Name: dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution
Uploaded: 2019-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution at JoVE.com

Questo lavoro è supportato dagli Stati Uniti National Institutes of Health (R01GM11452, Y.W., S.X.). Y. W. riconosce il sostegno della Welch Foundation (E-1721).

1. Preparazione dei complessi ribosomi
<ol><li>Fare 1.000 mL di TAM10 buffer, che consiste di 20 mM tris-HCl (pH 7.5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-cap mertoetanolo) e 0,05% Tween20.</li>
	<li>Preparare le cinque miscele elencate nella Tabella 1. NOTA: Il ribosoma era del ceppo MRE60011. EF-Tu: fattore di allungamento terminabile. EF-Ts: fattore di allungamento termo stabile. GTP: guanosina tripofosfato. PEP: fosforo (e...

<ol>
	<li>Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structural+dynamics+in+translocation:+yet+another+functional+role+for+ribosomal+RNA.">Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA.</a> Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).</li><li>Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+ribosome+hands+the+A-site+tRNA+to+the+P+site+during+EF-G-catalyzed+translocation.">How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation.</a> Science. 345, 1188-1191 (2014).</li><li>Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual-luciferase+reporter+system+for+studying+recoding+signals.">A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals.</a> RNA. 4, 479-486 (1998).</li><li>Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+-2+frameshifting+by+mammalian+ribosomes+to+synthesize+an+additional+arterivirus+protein.">Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).</li><li>Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+excursions+during+mRNA+translocation+mediate+broad+branching+of+frameshift+pathways.">Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways.</a> Cell. 160, 870-881 (2015).</li><li>Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages.">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pathways+of+-1+translational+frameshifting.">Dynamic pathways of -1 translational frameshifting.</a> Nature. 512, 328-332 (2014).</li><li>De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined+and+sequence-specific+noncovalent+binding+forces+of+DNA.">Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA.</a> Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).</li><li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+DNA+rulers+reveal+an+"mRNA+looping"+intermediate+state+during+ribosome+translocation.">Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation.</a> RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).</li><li>Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+"-1"+and+"-2"+ribosomal+frameshiftings+revealed+by+force+spectroscopy.">High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).</li><li>Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center.">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).</li><li>Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+atomic+magnetometer+at+body+temperature+for+magnetic+particle+imaging+and+nuclear+magnetic+resonance.">Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance.</a> Optics Letters. 35, 661-663 (2010).</li><li>Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range,+high-resolution+magnetic+imaging+of+nanoparticles.">Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).</li><li>Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+structure+controls+and+directs+mRNA+entry,+translocation+and+exit+dynamics.">The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics.</a> Physical Biology. 5, 046005 (2008).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+uses+two+active+mechanisms+to+unwind+messenger+RNA+during+translation.">The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation.</a> Nature. 475, 118-121 (2011).</li><li>Jacks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ribosomal+frameshifting+in+HIV-1+gag-pol+expression.">Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression.</a> Nature. 331, 280-283 (1988).</li><li>Schuwirth, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+bacterial+ribosome+at+3.5+&#197;+resolution.">Structures of the bacterial ribosome at 3.5 &#197; resolution.</a> Science. 310, 827-834 (2005).</li><li>Jia, H., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+force+spectroscopy+reveals+ribosomal+motion+at+sub-nucleotide+steps.">Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps.</a> Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).</li></ol>

Nel nostro assaggio doppio righello, le perline magnetiche svolgono due ruoli essenziali. In primo luogo, servono come trasduttori di forza perché la forza centrifuga è proporzionale alla loro massa galleggiante. In secondo luogo, le perline sono vettori di segnale rilevati da un magnetometro atomico, che è attualmente il sensore magnetico più preciso. Combinando la manipolazione meccanica e il rilevamento magnetico, la tecnica FIRMS è in grado di risolvere un gran numero di interazioni molecolari basate sulle loro ...

