Name: dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution
Uploaded: 2019-07-08T13:00:00
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この研究は、米国国立衛生研究所(R01GM111452、Y.W.、S.X.)によってサポートされています。Y. W. ウェルチ財団(E-1721)からの支援を認めます。

1. リボソーム複合体の調製
<ol><li>20 mMトリス-HCl(pH 7.5)、10 mM Mg(OAc)2、30 mM NH4Cl、70 mM KCl、5 mM EDTA、7 mM BME(2-メルカプトエタノール)、および0.05%Tween20で構成されるTAM10バッファの1,000 mLを作ります。</li>
	<li>表 1に示す 5 つの混合物を準備します。 注:リボソームはMRE600株11からであった。EF-Tu:伸び係数サーモ不安定。EF-Ts:伸び因子サーモ安定。GTP: ...

<ol>
	<li>Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structural+dynamics+in+translocation:+yet+another+functional+role+for+ribosomal+RNA.">Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA.</a> Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).</li><li>Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+ribosome+hands+the+A-site+tRNA+to+the+P+site+during+EF-G-catalyzed+translocation.">How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation.</a> Science. 345, 1188-1191 (2014).</li><li>Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual-luciferase+reporter+system+for+studying+recoding+signals.">A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals.</a> RNA. 4, 479-486 (1998).</li><li>Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+-2+frameshifting+by+mammalian+ribosomes+to+synthesize+an+additional+arterivirus+protein.">Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).</li><li>Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+excursions+during+mRNA+translocation+mediate+broad+branching+of+frameshift+pathways.">Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways.</a> Cell. 160, 870-881 (2015).</li><li>Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages.">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pathways+of+-1+translational+frameshifting.">Dynamic pathways of -1 translational frameshifting.</a> Nature. 512, 328-332 (2014).</li><li>De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined+and+sequence-specific+noncovalent+binding+forces+of+DNA.">Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA.</a> Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).</li><li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+DNA+rulers+reveal+an+"mRNA+looping"+intermediate+state+during+ribosome+translocation.">Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation.</a> RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).</li><li>Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+"-1"+and+"-2"+ribosomal+frameshiftings+revealed+by+force+spectroscopy.">High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).</li><li>Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center.">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).</li><li>Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+atomic+magnetometer+at+body+temperature+for+magnetic+particle+imaging+and+nuclear+magnetic+resonance.">Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance.</a> Optics Letters. 35, 661-663 (2010).</li><li>Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range,+high-resolution+magnetic+imaging+of+nanoparticles.">Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).</li><li>Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+structure+controls+and+directs+mRNA+entry,+translocation+and+exit+dynamics.">The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics.</a> Physical Biology. 5, 046005 (2008).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+uses+two+active+mechanisms+to+unwind+messenger+RNA+during+translation.">The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation.</a> Nature. 475, 118-121 (2011).</li><li>Jacks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ribosomal+frameshifting+in+HIV-1+gag-pol+expression.">Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression.</a> Nature. 331, 280-283 (1988).</li><li>Schuwirth, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+bacterial+ribosome+at+3.5+&#197;+resolution.">Structures of the bacterial ribosome at 3.5 &#197; resolution.</a> Science. 310, 827-834 (2005).</li><li>Jia, H., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+force+spectroscopy+reveals+ribosomal+motion+at+sub-nucleotide+steps.">Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps.</a> Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).</li></ol>

私たちのデュアル定規アッセイでは、磁気ビーズは2つの重要な役割を果たしています。まず、遠心力は浮力質量に比例するため、力トランスデューサとして機能します。第二に、ビーズは、現在最も正確な磁気センサである原子磁力計によって検出された信号キャリアです。機械的操作と磁気検出を組み合わせることで、DNA定規の基礎となる重要な解離力に基づいて多数の分子相互作用を解...

