Name: dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution
Uploaded: 2019-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות (R01GM111452, י, S.X.). י. ו. מאשר תמיכה מקרן וולש (E-1721).

1. הכנת הריבוכמה מתחמי
<ol><li>להפוך 1,000 mL של TAM10 מאגר, אשר מורכב 20 מ"מ-HCl (pH 7.5), 10 מ"מ Mg (OAc)2, 30 מ"מ NH4Cl, 70 mm KCL, 5 מ"מ EDTA, 7 מ"מ bme (2-mercaptoethanol), ו 0.05% Tween20.</li>
	<li>הכינו את חמשת התערובות שמופיעות בטבלה 1. הערה: הריבוחלק היה מהזן MRE60011. EF-Tu: גורם התארכות בלתי יציב. EF-Ts: גורם התארכות...

<ol>
	<li>Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structural+dynamics+in+translocation:+yet+another+functional+role+for+ribosomal+RNA.">Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA.</a> Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).</li><li>Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+ribosome+hands+the+A-site+tRNA+to+the+P+site+during+EF-G-catalyzed+translocation.">How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation.</a> Science. 345, 1188-1191 (2014).</li><li>Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual-luciferase+reporter+system+for+studying+recoding+signals.">A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals.</a> RNA. 4, 479-486 (1998).</li><li>Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+-2+frameshifting+by+mammalian+ribosomes+to+synthesize+an+additional+arterivirus+protein.">Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).</li><li>Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+excursions+during+mRNA+translocation+mediate+broad+branching+of+frameshift+pathways.">Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways.</a> Cell. 160, 870-881 (2015).</li><li>Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages.">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pathways+of+-1+translational+frameshifting.">Dynamic pathways of -1 translational frameshifting.</a> Nature. 512, 328-332 (2014).</li><li>De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined+and+sequence-specific+noncovalent+binding+forces+of+DNA.">Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA.</a> Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).</li><li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+DNA+rulers+reveal+an+"mRNA+looping"+intermediate+state+during+ribosome+translocation.">Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation.</a> RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).</li><li>Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+"-1"+and+"-2"+ribosomal+frameshiftings+revealed+by+force+spectroscopy.">High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).</li><li>Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center.">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).</li><li>Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+atomic+magnetometer+at+body+temperature+for+magnetic+particle+imaging+and+nuclear+magnetic+resonance.">Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance.</a> Optics Letters. 35, 661-663 (2010).</li><li>Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range,+high-resolution+magnetic+imaging+of+nanoparticles.">Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).</li><li>Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+structure+controls+and+directs+mRNA+entry,+translocation+and+exit+dynamics.">The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics.</a> Physical Biology. 5, 046005 (2008).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+uses+two+active+mechanisms+to+unwind+messenger+RNA+during+translation.">The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation.</a> Nature. 475, 118-121 (2011).</li><li>Jacks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ribosomal+frameshifting+in+HIV-1+gag-pol+expression.">Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression.</a> Nature. 331, 280-283 (1988).</li><li>Schuwirth, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+bacterial+ribosome+at+3.5+&#197;+resolution.">Structures of the bacterial ribosome at 3.5 &#197; resolution.</a> Science. 310, 827-834 (2005).</li><li>Jia, H., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+force+spectroscopy+reveals+ribosomal+motion+at+sub-nucleotide+steps.">Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps.</a> Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).</li></ol>

בתוך השליטה הכפולה שלנו, החרוזים המגנטיים לשחק שני תפקידים חיוניים. ראשית, הם משמשים ככוח התמרה כי הכוח הצנטריפוגלי הוא יחסי למסה הפרוע שלהם. שנית, החרוזים הם נושאות איתותים שזוהו על ידי מגנטומטר אטומי, שכרגע הוא החיישן המגנטי המדויק ביותר. שילוב מניפולציה מכנית וזיהוי מגנטי, שיטת המשרדים ...