Lo spostamento biomolecolare è un parametro fondamentale nello studio del meccanismo delle funzioni biologiche correlate. Un esempio particolare è la traslocazione ribosoma1,2, durante la quale il ribosoma si muove esattamente da tre nucleotidi (nt) sull'RNA messaggero (mRNA) normalmente, e da uno, due o altri numeri di nt tranne tre nel caso di frameshifting. Pertanto, è necessario un sistema di righello molecolare a risoluzione a virgola singola per distinguere le diverse dimensioni del passo. Una sfida più grande è quella di sondare il movimento del ribosoma su entrambi i lati di entrata e di uscita. In altre parole, solo con un sistema a doppio righello saremo in grado di rivelare se l'mRNA è filettato senza intoppi attraverso il ribosoma, o ci sono passaggi intermedi in cui i due lati hanno dimensioni di gradino diverse che portano a una conformazione di mRNA piegata o loop all'interno del Ribosoma.
Sono stati sviluppati diversi metodi per affrontare la prima sfida di risolvere diversi passi sul lato di uscita del ribosoma (la fine del 3' dell'mRNA). Il doppio saggio luciferasi risolve i diversi fotogrammi di lettura misurando i rapporti delle diverse proteine risultanti3,4. È applicabile solo per l'estremità 3' dell'mRNA e quindi insufficiente a fornire un quadro completo della traslocazione. La spettrometria di massa può analizzare i diversi frammenti di peptidi come conseguenza dei corrispondenti riarrangiamenti del codice5. Ma non può individuare quanti nt il ribosoma si muove sull'mRNA. Il test di stampa della dito della luce è un altro metodo comune che utilizza una trascrizione inversa innescata all'estremità 3'-distale per trascrivere l'mRNA verso il ribosoma6. Tuttavia, non è applicabile per la fine 5' dell'mRNA che sta entrando nel ribosoma. Altre tecniche, tra cui approcci a singola molecola e metodi di fluorescenza7, sono difficili da raggiungere una risoluzione a due.
Abbiamo sviluppato il doppio saggio del righello del DNA in grado di determinare in modo univoco sia le posizioni di ingresso che di uscita dell'mRNA scoperto nei complessi di ribosomi-mRNA.  I DNA righelli sono oligomeri di DNA che formano duplex di un certo numero di coppie di base (bp) con l'mRNA scoperto dal ribosoma, indipendentemente dalla fine dell'mRNA. I numeri bp poi rivelano con precisione la posizione del ribosoma sull'mRNA durante la traslocazione. I numeri bp dei duplex sono determinati dalle loro forze critiche di dissociazione ottenute dalla spettroscopia di magnetizzazione della magnetizzazione di residua indotta dalla forza (FIRMS)8. Con 2-3 pN di incertezza forza, le forze critiche sono sufficienti per offrire una risoluzione mono-nt. Implementando una molecola del linker sui righelli del DNA, il lato sterically ostacolato dell'mRNA dal ribosoma può essere sondato. Diversi spostamenti di ribosomia possono quindi essere risolti con precisione. Abbiamo rivelato con successo un'unica conformazione loopdiforme di mRNA intrappolata dagli antibiotici durante la traslocazione9, e risolto diversi fotogrammi di lettura che coesistevano su una sequenza di mRNA scivolosa10. Questo articolo descrive i dettagli del saggio a doppio righello, che includono la preparazione dei complessi ribosomi, la funzionalizzazione superficiale dei vetrini di vetro, l'immobilizzazione dei complessi di ribosomi e la loro ibridazione con righello di DNA etichettato magneticamente molecole, rilevamento magnetico e analisi dello spettro di forza da parte di FIRMS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1412px;" width="1411">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Styrene Strip</td>
			<td style="width:239px;">City of Industry</td>
			<td style="width:161px;">MS-861</td>
			<td style="width:795px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:217px;">Glass slides</td>
			<td style="width:239px;">Evaporated Coatings</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>60.0 &#215; 4.0 &#215; 0.3 mm3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A6283-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
			<td style="width:239px;">UCT specialties</td>
			<td style="width:161px;">21400088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mPEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">154-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Biotin-PEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">152-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Epoxy glue</td>
			<td style="width:239px;">Devcon</td>
			<td style="width:161px;">31345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Fusidic Acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">F0756-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Neomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1458009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Viomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1715000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:239px;">invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Magnesium acetate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M5661-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Ammonium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">EDTA</td>
			<td style="width:239px;">GIBCO</td>
			<td style="width:161px;">774750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M6250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tween20</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">GTP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8877-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">PEP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P7127-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Pyruvate Kinase</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1506-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mRNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">133899727</td>
			<td>5&#8242;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3&#8242;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468630</td>
			<td>3&#697;- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">164845370</td>
			<td>3&#697;-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468628</td>
			<td>3&#697;-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">163472705</td>
			<td>3&#697;-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678130</td>
			<td>3&#697;-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678131</td>
			<td>3&#697;-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678132</td>
			<td>3&#697;-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678133</td>
			<td>3&#697;-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Micro Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Hitachi</td>
			<td style="width:161px;">CS150FNX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">VM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Laser</td>
			<td style="width:239px;">Newport</td>
			<td style="width:161px;">TLB-6918-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Function generator</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">DS345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Photo detectors</td>
			<td style="width:239px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:161px;">DET36A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution

La traslocazione del ribosoma si riferisce al movimento ribosomico sull'mRNA da esattamente tre nucleotidi (nt), che è il passo centrale nella sintesi proteica. Per studiarne il meccanismo, esistono due requisiti tecnici essenziali. Il primo è una risoluzione single-nt che può risolvere la normale traslocazione dal frameshifting, durante il quale il ribosoma si muove di diverso da 3 nt. La seconda è la capacità di sondare i lati di ingresso e uscita dell'mRNA al fine di chiarire l'intero quadro della traslocazione. Riportiamo il doppio saggio del righello del DNA che si basa sulle forze di dissociazione critiche dei duplex DNA-mRNA, ottenuti dalla spettroscopia di magnetizzazione residua indotta dalla forza (FIRMS).  Con la risoluzione della forza 2-4 pN, l'esempio a doppio righello è sufficiente a distinguere i diversi passaggi di traslocazione. Implementando un lungo linker sui DNA di sondaggio, possono raggiungere l'mRNA sul lato opposto del ribosoma, in modo che la posizione dell'mRNA possa essere determinata per entrambi i lati. Pertanto, l'analisi del doppio righello è particolarmente adatta a studiare la traslocazione del ribosoma e il movimento dell'acido nucleico in generale. Mostriamo risultati rappresentativi che indicavano una conformazione di mRNA in loop e risolvevano la normale traslocazione dal frameshifting.

La figura 1 mostra lo schema di rilevamento e le fotografie dei componenti principali. Il rilevamento magnetico è ottenuto da un magnetometro atomico utilizzando lo schema di scansione (Figura 1A)13. Il campione viene posto su un'asta montata su un motore lineare. Il motore trasporta il campione al sensore atomico all'interno di uno scudo magnetico, quindi di nuovo al sito originale per lo scarico. Il magnetometro atomic...

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Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

L'analisi del doppio righello del DNA viene sviluppata per determinare la posizione dell'mRNA durante la traslocazione del ribosoma, che si basa sulle forze di dissociazione dei duplex DNA-mRNA formati. Con la risoluzione mononucleotide e la capacità di raggiungere entrambe le estremità dell'mRNA, può fornire spunti meccanicistici per la traslocazione del ribosoma e sondare altri spostamenti di acido nucleico.

I governanti del DOPPIO DNA studiano il meccanismo della traslocazione del ribosoma con la risoluzione Single-Nucleotide

