Name: dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution
Uploaded: 2019-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution at JoVE.com

Diese Arbeit wird von den US National Institutes of Health (R01GM111452, Y.W., S.X.) unterstützt. Y. W. würdigt die Unterstützung durch die Welch-Stiftung (E-1721).

1. Vorbereitung der Ribosom-Komplexe
<ol><li>Machen Sie 1.000 ml TAM10 Puffer, der aus 20 mM tris-HCl (pH 7.5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-Mercaptoethanol) und 0,05% Tween20 besteht.</li>
	<li>Bereiten Sie die fünf in Tabelle 1aufgeführten Mischungen vor. HINWEIS: Das Ribosom stammt e.b. vom MRE600-Stamm11. EF-Tu: Dehnungsfaktor thermo instabil. EF-Ts: Dehnungsfaktor thermostabil. GTP: Guanosintriphosphat. PEP: Phos...

<ol>
	<li>Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structural+dynamics+in+translocation:+yet+another+functional+role+for+ribosomal+RNA.">Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA.</a> Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).</li><li>Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+ribosome+hands+the+A-site+tRNA+to+the+P+site+during+EF-G-catalyzed+translocation.">How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation.</a> Science. 345, 1188-1191 (2014).</li><li>Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual-luciferase+reporter+system+for+studying+recoding+signals.">A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals.</a> RNA. 4, 479-486 (1998).</li><li>Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+-2+frameshifting+by+mammalian+ribosomes+to+synthesize+an+additional+arterivirus+protein.">Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).</li><li>Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+excursions+during+mRNA+translocation+mediate+broad+branching+of+frameshift+pathways.">Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways.</a> Cell. 160, 870-881 (2015).</li><li>Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages.">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pathways+of+-1+translational+frameshifting.">Dynamic pathways of -1 translational frameshifting.</a> Nature. 512, 328-332 (2014).</li><li>De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined+and+sequence-specific+noncovalent+binding+forces+of+DNA.">Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA.</a> Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).</li><li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+DNA+rulers+reveal+an+"mRNA+looping"+intermediate+state+during+ribosome+translocation.">Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation.</a> RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).</li><li>Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+"-1"+and+"-2"+ribosomal+frameshiftings+revealed+by+force+spectroscopy.">High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).</li><li>Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center.">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).</li><li>Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+atomic+magnetometer+at+body+temperature+for+magnetic+particle+imaging+and+nuclear+magnetic+resonance.">Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance.</a> Optics Letters. 35, 661-663 (2010).</li><li>Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range,+high-resolution+magnetic+imaging+of+nanoparticles.">Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).</li><li>Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+structure+controls+and+directs+mRNA+entry,+translocation+and+exit+dynamics.">The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics.</a> Physical Biology. 5, 046005 (2008).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+uses+two+active+mechanisms+to+unwind+messenger+RNA+during+translation.">The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation.</a> Nature. 475, 118-121 (2011).</li><li>Jacks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ribosomal+frameshifting+in+HIV-1+gag-pol+expression.">Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression.</a> Nature. 331, 280-283 (1988).</li><li>Schuwirth, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+bacterial+ribosome+at+3.5+&#197;+resolution.">Structures of the bacterial ribosome at 3.5 &#197; resolution.</a> Science. 310, 827-834 (2005).</li><li>Jia, H., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+force+spectroscopy+reveals+ribosomal+motion+at+sub-nucleotide+steps.">Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps.</a> Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).</li></ol>

In unserem Doppelherrscher-Assay spielen die magnetischen Perlen zwei wesentliche Rollen. Erstens dienen sie als Kraftgeber, weil die Fliehkraft proportional zu ihrer Auftriebsmasse ist. Zweitens sind die Perlen Signalträger, die von einem Atommagnetometer erfasst werden, das derzeit der genaueste Magnetsensor ist. Durch die Kombination von mechanischer Manipulation und magnetischer Detektion ist die FIRMS-Technik in der Lage, eine große Anzahl molekularer Wechselwirkungen auf der Grundlage ihrer kritischen Dissoziatio...