עקירה ביוקולולקולרית היא פרמטר בסיסי בלימוד המנגנון של הפונקציות הביולוגיות הקשורות. דוגמה אחת היא הריבוכמה טרנסלוקציה1,2, שבמהלכה הריבוכמה נע על ידי שלושה נוקלאוטידים בדיוק (nt) על שליח RNA (mrna) בדרך כלל, ועל ידי אחד, שניים, או מספר אחר של nt מלבד שלושה במקרה של frameshifting. לפיכך, נדרשת רזולוציה יחידה של מערכת שליטה בסרגל מולקולרי כדי להבדיל בין גודלי השלבים השונים. אתגר גדול יותר הוא לחקור את התנועה הריבוחלק הן על הכניסה והן בצד היציאה. במילים אחרות, רק עם מערכת סרגל כפול נוכל לגלות אם mrna הוא משורשר בצורה חלקה דרך ריבוכמה, או יש שלבי ביניים שבו שני הצדדים יש גדלים צעד שונה המוביל לתוך מקוטע או בלולאה mrna היווצרות בפנים ה ריבוזום.
מספר שיטות פותחו כדי להתמודד עם האתגר הראשון של פתרון צעדים שונים בצד היציאה של ריבוחלק (3 ' הקצה של mRNA). השיטת לוציפראז כפולה פותרת את מסגרות הקריאה השונות על-ידי מדידת היחס בין החלבונים השונים הנובעים ממנה3,4. היא ישימה רק עבור 3 ' סוף mRNA ובכך מספיק כדי לספק תמונה מלאה של טרנסלוקציה. ספקטרומטר מסה יכול לנתח את שברי הפפטיד השונים כתוצאה מסידור הקוד המקביל5. אבל זה לא יכול להצביע על כמה nt הריבוכמה נע על mRNA. שיטת ההדפסה הבוהן היא שיטה נפוצה נוספת המשתמשת בטרנסקריפטאז הפוכה שהייתה מועלת ב -3 '-הסוף כדי לתעתור את ה-mRNA לקראת הריבוחלק6. עם זאת, היא אינה ישימה עבור 5 ' סוף mRNA כי הוא להזין את ריבוכמה. טכניקות אחרות, כולל גישות מולקולה יחידה ושיטות זריחה7, קשה להשיג רזולוציה בודדת-nt.
פיתחנו את שיטת ה-DNA כפול שניתן לקבוע באופן ייחודי הן את מיקומי הכניסה והיציאה של mRNA החשופה ב-מכלולי הריבוכמה-mRNA.  DNAs הסרגל הם ה-DNA oligomers שיוצרים דופלקסים של מספר מסוים של זוגות בסיס (bp) עם mRNA חשף על ידי הריבוכמה, ללא קשר לאיזה קצה של mRNA. מספרי bp ולאחר מכן בדיוק לחשוף את מיקום הריבוכמה על mRNA במהלך הטרנסלוקציה. מספרי הלחץ של הדופלקסים נקבעים על ידי כוחות הדיסוציאציה הקריטיים שלהם, שהתקבלו מהספקטרוסקופיית מגנטיזציה (חברות)8. עם 2-3 בחוסר ודאות כוח, הכוחות הקריטיים מספיקים כדי להציע רזולוציה בודדת nt. על-ידי יישום מולקולת מקשר על שליטי ה-DNA, הצד הפריע באופן שחור של mRNA על ידי הריבוכמה ניתן לנחקר. הריבוזומdisplacements שונים יכולים ובכך להיפתר במדויק. הצלחנו לחשוף בהצלחה היווצרות בלולאה ייחודית של mRNA לכוד על ידי אנטיביוטיקה במהלך הטרנסלוקציה9, ופתרו מסגרות קריאה שונות שנוצרו ברצף mrna חלקלק10. מאמר זה מתאר את הפרטים של מערך הסרגל הכפול, הכולל הכנת מכלולי ריבוכמה, הפונקציונליות של פני השטח של שקופיות הזכוכית, השתק של מכלולי ריבוכמה והכלאה שלהם עם השליט DNA מגנטית מתויג מולקולות, זיהוי מגנטי וניתוח ספקטרום הכוח של חברות משרדי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1412px;" width="1411">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Styrene Strip</td>
			<td style="width:239px;">City of Industry</td>
			<td style="width:161px;">MS-861</td>
			<td style="width:795px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:217px;">Glass slides</td>
			<td style="width:239px;">Evaporated Coatings</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>60.0 &#215; 4.0 &#215; 0.3 mm3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A6283-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
			<td style="width:239px;">UCT specialties</td>
			<td style="width:161px;">21400088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mPEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">154-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Biotin-PEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">152-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Epoxy glue</td>
			<td style="width:239px;">Devcon</td>
			<td style="width:161px;">31345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Fusidic Acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">F0756-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Neomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1458009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Viomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1715000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:239px;">invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Magnesium acetate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M5661-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Ammonium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">EDTA</td>
			<td style="width:239px;">GIBCO</td>
			<td style="width:161px;">774750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M6250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tween20</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">GTP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8877-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">PEP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P7127-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Pyruvate Kinase</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1506-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mRNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">133899727</td>
			<td>5&#8242;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3&#8242;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468630</td>
			<td>3&#697;- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">164845370</td>
			<td>3&#697;-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468628</td>
			<td>3&#697;-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">163472705</td>
			<td>3&#697;-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678130</td>
			<td>3&#697;-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678131</td>
			<td>3&#697;-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678132</td>
			<td>3&#697;-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678133</td>
			<td>3&#697;-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Micro Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Hitachi</td>
			<td style="width:161px;">CS150FNX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">VM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Laser</td>
			<td style="width:239px;">Newport</td>
			<td style="width:161px;">TLB-6918-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Function generator</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">DS345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Photo detectors</td>
			<td style="width:239px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:161px;">DET36A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution

הריבוכמה הטרנסלוקציה מתייחסת לתנועה הריבוזומלית ב-mRNA על-ידי שלושה נוקלאוטידים בדיוק (nt), שהוא השלב המרכזי בסינתזה של חלבונים. כדי לחקור את מנגנון המנגנון, קיימות שתי דרישות טכניות חיוניות. ראשית, רזולוציה בודדת של nt שיכולה לפתור טרנסלוקציה רגילה מ-frameshifting, שבמהלכה הריבוכמה נע על-ידי אחר מ-3 nt. השני הוא היכולת לחקור הן את צדי הכניסה והיציאה של mRNA כדי להבהיר את התמונה כולה של טרנסלוקציה. אנו מדווחים על שיטת ה-DNA הכפולה המבוססת על כוחות הדיסוציאציה הקריטיים של הדופלקסים של DNA-mRNA, המתקבל על ידי שריד מגנטיזציה מגנטית שארית (חברות).  עם 2-4 ברזולוציה הכוח pN, הבחינה הסרגל כפול הוא מספיק כדי להבדיל בין שלבי הטרנסלוקציה שונים. על ידי יישום מקשר ארוך על DNAs בדיקה, הם יכולים להגיע mRNA בצד הנגדי של ריבוכמה, כך מיקום mRNA יכול להיקבע עבור שני הצדדים. לכן, השיטת הסרגל הכפולה מתאימה באופן ייחודי לחקירת הטרנסלוקציה הריבומוגית, ולתנועת חומצת גרעין באופן כללי. אנו מראים תוצאות הנציג אשר הצביעו על mRNA בלולאה היווצרות ונפתר טרנסלוקציה נורמלית מ frameshifting.

איור 1 מציג את ערכת האיתור והתצלומים של הרכיבים המרכזיים. זיהוי מגנטי מושגת על ידי מגנטומטר אטומי באמצעות ערכת הסריקה (איור 1א)13. המדגם ממוקם על מוט רכוב על מנוע ליניארי. המנוע מסיע את הדגימה לחיישן האטומי בתוך מגן מגנטי, ואז בחזרה לאתר ?...