生体分子変位は、関連する生物学的機能のメカニズムを研究する上で基本的なパラメータである。1つの特定の例は、リボソーム転位1、2、その間にリボソームがメッセンジャーRNA(mRNA)上で正確に3つのヌクレオチド(nt)によって、および1つ、2つ、または3を除くntの他の数によって移動する。フレームシフト。したがって、異なるステップサイズを区別するために、分子定規システムシングルNT分解能が必要です。より大きな課題は、入口側と出口側の両方でリボソームの動きを調べ取ることです。言い換えれば、デュアルルーラーシステムでのみ、mRNAがリボソームを通してスムーズに通付けされているのか、または両側が異なるステップサイズを持ち、内側のmRNAの立体構造を引き起こしているのかを明らかにすることができます。リボソーム。
リボソームの出口側(mRNAの3'末端)の異なるステップを解決する最初の課題に対処するために、いくつかの方法が開発されました。デュアルルシフェラーゼアッセイは、得られた異なるタンパク質3、4の比率を測定することによって、異なる読み取りフレームを解決します。これは、mRNAの3'末端にのみ適用可能であり、したがって、転位の全体像を提供するには不十分です。質量分析は、対応するコード再配置5の結果として異なるペプチド断片を分析することができる。しかし、リボソームがmRNA上でどれだけのntを動かすかを特定することはできません。つま先印刷アッセイは、3'-遠位端でプライミングされた逆転写酵素を使用して、リボソーム6に向かってmRNAを転写するもう一つの一般的な方法である。しかし、リボソームに入っているmRNAの5'末端には適用できない。単一分子アプローチおよび蛍光法7を含む他の技術は、単一nt分解能を達成することは困難である。
我々は、リボソーム-mRNA複合体における未発見のmRNAの入り口と出口位置の両方を一意に決定できるデュアルDNA定規アッセイを開発した。 定規DNAは、mRNAのどちらの端に関係なく、リボソームによって発見されたmRNAと一定数の塩基対(bp)の二重鎖を形成するDNAオリゴマーである。bp番号は転移の間にmRNAのリボソームの位置を正確に明らかにする。二重鎖のbp数は、力誘発残留磁化分光法(FIRMS)8から得られた重要な解離力によって決定される。2-3 pN力の不確実性では、臨界力は単一nt分解能を提供するのに十分である。DNA定規にリンカー分子を実装することにより、リボソームによるmRNAの立体的に妨げられた側をプローブすることができる。異なるリボソーム変位は、したがって正確に解決することができる。我々は、転移9の間に抗生物質によって捕らえられたmRNAのユニークなループされた立体構造を明らかにし、滑りやすいmRNA配列10上で共存した異なる読み取りフレームを解決した。この記事では、リボソーム複合体の調製、ガラススライドの表面機能化、リボソーム複合体の固定化、磁気標識されたDNA定規によるハイブリダイゼーションを含むデュアルルーラーアッセイの詳細について説明します。分子、磁気検出、およびフォーススペクトル分析を行います。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1412px;" width="1411">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Styrene Strip</td>
			<td style="width:239px;">City of Industry</td>
			<td style="width:161px;">MS-861</td>
			<td style="width:795px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:217px;">Glass slides</td>
			<td style="width:239px;">Evaporated Coatings</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>60.0 &#215; 4.0 &#215; 0.3 mm3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A6283-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
			<td style="width:239px;">UCT specialties</td>
			<td style="width:161px;">21400088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mPEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">154-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Biotin-PEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">152-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Epoxy glue</td>
			<td style="width:239px;">Devcon</td>
			<td style="width:161px;">31345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Fusidic Acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">F0756-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Neomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1458009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Viomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1715000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:239px;">invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Magnesium acetate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M5661-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Ammonium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">EDTA</td>
			<td style="width:239px;">GIBCO</td>
			<td style="width:161px;">774750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M6250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tween20</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">GTP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8877-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">PEP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P7127-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Pyruvate Kinase</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1506-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mRNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">133899727</td>
			<td>5&#8242;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3&#8242;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468630</td>
			<td>3&#697;- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">164845370</td>
			<td>3&#697;-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468628</td>
			<td>3&#697;-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">163472705</td>
			<td>3&#697;-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678130</td>
			<td>3&#697;-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678131</td>
			<td>3&#697;-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678132</td>
			<td>3&#697;-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678133</td>
			<td>3&#697;-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Micro Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Hitachi</td>
			<td style="width:161px;">CS150FNX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">VM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Laser</td>
			<td style="width:239px;">Newport</td>
			<td style="width:161px;">TLB-6918-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Function generator</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">DS345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Photo detectors</td>
			<td style="width:239px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:161px;">DET36A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution

リボソーム転位とは、タンパク質合成の中心的なステップである正確に3つのヌクレオチド(nt)によるmRNA上のリボソーム運動を指す。そのメカニズムを調査するには、2 つの重要な技術的要件があります。1つ目は、フレームシフトからの通常の転位を解決できるシングルnt解像度で、その間にリボソームが3nt以外で移動します。2つ目は、mRNAの入口側と出口側の両方を調べ、転移の全体像を解明する能力です。我々は、強制誘発残留磁化分光法(FIRMS)によって得られたDNA-mRNA二重鎖の臨界解離力に基づく二重DNA定規アッセイを報告する。 2-4 pN力分解能を使用すると、デュアルルーラーアッセイは異なる転位ステップを区別するのに十分です。プローブDNに長いリンカーを実装することにより、リボソームの反対側のmRNAに到達できるため、mRNAの位置を両側で決定することができます。したがって、デュアル定規アッセイは、リボソーム転位、および核酸運動全般を調べるのに一意に適している。ループmRNAの立体構造を示し、フレームシフトからの正常な転位を解消した代表的な結果を示す.