Biomolekulare Verschiebung ist ein grundlegender Parameter bei der Untersuchung des Mechanismus der zugehörigen biologischen Funktionen. Ein besonderes Beispiel ist die Ribosomtranslokation1,2, bei der sich das Ribosom normalerweise um genau drei Nukleotide (nt) auf der Boten-RNA (mRNA) bewegt, und um eine, zwei oder andere Nt-Zahlen außer drei im Falle von Frameshifting. Daher ist eine einstellige Auflösung des molekularen Linealsystems erforderlich, um die verschiedenen Schrittgrößen zu unterscheiden. Eine größere Herausforderung besteht darin, die Ribosombewegung sowohl auf der Ein- als auch auf der Ausgangsseite zu untersuchen. Mit anderen Worten, nur mit einem Dual-Lineal-System können wir zeigen, ob die mRNA glatt durch das Ribosom gefädelt ist, oder es gibt Zwischenschritte, in denen die beiden Seiten unterschiedliche Schrittgrößen haben, die zu einer geknickten oder geschleiften mRNA-Konformation im Inneren des Ribosom.
Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um die erste Herausforderung der Lösung verschiedener Schritte auf der Austrittsseite des Ribosoms (das 3' Ende der mRNA) zu bewältigen. Der duale Luziferase-Assay löst die verschiedenen Leserahmen auf, indem er die Verhältnisse der resultierenden verschiedenen Proteine3,4misst. Sie gilt nur für das 3' Ende der mRNA und reicht daher nicht aus, um ein vollständiges Bild der Translokation zu liefern. Die Massenspektrometrie kann die verschiedenen Peptidfragmente als Folge der entsprechenden Codeumlagerungen analysieren5. Aber es kann nicht genau bestimmen, wie viele nt das Ribosom auf der mRNA bewegt. Der Zehendruck-Assay ist eine weitere gängige Methode, die eine Reverse-Transkriptase verwendet, die am 3'-distalen Ende grundiert ist, um die mRNA in Richtung des Ribosoms6zu transkribieren. Es gilt jedoch nicht für das 5' Ende von mRNA, das in das Ribosom eintritt. Andere Techniken, einschließlich Einzelmolekülansätze und Fluoreszenzmethoden7, sind schwierig, eine Single-nt-Auflösung zu erreichen.
Wir haben den Dual-DNA-Lineal-Assay entwickelt, der sowohl die Ein- als auch die Ausgangsposition der freigelegten mRNA in Ribosome-mRNA-Komplexen eindeutig bestimmen kann.  Die Lineal-DNAs sind DNA-Oligomere, die Duplexe einer bestimmten Anzahl von Basepairs (bp) bilden, wobei die mRNA vom Ribosom aufgedeckt wird, unabhängig davon, welches Ende der mRNA. Die bp-Zahlen zeigen dann genau die ribosomische Position auf der mRNA während der Translokation. Die bp-Nummern der Duplexe werden durch ihre kritischen Dissoziationskräfte bestimmt, die aus der kraftinduzierten Restmagnetisierungsspektroskopie (FIRMS)8gewonnen werden. Bei 2-3 pN-Kraftunsicherheit reichen die kritischen Kräfte aus, um eine Single-nt-Auflösung zu bieten. Durch die Implementierung eines Linkermoleküls auf den DNA-Linealen kann die sterisch behinderte Seite der mRNA durch das Ribosom untersucht werden. So lassen sich unterschiedliche ribosomale Verschiebungen genau auflösen. Wir haben erfolgreich eine einzigartige Schleifenkonformation von mRNA aufgedeckt, die von Antibiotika während der Translokation9eingeschlossen wurde, und verschiedene Leserahmen aufgelöst, die auf einer rutschigen mRNA-Sequenz10koexistierten. Dieser Artikel beschreibt die Details des Dual-Lineals-Assays, zu denen die Vorbereitung der Ribosom-Komplexe, die Oberflächenfunktionalisierung der Glasgeuken, die Immobilisierung der Ribosom-Komplexe und deren Hybridisierung mit magnetisch beschrifteten DNA-Linealen gehören. Moleküle, magnetische Detektion und Kraftspektrumanalyse durch FIRMS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1412px;" width="1411">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Styrene Strip</td>
			<td style="width:239px;">City of Industry</td>
			<td style="width:161px;">MS-861</td>
			<td style="width:795px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:217px;">Glass slides</td>
			<td style="width:239px;">Evaporated Coatings</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>60.0 &#215; 4.0 &#215; 0.3 mm3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A6283-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
			<td style="width:239px;">UCT specialties</td>
			<td style="width:161px;">21400088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mPEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">154-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Biotin-PEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">152-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Epoxy glue</td>
			<td style="width:239px;">Devcon</td>
			<td style="width:161px;">31345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Fusidic Acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">F0756-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Neomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1458009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Viomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1715000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:239px;">invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Magnesium acetate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M5661-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Ammonium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">EDTA</td>
			<td style="width:239px;">GIBCO</td>
			<td style="width:161px;">774750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M6250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tween20</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">GTP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8877-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">PEP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P7127-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Pyruvate Kinase</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1506-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mRNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">133899727</td>
			<td>5&#8242;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3&#8242;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468630</td>
			<td>3&#697;- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">164845370</td>
			<td>3&#697;-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468628</td>
			<td>3&#697;-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">163472705</td>
			<td>3&#697;-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678130</td>
			<td>3&#697;-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678131</td>
			<td>3&#697;-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678132</td>
			<td>3&#697;-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678133</td>
			<td>3&#697;-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Micro Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Hitachi</td>
			<td style="width:161px;">CS150FNX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">VM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Laser</td>
			<td style="width:239px;">Newport</td>
			<td style="width:161px;">TLB-6918-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Function generator</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">DS345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Photo detectors</td>
			<td style="width:239px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:161px;">DET36A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution

Die Ribosomentranslokation bezieht sich auf die ribosomale Bewegung auf der mRNA durch genau drei Nukleotide (nt), was der zentrale Schritt in der Proteinsynthese ist. Um seinen Mechanismus zu untersuchen, gibt es zwei wesentliche technische Anforderungen. Die erste ist die Single-nt-Auflösung, die die normale Translokation von Frameshifting auflösen kann, während der sich das Ribosom um andere als 3 nt bewegt. Die zweite ist die Fähigkeit, sowohl die Ein- als auch die Ausgangsseite von mRNA zu untersuchen, um das gesamtbildende Translokation zu erläutern. Wir berichten über den dualen DNA-Lineal-Assay, der auf den kritischen Dissoziationskräften von DNA-mRNA-Duplexen basiert, die durch kraftinduzierte Restmagnetisierungsspektroskopie (FIRMS) gewonnen werden.  Mit einer Kraftauflösung von 2-4 pN reicht der Dual-Lineal-Assay aus, um verschiedene Translokationsschritte zu unterscheiden. Durch die Implementierung eines langen Linkers auf den prüfenden DNAs können sie die mRNA auf der gegenüberliegenden Seite des Ribosoms erreichen, so dass die mRNA-Position für beide Seiten bestimmt werden kann. Daher ist der Dual-Lineal-Assay einzigartig geeignet, um die ribosomsome Translokation und Nukleinsäurebewegung im Allgemeinen zu untersuchen. Wir zeigen repräsentative Ergebnisse, die auf eine geschleifte mRNA-Konformation hindeuteten und die normale Translokation von Frameshifting auflösten.

Abbildung 1 zeigt das Erkennungsschema und die Fotos der hauptwichtigsten Komponenten. Die magnetische Detektion wird durch ein atomares Magnetometer mit dem Scanschema erreicht (Abbildung 1A)13. Die Probe wird auf einer Stange platziert, die auf einem Linearmotor montiert ist. Der Motor transportiert die Probe zum Atomsensor innerhalb eines magnetischen Schildes und dann zurück zum ursprünglichen Ort zum Entladen. Das ...