Watch this Scientific Journal Video about Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution at JoVE.com

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

שיטת ה-DNA כפול מפותחת כדי לקבוע את מיקום mRNA במהלך הריבוטרנסלוקציה, אשר נשענת על כוחות הדיסוציאציה של דופלקסים DNA-mRNA הנוצר. עם יחיד-נוקלאוטיד החלטה ויכולת להגיע שני הקצוות של mRNA, זה יכול לספק תובנות מכניסטיות עבור טרנסלוקציה ריבוכמה ולחקור אחרים חומצות גרעין displacements.

שליטי ה-DNA כפול ללמוד את המנגנון של טרנסלוקציה הריבוכמה עם פתרון יחיד נוקלאוטיד

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

הבדיקה הכפולה של סרגל הדנ"א יכולה לספק תובנות מכניסטיות עבור טרנסלוקציה ריבוזום ולבדיקה של תזוזות חומצות גרעין אחרות. הבדיקה הכפולה שלנו של סרגל הדנ"א היא כרגע השיטה היחידה שיכולה לחקור באופן אובייקטיבי הן את צדי הכניסה והן את צדי היציאה של mRNA במתחמים הריבוזום ברזולוציה של נוקלאוטידים יחידים. שיטות דומות מיושמות גם כדי למדוד את כוח מחייב DNA ואת הבחירה של תרופות כימותרפיות.הדגמה חזותית של השיטה היא הזדמנות טובה עבורנו להראות באופן אינטואיטיבי את היתרונות של הטכניקה שלנו ולעזור לחוקרים אחרים להמשיך לפתח אותה ליישומים נוספים. כדי להתחיל, לעשות מדגם פלסטיק היטב עם רצועת styrene על ידי קידוח קובייה במרכז עם מידות של ארבעה מילימטרים על ידי שלושה מילימטרים על ידי שני מילימטרים. לאחר מכן, באמצעות אפוקסי, הדבק חתיכת זכוכית מצופה ביוטין, באורך של כחמישה מילימטרים, אל פני השטח התחתונים.הוסף 20 microliters של 0.25 מיליגרם לכל פתרון מים סטרפטבידין מיליליטר לתוך המדגם היטב, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות. לאחר מכן שטפו היטב את הדגימה פעמיים עם מאגר TAM10. כדי לשתק את קומפלקסים ריבוזום ללא אנטיביוטיקה, תחילה להסיר את המאגר מן המדגם היטב, ולהוסיף 20 microliters של 0.1 מיקרומולרי MF-Pre או MF-Post ריבוזום מורכבים לתוך המדגם היטב.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, ולאחר מכן לשטוף פעם אחת עם חיץ TAM10. קומפלקס הריבוזום נקשר כעת עם הסטרפטבידין על פני השטח דרך הביוטין של חמשת הפריים ב-mRNA. לניסוי באמצעות אנטיביוטיקה, דגירה תשעה microliters של קומפלקס MF-Pre עם microliter אחד של ארבעה neomycin מילימולרית, 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.ואז לשלב בצינור 0.6 microliters של 60 מיקרומולרים EFG, 0.8 מיקרוליטרים של 100 מיקרומולרים GTP, 0.8 מיקרוליטר של 100 מילימולרים PEP, 0.3 מיקרוליטר של 1.3 מיליגרם למיליליטר פירובט קינאז, 6.43 מיקרוליטר TAM10 חוצץ, ומיקרוליטר אחד של חמישה חומצה fusidic מילימולרית. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן לשלב את שתי תערובות, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות נוספות.