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Il saggio del doppio righello del DNA può fornire spunti meccanicistici per la traslocazione ribosoma e sondare altri spostamenti di acidi nucleici. Il nostro saggio sul doppio righello del DNA è attualmente l'unico metodo in grado di sondare oggettivamente sia i lati di entrata che di uscita dell'mRNA nei complessi ribosomici con risoluzione mono nucleotidica. Metodi simili vengono applicati anche per misurare la forza di legame del DNA e la selettività dei farmaci chemioterapici.La dimostrazione visiva del metodo è una buona occasione per mostrare intuitivamente i vantaggi della nostra tecnica e aiutare altri ricercatori a svilupparla ulteriormente in più applicazioni. Per iniziare, fare bene un campione di plastica con una striscia di stirene forando un cubo al centro con dimensioni di quattro millimetri per tre millimetri per due millimetri. Quindi, usando epossidico, incollare un pezzo di vetro rivestito di biotina, lungo circa cinque millimetri, sulla superficie inferiore.Aggiungere 20 microlitri di 0,25 milligrammi per soluzione acquosa di streptavidina millilitro nel pozzo del campione e incubare a temperatura ambiente per 40 minuti. Quindi sciacquare bene il campione due volte con buffer TAM10. Per immobilizzare i complessi ribosomi senza antibiotici, rimuovere prima bene il tampone dal campione e aggiungere 20 microlitri di 0,1 micromolare MF-Pre o MF-Post ribosoma complesso nel pozzo del campione.Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora, quindi risciacquare una volta con buffer TAM10. Il complesso ribosoma ora si lega con la streptavidina sulla superficie attraverso la biotina a cinque estremità primaria sull'mRNA. Per l'esperimento con antibiotici, incubare nove microlitri del complesso MF-Pre con un microlitro di quattro neomicina millimolare, 37 gradi Celsius per 10 minuti.Quindi combinare in un tubo 0,6 microlitri di 60 micromolare EFG, 0,8 microlitri di 100 GTP micromolare, 0,8 microlitri di PEP da 100 millimolare, 0,3 microlitri da 1,3 milligrammi per millilitro piruvato chinasi, 6,43 microlitri tampone TAM10 e un microlitro di cinque millimolare acido fusidico. Incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi combinare le due miscele e incubare a 37 gradi Celsius per altri cinque minuti.Effettuare gli altri esperimenti sugli antibiotici allo stesso modo, con concentrazioni di viomicina millimolare 0,2 millimolare, 0,4 millimolare igromicina B e acido fusidico 0,25 millimolare. Per lo studio dello spostamento del telaio, ripetere l'incubazione per i complessi MFNF-Pre che coinvolgono il motivo scivoloso, U6A. Includere antibiotici di acido fusidico più neomicina.È necessario tempo sufficiente per garantire il completamento del processo di ibridazione. Si consiglia inoltre di utilizzare il tampone TAM10 con un cloruro di sodio talpa per mantenere un sistema omosestabile. Dopo l'incubazione, rimuovere bene il tampone dal campione.Aggiungere 20 microlitri di un filamento di DNA di sonda biotinylato micromolare e incubare a temperatura ambiente durante la notte. Al mattino, sciacquare il duplex DNA/mRNA formato una volta con buffer TAM10. Rimuovere bene il buffer dal campione.Quindi aggiungere 20 microlitri di 0,5 milligrammi per perline magnetiche rivestite con streptavidina millilitro nel pozzo del campione e incubare a temperatura ambiente per due ore. Successivamente, inserire accuratamente il campione in un supporto e posizionarlo in una centrifuga per rimuovere le particelle magnetiche libere dalla superficie a 84 volte g per cinque minuti. Accendi il laser.Quindi premere il pulsante di accensione. Regolare la sensibilità a 500 millivolt e attendere circa due ore per riscaldare e stabilizzare il magnetometro atomico. Per impostare il magnetometro atomico, eseguire il software di controllo dello strumento e impostare la modalità di spostamento del motore su Rumore e la posizione predefinita su zero.Premere Blocca sul pannello frontale. Regolare la sensibilità a 200 millivolt. Regolare la corrente e la tensione del laser e trovare il picco di risonanza e il livello di segnale-rumore adeguati per la migliore risoluzione del segnale.Premere Sweep sul pannello frontale. Assicurarsi che il rapporto ampiezza-larghezza sia superiore a 0,5 e che il valore di fase sia inferiore a cinque gradi con larghezza inferiore a 170 hertz. Collegare l'uscita di un altro amplificatore lock-in SR530 al feedback del laser per bloccarne la frequenza.Collega il generatore di funzioni ATF20B per inserire un'onda quadrata di 500 millivolt dal picco al picco, 100 millihertz come segnale di riferimento per convertire la corrente in segnale magnetico. Quindi scollegare il generatore di funzioni. Impostare la modalità di spostamento motor su due modi e la posizione predefinita su 260 millimetri.Controllare lo stato del regolatore di temperatura, per assicurarsi che la temperatura sia di circa 37 gradi Celsius, del sensore atomico. Controllare la stabilità dell'intero sistema