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Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Dual DNA Lineal Assay wird entwickelt, um die mRNA-Position während der ribosomen Translokation zu bestimmen, die auf den Dissoziationskräften der gebildeten DNA-mRNA-Duplexe beruht. Mit einer Single-Nukleotid-Auflösung und der Fähigkeit, beide Enden der mRNA zu erreichen, kann es mechanistische Einblicke für ribosome translokation liefern und andere Nukleinsäureverschiebungen untersuchen.

Dual DNA Lineale zur Untersuchung des Mechanismus der Ribosomentranslokation mit Single-Nukleotid-Auflösung

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Der Dual-DNA-Lineal-Assay kann mechanistische Erkenntnisse für ribosometranslokation liefern und andere Nukleinsäureverschiebungen untersuchen. Unser Dual-DNA-Lineal-Assay ist derzeit die einzige Methode, die sowohl die Ein- als auch die Ausgangsseite von mRNA in den Ribosom-Komplexen mit Single-Nukleotid-Auflösung objektiv untersuchen kann. Ähnliche Methoden werden auch angewendet, um die DNA-Bindungsfestigkeit und Selektivität von chemotherapeutischen Medikamenten zu messen.Die visuelle Demonstration der Methode ist eine gute Chance für uns, die Vorteile unserer Technik intuitiv aufzuzeigen und anderen Forschern zu helfen, sie zu weiteren Anwendungen zu entwickeln. Zunächst eine Kunststoffprobe mit einem Styrolstreifen gut zu machen, indem Sie einen Würfel in der Mitte mit Abmessungen von vier Millimetern mal drei Millimetern mal zwei Millimeterbohren bohren. Dann, mit Epoxid, kleben Sie ein Stück biotinbeschichtetes Glas, von etwa fünf Millimetern lang, auf die untere Oberfläche.20 Mikroliter 0,25 Milligramm pro Milliliter Streptavidin-Wässerlösung in die Probe geben und 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann spülen Sie die Probe zweimal mit TAM10-Puffer gut ab. Um die Ribosom-Komplexe ohne Antibiotika zu immobilisieren, entfernen Sie zunächst den Puffer aus der Probe gut und fügen Sie 20 Mikroliter 0,1 Mikromolar MF-Pre oder MF-Post Ribosom-Komplex in die Probe gut.Bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubieren und dann einmal mit TAM10-Puffer abspülen. Der Ribosom-Komplex bindet nun mit dem Streptavidin an der Oberfläche über das Fünf-Prim-Ende-Biotin auf der mRNA. Für das Experiment mit Antibiotika, inkubieren neun Mikroliter des MF-Pre-Komplexes mit einem Mikroliter von vier Millimolar Neomycin, 37 Grad Celsius für 10 Minuten.Dann kombinieren In einem Rohr 0,6 Mikroliter 60 Mikromolar EFG, 0,8 Mikroliter von 100 Mikromolar GTP, 0,8 Mikroliter von 100 Millimolar PEP, 0,3 Mikroliter von 1,3 Milligramm pro Milliliter Pyruvatkinase, 6,43 Mikroliter TAM10 Puffer, und ein Mikroliter von fünf Millimolar Fusidinsäure. Bei 37 Grad Celsius 20 Minuten inkubieren. Dann kombinieren Sie die beiden Mischungen, und inkubieren bei 37 Grad Celsius für weitere fünf Minuten.Führen Sie die anderen Antibiotika-Experimente ähnlich durch, mit Konzentrationen von 0,2 Millimolar-Viomycin, 0,4 Millimolar-Hygromycin B und 0,25 Millimolar-Fusidinsäure. Für Frame-Shifting-Studie, wiederholen Sie die Inkubation für die MFNF-Pre-Komplexe mit dem rutschigen Motiv, U6A. Enthalten Antibiotika von Fusidinsäure plus Neomycin.Um den Abschluss des Hybridisierungsprozesses zu gewährleisten, ist ausreichend Zeit erforderlich. Es wird auch empfohlen, den TAM10-Puffer mit einem Mol-Natriumchlorid