לבצע את הניסויים אנטיביוטיקה אחרים באופן דומה, עם ריכוזים של 0.2 מילימולרית viomycin, 0.4 מילימולרית hygromycin B, ו 0.25 חומצה fusidic מילימולרית. לצורך מחקר הסטת מסגרת, חזור על הדגירה עבור מתחמי MFNF-Pre המערבים את המוטיב החלקלק, U6A. כלול אנטיביוטיקה של חומצה fusidic בתוספת neomycin.יש צורך בזמן מספיק כדי להבטיח את השלמת תהליך ההכלאה. מומלץ גם להשתמש במאגר TAM10 עם שומה אחת בפועל נתרן כלורי כדי לשמור על מערכת הומוסטדית. לאחר הדגירה, הסר מאגר מהדגימה היטב.מוסיפים 20 מיקרוליטרים של גדיל דנ"א אחד של בדיקה ביו-מולארית, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך הלילה. בבוקר, לשטוף את ה-DNA שנוצר / mRNA דופלקס פעם אחת עם חיץ TAM10. הסר את המאגר מה באר הדוגמה.לאחר מכן הוסיפו 20 מיקרוליטרים של 0.5 מיליגרם למיליליטר ציפוי דם מגנטי לתוך הדגימה היטב, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. לאחר מכן, הכנס בזהירות את הדגימה היטב לתוך מחזיק, והצב אותה בצנטריפוגה כדי להסיר את החלקיקים המגנטיים החופשיים מפני השטח במהירות של פי 84 למשך חמש דקות. תדליק את הלייזר.לאחר מכן לחץ על לחצן ההפעלה. כוונן את הרגישות ל-500 מילי-וולט, והמתן כשעתיים כדי להתחמם ולייצב את המגנטומטר האטומי. כדי להגדיר את המגנטומטר האטומי, הפעל את תוכנת בקרת המכשירים והגדר את מצב המעבר של המנוע לרעש ואת מיקום ברירת המחדל לאפס.לחץ על נעל בלוח הקדמי. כוונן את הרגישות בחזרה ל-200 מילי-וולט. כוונן את הזרם והמתח של הלייזר, ולמצוא את שיא תהודה נכונה ואת רמת אות לרעש עבור רזולוציית האות הטובה ביותר.לחץ על נקה בלוח הקדמי. ודא כי יחס משרעת לרוחב הוא מעל 0.5 וערך הפאזה קטן מחמש מעלות עם רוחב קטן מ- 170 הרץ. חבר את הפלט של מגבר נעילה אחר SR530 למשוב של הלייזר כדי לנעול את התדר שלו.חבר מחולל פונקציות ATF20B כדי להזין גל מרובע של 500 מילי-וולטים לשיא, 100 מילי-הרץ כאות הייחוס להמרת זרם לאות מגנטי. לאחר מכן נתק את מחולל הפונקציות. הגדר את מצב המעבר של המנוע למיקום דו-כיוון וברירת מחדל ל- 260 מילימטרים.בדוק את מצבו של בקר הטמפרטורה, כדי להבטיח את הטמפרטורה היא כ 37 מעלות צלזיוס, של החיישן האטומי. בדוק את היציבות של המערכת כולה פעמיים על ידי הפעלה ישירה של התוכנית מבלי לטעון דגימות כדי למדוד את האותות של מחזיק הדגימה הריק. כדי למגנט את הדגימות, יש להשתמש בעדינות פינצטה כדי להוציא את הדגימה מהמחזיק, ולהצבה על במת המגנטיזציה למשך שתי דקות.לאחר מכן להחזיר את הדגימה למחזיק הדגימה, ואת הצנטריפוגה ב 335.4 פעמים g במשך 20 דקות. הסר את החלקיקים המגנטיים שאינם קשורים באופן ספציפי. לאחר מכן לטעון את המדגם על המנוע עם פינצטה.לחץ על נעל בלוח הקדמי כדי להפעיל את התוכנית. בינתיים להשתמש פינצטה לטעון מדגם נוסף לתוך המחזיק, ולמקום אותו לתוך הצנטריפוגה. הפוך את צד הזכוכית מצופה פונה למרכז הצנטריפוגה, ולהתחיל את הצנטריפוגה ב 335.4 פעמים g במשך ארבע דקות.