図1は、主要成分の検出スキームと写真を示す。磁気検出は、走査方式(図1A)13を用いて原子磁力計によって達成される。サンプルは線形モーターに取付けられる棒の上に置かれる。モーターは磁気シールドの中の原子センサーにサンプルを運び、それから荷を下すために元の場所に戻る。原子磁力計は、サンプルスキ?...

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Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

デュアルDNA定規アッセイは、形成されたDNA-mRNA二重鎖の解離力に依存するリボソーム転位時のmRNA位置を決定するために開発される。単一ヌクレオチド分解能とmRNAの両端に到達する能力を備え、リボソーム転位およびプローブ他の核酸変位に関する機械的洞察を提供できる。

単一ヌクレオチド分解能を持つリボソーム転移のメカニズムを研究するデュアルDNA定規

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

二重DNA定規アッセイは、リボソーム転座の機械学的洞察を提供し、他の核酸変位を探査することができる。当社の二重DNA定規アッセイは、現在のところ、単一ヌクレオチド分解能を有するリボソーム複合体中のmRNAの入口側と出口側の両方を客観的に探査できる唯一の方法です。同様の方法は、DNA結合強度および化学療法薬の選択性を測定するためにも適用される。この方法の視覚的なデモンストレーションは、私たちの技術の利点を直感的に示し、他の研究者がより多くのアプリケーションにそれを開発するのを助ける良い機会です。まず、4ミリメートル×3ミリメートル×2ミリメートルの寸法で中心に立方体を掘削することにより、スチレンストリップでプラスチックサンプルをうまく作ります。次に、エポキシを使用して、長さ約5ミリメートルのビオチンコーティングガラスを底面に接着する。サンプルウェルに1ミリリットルのストレプトアビジン水溶液あたり0.25ミリグラムの20マイクロリットルを加え、室温で40分間インキュベートします。次に、TAM10 バッファーでサンプルを十分に 2 回リンスします。抗生物質を使わずにリボソーム複合体を固定するには、まずサンプルウェルからバッファーを取り出し、0.1マイクロモルMF-PreまたはMF-Postリボソーム複合体の20マイクロリットルをサンプルウェルに加える。37°Cで1時間インキュベートし、TAM10バッファで1回リンスします。リボソーム複合体は現在、mRNA上の5素端ビオチンを介して表面上のストレプトアビジンと結合する。抗生物質を用いた実験では、MF-Pre複合体の9マイクロリットルを4ミリモルネオマイシンの1マイクロリットル、摂氏37度で10分間インキュベートする。その後、チューブ0.6マイクロモルEFG、0.8マイクロモルGTPの0.8マイクロリットル、100ミリモルPEPの0.8マイクロリットル、ミリリットルピルビン酸キナーゼあたり1.3ミリグラムの0.3マイクロリットル、6.43マイクロリットルTAM10バッファー、および5ミリモラットル酸の1マイクロリットルに組み合わせます。摂氏37度で20分間インキュベートします。その後、2つの混合物を組み合わせ、さらに5分間摂氏37度でインキュベートします。同様に、0.2ミリモルビオマイシン、0.4ミリモルハイグロマイシンB、および0.25ミリモルフジジンの濃度を有する他の抗生物質実験を行う。フレームシフトスタディでは、滑りやすいモチーフであるU6Aを含むMFNF-Pre複合体のインキュベーションを繰り返します。フジジン酸とネオマイシンの抗生物質を含む。ハイブリダイゼーションプロセスの完了を確実にするために十分な時間が必要である。また、TAM10 バッファーと実際の 1 モル塩化ナトリウムを使用して、ホモステディシステムを維持することをお勧めします。インキュベーション後、サンプルからバッファーをうまく取り除きます。DNA鎖を1マイクロモルビチン化プローブの20マイクロモルリットルを加え、室温で一晩インキュベートします。朝、形成されたDNA/mRNA二重鎖をTAM10バッファーで一度リンスします。サンプルからバッファーを取り除きます。その後、サンプルウェルに1ミリリットルのストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズあたり0.5ミリグラムの20マイクロリットルを加え、室温で2時間インキュベートします。その後、慎重に試料をホルダーに入れ、遠心分離機に入れ、84回gの表面から5分間自由な磁性粒子を取り除きます。レーザーの電源を入れます。次に、電源ボタンを押します。感度を500ミリボルトに調整し、約2時間待って原子磁力計を温めて安定化させます。原子磁力計を設定するには、計器制御ソフトウェアを実行し、モーター移動モードをノイズに設定し、デフォルトの位置をゼロに設定します。フロントパネルのロックを押します。感度を200ミリボルトに戻します。レーザーの電流と電圧を調整し、最適な信号分解能を得るために適切な共振ピークと信号対雑音レベルを見つけます。フロントパネルのスイープを押します。振幅対幅比が 0.5 を超え、位相値が 5 度未満で幅が 170 ヘルツ未満であることを確認します。別のSR530ロックインアンプの出力をレーザーのフィードバックに差し込み、周波数をロックします。