zu verwenden, um ein homostabiles System aufrechtzuerhalten. Entfernen Sie nach der Inkubation den Puffer aus der Probe.Fügen Sie 20 Mikroliter eines mikromolaren biotinylierten DNA-Strangs hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur über Nacht. Am Morgen spülen Sie die gebildete DNA/mRNA-Duplex einmal mit TAM10-Puffer. Entfernen Sie den Puffer aus dem Sample-Brunnen.Dann 20 Mikroliter 0,5 Milligramm pro Milliliter Streptavidin-beschichtete Magnetperlen in die Probe geben und bei Raumtemperatur zwei Stunden lang brüten. Danach die Probe vorsichtig in einen Halter geben und in eine Zentrifuge legen, um die freien magnetischen Partikel bei 84 mal g für fünf Minuten von der Oberfläche zu entfernen. Schalten Sie den Laser ein.Drücken Sie dann die Ein-/Aus-Taste. Stellen Sie die Empfindlichkeit auf 500 Millivolt ein, und warten Sie etwa zwei Stunden, um das Atommagnetometer aufzuwärmen und zu stabilisieren. Um das Atommagnetometer einzurichten, führen Sie die Gerätesteuerungssoftware aus, und richten Sie den Motorbewegungsmodus auf Rauschen und Die Standardposition auf Null ein.Drücken Sie die Sperre auf der Vorderseite. Stellen Sie die Empfindlichkeit wieder auf 200 Millivolt ein. Passen Sie den Strom und die Spannung des Lasers an, und finden Sie die richtige Resonanzspitze und den Signal-Rausch-Pegel für die beste Signalauflösung.Drücken Sie Sweep auf der Frontplatte. Stellen Sie sicher, dass das Verhältnis von Amplitude zu Breite über 0,5 liegt und der Phasenwert kleiner als fünf Grad mit einer Breite von weniger als 170 Hertz ist. Schließen Sie den Ausgang eines anderen SR530-Verriegelungsverstärkers an die Rückmeldung des Lasers an, um seine Frequenz zu sperren.Plug-in-Funktion-Generator ATF20B, um eine quadratische Welle von 500 Millivolt Peak bis Peak, 100 Millihertz als Referenzsignal für die Umwandlung von Strom in magnetisches Signal eingeben. Trennen Sie dann den Funktionsgenerator. Richten Sie den Bewegungsmodus Motor auf Zwei-Wege- und Standardposition auf 260 Millimeter ein.Überprüfen Sie den Status des Temperaturreglers, um sicherzustellen, dass die Temperatur bei etwa 37 Grad Celsius des Atomsensors liegt. Überprüfen Sie die Stabilität des gesamten Systems zweimal, indem Sie das Programm direkt ausführen, ohne Proben zu laden, um die Signale des leeren Probenhalters zu messen. Um die Proben zu magnetisieren, verwenden Sie vorsichtig eine Pinzette, um die Probe aus dem Halter zu nehmen, und legen Sie sie für zwei Minuten auf die Magnetisierungsstufe.Dann die Probe wieder in den Probenhalter geben und 20 Minuten lang bei 335,4 mal g zentrieren. Entfernen Sie die nicht spezifisch gebundenen magnetischen Partikel. Als nächstes die Probe mit einer Pinzette auf den Motor laden.Klicken Sie auf der Vorderseite auf Sperren, um das Programm auszuführen. In der Zwischenzeit eine Pinzette verwenden, um eine weitere Probe in den Halter zu laden, und legen Sie sie in die Zentrifuge. Machen Sie die beschichtete Glasseite zur Mitte der Zentrifuge und starten Sie die Zentrifugation bei 335,4 mal g für vier Minuten.Wenn der Motor wieder auf Null kommt, klicken Sie nach etwa fünf Minuten auf Die Frontplatte speichern. Verwenden Sie vorsichtig eine Pinzette, um eine Probe vom Motor auf den Zentrifugenhalter zu übertragen. Wenden Sie eine stärkere Kraft an, indem Sie die Zentrifugalgeschwindigkeit um 100 U/min oder eine ähnliche