due volte eseguendo direttamente il programma senza caricare campioni per misurare i segnali del portacampioni vuoto. Per magnetizzare i campioni, utilizzare delicatamente le pinzette per elevare il campione dal supporto e posizionarlo sulla fase di magnetizzazione per due minuti.Quindi rimettere il campione nel supporto del campione e centrifugare a 335,4 volte g per 20 minuti. Rimuovere le particelle magnetiche legate aspecificamente. Quindi caricare il campione sul motore con una pinzetta.Fate clic su Blocca (Lock) sul pannello frontale per eseguire il programma. Nel frattempo utilizzare una pinzetta per caricare un altro campione nel supporto e posizionarlo nella centrifuga. Fare la faccia laterale in vetro rivestito al centro della centrifuga e avviare la centrifugazione a 335,4 volte g per quattro minuti.Quando il motore torna a zero, dopo circa cinque minuti, fare clic su Salva sul pannello frontale. Utilizzare con cura le pinzette per trasferire un campione dal motore al supporto della centrifuga. Applicare una forza più forte aumentando la velocità centrifuga di 100 giri/min o una dimensione del gradino simile.Scambiare il campione con la centrifuga. Elaborare alternativamente per aumentare gradualmente la forza ogni volta. Uno spettro di forza completo si ottiene dopo 10-12 punti dati.Al termine di tutti gli esperimenti pianificati, spegnere l'attrezzatura, procedendo nell'ordine opposto a quello in cui è stata accesa. Rimuovere i campioni dal supporto e immergerli in etanolo per la pulizia e l'uso futuro. Pulire il portacampioni con acetone in caso di contaminazione magnetica delle perline.In questo protocollo, il complesso ribosoma è stato immobilizzato sulla superficie, attraverso l'estremità a cinque primi dell'mRNA, e ha reso sia il lato a cinque che il lato tre primi facilmente accessibili per i righelli del DNA di sonda. Quando il linker per il lato a cinque primi era più lungo di 50 timina, fu rilevato un forte segnale magnetico, che indicava una formazione riuscita di duplex DNA/mRNA. Variando il numero di nucleotidi sul DNA, la correlazione tra forza di dissociazione e lunghezza duplex è stata raggiunta rispettivamente per i lati tre primi e cinque primi.I risultati della normale traslocazione da MF-Pre a MF-Post, in assenza di antibiotici, mostrano che il ribosoma si muoveva da tre nucleotidi verso l'estremità a tre primi su entrambi i lati. MF-Pre trasportava un vagrant fMet-tRNA e fenilalanina-tRNA rispettivamente nei siti P e A, mentre MF-Post trasportava fMet-tRNA e fenilalanina-tRNA rispettivamente nei siti E e P, con un sito A vacante. Tuttavia, quando erano presenti sia l'acido fusidico che gli antibiotici adiomicina, il ribosoma si muoveva da un solo nucleotide sul lato a cinque primi ma due nucleotidi sul lato tre primi.Dopo aver lavato via gli antibiotici, si è verificata una normale traslocazione, come evidenziato da tre movimenti nucleotidici da entrambi i lati cinque primi e tre primi. Quando si magnetizza il campione, la superficie rivestita dovrebbe avvicinarsi e lasciare il magnete verticalmente. E rimuovere le particelle magnetiche non legate in modo specifico è molto importante per l'accuratezza e la qualità dei dati.La nostra tecnica fornisce un'alta risoluzione e un modo generalmente applicabile per studiare lo spostamento molecolare dell'acido nucleico che è ampiamente incontrato in biologia molecolare.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Singolo-molecola di Super-Resolution Imaging di fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato nella membrana plasmatica con il romanzo fluorescenti Sonde

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Ricerca

Biochimica

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Determinare se il DNA macchiato con un cianina tintura può essere digerito con enzimi di restrizione

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Su piccola scala saggi colorimetrici di intracellulare lattato e piruvato nel Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Correzione di bozze e saggio di riparazione del DNA usando l'analisi di spettrometria di massa di singolo Nucleotide estensione e MALDI-TOF

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Traduzione della purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per l'isolamento dell'RNA dalle cellule endoteliali In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Riconoscimento della sequenza del DNA da parte del primase del DNA utilizzando la profilazione primasise ad alto valore a più velocità

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Studio di trasferimento di energia di fluorescenza a singola molecola della sintesi proteica del ribosoma

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza a doppio colore per studiare l'interazione proteina-proteina e la dinamica proteica nelle cellule vive

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Spettroscopia CD per studiare le interazioni DNA-proteina

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...