機能発生器ATF20Bを差し込み、ピークに500ミリボルトの方形波を入力し、電流を磁気信号に変換するための基準信号として100ミリヘルツを入力する。次に、関数ジェネレーターを取り外します。モーター移動モードを双方向に設定し、デフォルトの位置を 260 ミリメートルに設定します。温度コントローラの状態を確認し、温度が約37°C、原子センサであることを確認します。空のサンプルホルダの信号を測定するためにサンプルをロードすることなく、プログラムを直接実行することにより、システム全体の安定性を2回確認してください。サンプルを磁化するには、ピンセットを使用してサンプルをホルダーから取り出し、磁化ステージに2分間置きます。その後、サンプルをサンプルホルダーに戻し、遠心分離機を335.4倍gで20分間入れます。非特異的に結合した磁性粒子を取り除きます。次に、ピンセットでサンプルをモーターに積み込みます。プログラムを実行するには、フロントパネルの[ロック]をクリックします。一方、ピンセットを使用して別のサンプルをホルダーにロードし、遠心分離機に入れる。コーティングされたガラス側を遠心分離機の中心に向け、遠心分離を335.4倍のgで4分間開始します。モータがゼロに戻ったら、約5分後にフロントパネルの[保存]をクリックします。ピンセットを慎重に使用して、1つのサンプルをモーターから遠心分離機ホルダーに移します。遠心速度を100rpmまたは同様のステップサイズで増加させることにより、より強い力を加えます。サンプルを遠心分離機と交換します。毎回徐々に力を増やすために交互に処理します。完全な力スペクトルは10〜12のデータポイントの後に得られる。計画された実験がすべて終了したら、機器の電源を切り、電源を入れた後の順序で進みます。サンプルをホルダーから取り出し、洗浄と今後の使用のためにエタノールに浸します。磁気ビーズ汚染の場合は、アセトンでサンプルホルダーをクリーンアップします。このプロトコルでは、リボソーム複合体を、mRNAの5素数端を介して表面に固定化し、5素数側と3素数側の両方をプローブDNA定規のために容易にアクセスできるようにした。5素数側のリンカーが50チミンより長い場合、強い磁気シグナルが検出され、DNA/mRNA二重鎖の形成に成功したことを示す。DNA上のヌクレオチドの数を変化させることにより、三素側と5素数側について、解離力と二重長の相関がそれぞれ達成された。抗生物質がない場合のMF-PreからMF-Postへの正常な転座の結果は、リボソームが両側の3素端末に向かって3ヌクレオチドによって移動したことを示す。MF-PreはPサイトとA部位でvagrant fMet-tRNAとフェニルアラニン-tRNAをそれぞれ運び、MFポストはEサイトとPサイトでfMet-tRNAとフェニルアラニン-tRNAをそれぞれ空いている。しかしながら、フジジン酸とアディオマイシン系抗生物質の両方が存在する場合、リボソームは5素数側では1ヌクレオチドのみで移動し、3素数側では2ヌクレオチドによって移動した。抗生物質を洗い流した後、正常な転座が起こり、5素数側と3素数側の両方からの3つのヌクレオチド運動によって証明された。試料を磁化する場合、コーティングされた表面が近づいて磁石を垂直に残す必要があります。そして、非特異的に結合された磁性粒子を除去することは、データの正確性と品質にとって非常に重要です。我々の技術は、分子生物学で広く遭遇している核酸の分子変位を調査するための高解像度と一般的に適用可能な方法を提供する。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

新規蛍光プローブと形質膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸の単分子超解像イメージング

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

DNA 染色、シアニン色素が消化される制限の酵素とかどうかを決定します。

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

小規模な比色試金の細胞内乳酸と線虫の線虫のピルビン酸

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

校正と単一のヌクレオチドの拡張子と MALDI-TOF 質量分析を用いた DNA 修復アッセイ

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

生体内細胞からのRNA単離に対するリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

ハイスループットプリマゼプロファイリングを用いたDNAプリマゼによるDNA配列認識

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

リボソームタンパク質合成の単一分子蛍光エネルギー転移研究

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

DNA-タンパク質相互作用を研究するためのCD分光法

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...