כאשר המנוע חוזר לאפס, לאחר כחמש דקות, לחץ על שמור בלוח הקדמי. בזהירות להשתמש פינצטה להעביר דגימה אחת מהמנוע למחזיק צנטריפוגה. החל כוח חזק יותר על ידי הגדלת המהירות הצנטריפוגלית על ידי 100 סל"ד או גודל צעד דומה.החלף את הדגימה לצנטריפוגה. לעבד לסירוגין כדי להגדיל בהדרגה את הכוח בכל פעם. ספקטרום כוח שלם מתקבל לאחר 10 עד 12 נקודות נתונים.כאשר כל הניסויים המתוכננים הסתיימו, לכבות את הציוד, להמשיך בסדר ההפוך כפי שהוא היה מופעל. מוציאים את הדגימות מהמחזיק, ומטבולים אותן באתנול לניקוי ושימוש עתידי. לנקות את מחזיק הדגימה עם אצטון במקרה של זיהום חרוז מגנטי.בפרוטוקול זה, מתחם הריבוזום היה משותק על פני השטח, דרך הקצה החמישי של ה-mRNA, והפך הן את הצד של חמשת הפריים והן את הצד השלישי לנגישים בקלות עבור שליטי הדנ"א. כאשר הקישור של הצד של חמשת הפריים היה ארוך יותר מ-50 תימין, אות מגנטי חזק זוהה, מה שמצביע על היווצרות מוצלחת של דופלקסים של DNA/mRNA. על ידי שינוי מספר הנוקלאוטידים בדנ"א, המתאם של כוח הדיסוציאציה לאורך הדופלקס הושג עבור שלושת הצדדים המובילים וחמשת הפריים, בהתאמה.התוצאות של טרנסלוקציה נורמלית מ- MF-Pre ל- MF-Post, בהיעדר אנטיביוטיקה, מראות כי הריבוזום נע על ידי שלושה נוקלאוטידים לכיוון הקצה השלישי בשני הצדדים. MF-Pre נשא fMet-tRNA נוודים ופנילאלנין-tRNA באתרי P ו- A, בהתאמה, בעוד MF-Post נשא fMet-tRNA ו פנילאלנין-tRNA באתרי E ו- P, בהתאמה, עם אתר A ריק. עם זאת, כאשר גם חומצה fusidic ואנטיביוטיקה adiomycin היו נוכחים, ריבוזום נע רק על ידי נוקלאוטידים אחד בצד חמישה ראש אבל שני נוקלאוטידים בצד שלושה ראש.לאחר שטיפת האנטיביוטיקה, התרחשה טרנסלוקציה נורמלית, כפי שמוצג על ידי שלוש תנועות נוקלאוטידים משני הצדדים של חמשת הפריים ושלושת הפריים. כאשר ממגנטים את הדגימה, המשטח הציפוי צריך להתקרב ולהשאיר את המגנט אנכית. והסרת החלקיקים המגנטיים שאינם קשורים באופן ספציפי חשובה מאוד לדיוק ואיכות הנתונים.הטכניקה שלנו מספקת רזולוציה גבוהה ודרך ישימה בדרך כלל לחקור עקירה מולקולרית של חומצת גרעין אשר נתקל נרחב בביולוגיה מולקולרית.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

הדמיה סופר-רזולוציה מולקולה בודדת של 4,5-bisphosphate phosphatidylinositol בקרום פלזמה עם רומן פלורסנט בדיקות

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

קביעה אם הדנ א מוכתם Cyanine צבע יכול להיות מתעכל עם אנזימי הגבלה

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

הגהה ואת וזמינותו תיקון ה-DNA באמצעות ניתוח ספקטרומטר מסה MALDI-TOF והסיומת נוקלאוטיד יחיד

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

זיהוי רצף דנ א על ידי Primase DNA שימוש בתפוקה גבוהה Primase פרופיל

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

מולקולה בודדת פלואורסצנטית העברת אנרגיה מחקר של סינתזת חלבון ריבוזום

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבון

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...