Schrittgröße erhöhen.Tauschen Sie die Probe gegen die Zentrifuge aus. Prozess abwechselnd, um die Kraft jedes Mal schrittweise zu erhöhen. Nach 10 bis 12 Datenpunkten wird ein komplettes Kraftspektrum erreicht.Wenn alle geplanten Experimente abgeschlossen sind, schalten Sie die Ausrüstung aus und gehen Sie in umgekehrter Reihenfolge vor, als sie eingeschaltet wurde. Entfernen Sie die Proben aus dem Halter und tauchen Sie sie zur Reinigung und zukünftigen Verwendung in Ethanol ein. Reinigen Sie den Probenhalter bei magnetischer Perlenkontamination mit Aceton.In diesem Protokoll wurde der Ribosom-Komplex an der Oberfläche über das Fünf-Prim-Ende der mRNA immobilisiert und machte sowohl die Fünf-Prim- als auch die Drei-Prim-Seite für die sondierungen DNA-Herrscher leicht zugänglich. Wenn der Linker für die Fünf-Prim-Seite länger als 50 Thymin war, wurde ein starkes magnetisches Signal entdeckt, das auf eine erfolgreiche Bildung von DNA/mRNA-Duplexen hindeutet. Durch Variation der Anzahl der Nukleotide auf der DNA wurde die Korrelation von Dissoziationskraft mit Duplexlänge für die Drei-Prim- bzw. Fünf-Prim-Seiten erreicht.Die Ergebnisse der normalen Translokation von MF-Pre zu MF-Post, in Ermangelung von Antibiotika, zeigen, dass das Ribosom durch drei Nukleotide in Richtung der Drei-Prim-Ende auf beiden Seiten bewegt. MF-Pre trug eine vagrante fMet-tRNA und Phenylalanin-tRNA an den P- bzw. A-Standorten, während MF-Post fMet-tRNA und Phenylalanin-tRNA an den E- bzw. P-Standorten mit einem freien A-Standort trug. Wenn jedoch sowohl Fusidinsäure als auch Adiomycin-Antibiotika vorhanden waren, bewegte sich das Ribosom nur um ein Nukleotid an der Fünf-Prim-Seite, aber um zwei Nukleotide an der Drei-Prim-Seite.Nach dem Abwaschen der Antibiotika kam es zu einer normalen Translokation, wie drei Nukleotidbewegungen sowohl von der Fünf-Prime- als auch der Drei-Prim-Seite belegen. Beim Magnetisieren der Probe sollte sich die beschichtete Oberfläche nähern und den Magneten vertikal verlassen. Und das Entfernen der nicht spezifisch gebundenen magnetischen Partikel ist sehr wichtig für die Datengenauigkeit und -qualität.Unsere Technik bietet eine hohe Auflösung und eine allgemein anwendbare Möglichkeit, die molekulare Verschiebung von Nukleinsäure zu untersuchen, die in der Molekularbiologie weit verbreitet ist.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Einzelmolekül-Super-Resolution Imaging von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat in der Plasmamembran mit neuartigen Fluoreszenzsonden

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Forschung

Biochemie

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Bestimmen, ob DNA mit einem Cyanin Farbstoff kann nicht verdaut werden mit Restriktionsenzymen gebeizt

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesen und DNA-Reparatur-Assay mit Einzel-Nukleotid-Erweiterung und MALDI-TOF Massenspektrometrie-Analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Übersetzen von Ribososomen-Affinitätsreinigung (TRAP) zur RNA-Isolierung von Endothelzellen In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-Sequenzerkennung durch DNA-Primase mit High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energieübertragungsstudie zur Ribosomenproteinsynthese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

CD-Spektroskopie zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...