het ribosoomcomplex geïmmobiliseerd op het oppervlak, via het vijfprime-uiteinde van het mRNA, en maakte zowel de vijf-priemelijke als drie-priemkant gemakkelijk toegankelijk voor de indringende DNA-heersers. Toen de linker voor de vijf-priemkant langer was dan 50 thymine, werd een sterk magnetisch signaal ontdekt, wat wijst op een succesvolle vorming van DNA/mRNA duplexen. Door het aantal nucleotiden op het DNA te variëren, werd de correlatie van dissociatiekracht tot duplexlengte bereikt voor respectievelijk de drieste en vijfste-priemzijden.De resultaten van de normale translocatie van MF-Pre naar MF-Post, bij afwezigheid van antibiotica, tonen aan dat het ribosoom door drie nucleotiden naar het drievoudige kerneind aan beide zijden bewoog. MF-Pre droeg respectievelijk een vagrant fMet-tRNA en fenylalanine-tRNA op de P- en A-sites, terwijl MF-Post fMet-tRNA en fenylalanine-tRNA vervoerde op respectievelijk de E- en P-sites met een leegstaande A-site. Echter, toen zowel fusidic zuur en adiomycine antibiotica aanwezig waren, het ribosoom bewogen door slechts een nucleotide aan de vijf-prime kant, maar twee nucleotiden aan de drie-prime kant.Na het wegwassen van de antibiotica, normale translocatie opgetreden, zoals blijkt uit drie nucleotide bewegingen van zowel de vijf-prime en drie-prime kanten. Bij het magnetiseren van het monster moet het gecoate oppervlak de magneet verticaal benaderen en verlaten. En het verwijderen van de niet-specifiek gebonden magnetische deeltjes is zeer belangrijk voor de nauwkeurigheid en kwaliteit van de gegevens.Onze techniek biedt een hoge resolutie en een algemeen toepasbare manier om moleculaire verplaatsing van nucleïnezuur te onderzoeken, die op grote schaal wordt aangetroffen in de moleculaire biologie.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Single-molecule Super-resolutie beeldvorming van fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat in het plasmamembraan met Novel Fluorescerende Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Bepalen als DNA gekleurd met een Cyanine kleurstof kan worden verteerd met enzymen van de beperking

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Het vertalen van ribosome Affiniteits zuivering (TRAP) voor RNA-isolatie van endotheel cellen in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sequentie herkenning door DNA primase met behulp van high-throughput Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study van ribosoom eiwitsynthese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

CD-spectroscopie om DNA-eiwitinteracties te bestuderen

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...